一種植物乳桿菌植物亞種細菌素與Nisin復(fù)合抑菌劑及其在冷鮮肉中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種植物乳桿菌植物亞種細菌素與Nisin復(fù)合抑菌劑及其在冷鮮肉 中的應(yīng)用，適用于各類食品中致病菌的控制，屬于食品防腐保鮮領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 肉制品不同于其他食品，其自身環(huán)境條件如水分活度、pH、營養(yǎng)成分等是微生物生 長的良好基質(zhì)，因此容易滋生種類繁多和含量較大的微生物，包括沙門氏菌、金黃色葡萄球 菌、單增李斯特菌、大腸桿菌等。我國食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，食源性疾病事件和涉及 人數(shù)最多的是由致病微生物引起的，并且在動物性食品中，以肉及肉制品引起的疾病事件 最多。目前豬肉中控制單增李斯特菌的生長是一個較為棘手的問題，食入單增李斯特菌侵 染的豬肉會導(dǎo)致部分人群感染，尤其孕婦、嬰兒和免疫力低下的人群，在這些被感染的人群 中致死率偏高，約在27%?34%之間。單增李斯特菌是肉制品中廣泛存在的腐敗菌，由于 耐受低溫，故冷藏抑制其生長作用不大。該菌在有氧和無氧條件下都能生長，故真空包裝或 二氧化碳氣調(diào)保藏亦不能抑制該菌生長。此外，PH、氯化鈉、硝酸鹽對其生長的影響也不明 顯〇
[0003] 添加防腐劑是目前食品防腐保鮮的重要方式，并且在防腐保鮮領(lǐng)域，由于化學(xué)合 成防腐劑存在潛在的副作用，對于天然安全的生物防腐劑的研宄更為廣泛。乳酸菌素是某 些乳酸菌在代謝過程中通過核糖體合成機制產(chǎn)生的一類具有抑菌活性的蛋白質(zhì)或多肽，通 常能夠抑制其近緣菌株，產(chǎn)生菌有自身免疫性。它之所以能夠成為天然生物防腐劑的開發(fā) 對象基于以下特點：①其產(chǎn)生菌乳酸菌生長繁殖快，生產(chǎn)周期短，具有工業(yè)化生產(chǎn)前景；② 具有人體蛋白酶生物降解性，不會在人體內(nèi)蓄積，也不會對人體腸道的正常菌群產(chǎn)生影響； ③不同于抗生素會耐藥性，不會誘發(fā)致病微生物對抗生素的抗性；④便于現(xiàn)代基因工程技 術(shù)對細菌素基因進行修飾和克隆。
[0004] 雖然國內(nèi)外研宄者對于天然抑菌物質(zhì)細菌素的篩選在進行不斷地探索研宄，已發(fā) 現(xiàn)了一些對食品腐敗微生物和病原微生物具有廣譜抑菌活性的細菌素，但只有Nisin是世 界上公認(rèn)天然的食品防腐劑，是迄今唯一允許用作食品防腐劑的乳酸菌細菌素，到目前為 止，已在世界約50個國家和地區(qū)得到廣泛應(yīng)用。但是，Nisin的抑菌譜較窄，pH8. 0以上即 失活，只能在酸性食品中發(fā)揮作用。Nisin主要抑制革蘭氏陽性菌，對革蘭氏陰性菌的抑菌 作用不理想，由此限制了Nisin的應(yīng)用。本發(fā)明專利將植物乳桿菌植物亞種細菌素與Nisin 按比例復(fù)合使用，具有良好的抑菌作用，該復(fù)合抑菌劑可應(yīng)用于各類食品中致病菌的控制。
[0005] 目前，國內(nèi)外文獻中有關(guān)于乳酸菌細菌素作為防腐劑在肉制品中應(yīng)用的報道。劉 國榮等研宄表面乳酸菌素pentocin31-l能夠有效抑制冷鮮肉中假單胞菌和潛在致病菌李 斯特氏菌的生長，添加pentocin31-l量為80AU/g時，在保證良好感官特性的前提下，能 夠延長冷鮮肉貨架期至15d;Castellano等研宄發(fā)現(xiàn)LactobacilluscurvatusCRL705可 以作為生物防腐劑使真空包裝的牛肉在2°C的條件下貯存60d不變質(zhì)；RosalindaUrso等 在自然發(fā)酵香腸中篩選到一株沙克乳桿菌Lacticbacteriasakei，其所產(chǎn)細菌素Sakacin P不僅能較好抑制香腸中的腸球菌，而且對香腸的風(fēng)味無不良影響。國內(nèi)專利中有關(guān)乳酸 菌細菌素在肉制品中應(yīng)用的報道。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)申請的"一種產(chǎn)細菌素的米酒乳桿菌菌 株及其用法"，專利申請?zhí)枮椋篊N03132323. 5 ;中國農(nóng)業(yè)大學(xué)申請的"細菌素和超高壓聯(lián)合 防腐保鮮技術(shù)及其應(yīng)用"，專利申請?zhí)枮椋篊N201110141938。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)是中華人民共和國衛(wèi)生部辦公廳于2010年4月22日印發(fā)的《可用于食品的菌 種名單》中明文規(guī)定的菌種之一，且本發(fā)明中植物乳桿菌植物亞種分離自具有益生特性的 傳統(tǒng)發(fā)酵食品一一福建臘肉，其所產(chǎn)具有抗菌活性的代謝產(chǎn)物被認(rèn)為基本安全。因此，植物 乳桿菌植物亞種細菌素與Nisin聯(lián)合作為食品防腐劑安全可靠。雖然國內(nèi)外有關(guān)于乳酸菌 細菌素在肉制品防腐保鮮的報道，但關(guān)于植物乳桿菌植物亞種細菌素與Nisin聯(lián)合應(yīng)用于 肉制品防腐尚未見文獻和專利報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種植物乳桿菌植物亞種細菌素與Nisin復(fù)合抑菌劑及其 在冷鮮肉中的應(yīng)用方法。
[0007] 本發(fā)明復(fù)合抑菌劑中所述細菌素來源為植物乳桿菌植物亞種細菌素和乳酸鏈球 菌素（Nisin購于美國Sigma公司）。植物乳桿菌植物亞種細菌素，是從植物乳桿菌植物亞 種Zhang-LL發(fā)酵液中提取得到，植物乳桿菌植物亞種（Lactobacillusplantarumsubsp. plantarum)Zhang-LL，已于2012年12月4日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心（簡稱CGMCC)，保藏號為：CGMCCNo. 6936。
[0008] 復(fù)合抑菌劑的制備方法：取效價為1280AU/mL植物乳桿菌植物亞種細菌素用無菌 蒸餾水進行二倍梯度稀釋至320AU/mL;Nisin配制成5% (W/V)的工作液，通過二倍連續(xù)梯 度稀釋法結(jié)合其效價為320AU/mL。植物乳桿菌植物亞種細菌素和Nisin按照3 : 1體積比 混合，得到復(fù)合抑菌劑。
[0009] 復(fù)合抑菌劑在冷鮮肉防腐中應(yīng)用方法：活豬、致昏、放血、去頭、剝皮、摘除內(nèi)臟、消 毒、冷卻、分割剔骨、噴灑復(fù)合抑菌劑、包裝。在分割后噴灑效價為320AU/mL復(fù)合抑菌劑，噴 灑量為〇.lmL/cm2,每公斤冷鮮肉需噴灑約10mL抑菌劑，4°C風(fēng)干后保藏。
[0010] 上述的植物乳桿菌植物亞種細菌素與Nisin復(fù)合抑菌劑的制備方法及其在冷鮮 肉中的應(yīng)用屬于本發(fā)明保護范圍。
【附圖說明】
[0011] 植物乳桿菌植物亞種細菌素與Nisin復(fù)合抑菌劑在冷鮮肉防腐中應(yīng)用的工藝流 程圖說明如下：
[0012] (1)活豬：檢驗檢疫合格；⑵致昏：電壓85V，時間3?4s。（3)放血：采用吊掛 方式，時間4min; (4)去頭、剝皮、摘除內(nèi)臟；（5)消毒：脫氫乙酸（0.001% )，5s; (6)冷卻： 0?4°C，10h，風(fēng)速lm/s; (7)分割剔骨；（8)噴灑復(fù)合抑菌劑，效價為320AU/mL，噴灑量為 0?lmL/cm2; (9)包裝：產(chǎn)品置于4°C保藏。
[0013] 植物乳桿菌植物亞種（Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)Zhang-LL分 離篩選自福建農(nóng)貿(mào)市場中的臘肉制品，其產(chǎn)生的細菌素可被人體內(nèi)蛋白酶所降解。本發(fā)明 中乳酸菌素復(fù)合抑菌劑應(yīng)用于冷鮮肉保鮮，其處理手段簡單，細菌素用量少，成本低，適用 于規(guī)?；漉r肉的防腐。
【具體實施方式】
[0014] 下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0015] 下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為體積百分含量。
[0016] 實施例1、培養(yǎng)基體系中植物乳桿菌植物亞種細菌素與Nisin聯(lián)合使用對單增李 斯特菌的抑制作用
[0017] 1、植物乳桿菌植物亞種細菌素與Nisin抑菌活性的測定
[0018] 采用pH吸附-解吸法制備植物乳桿菌植物亞種細菌素的粗提取液，將Nisin配制 成5% (m/V)的工作液。以單核細胞增生李斯特氏菌ATCC54003作為指示菌，采用二倍連續(xù) 梯度稀釋法結(jié)合抑菌試驗測定植物乳桿菌植物亞種細菌素與Nisin的抑菌活性，結(jié)果顯示 植物乳桿菌植物亞種細菌素的抑菌活力為1280AU/mL，Nisin工作液的抑菌活力為320AU/ mL〇
[0019] 2、培養(yǎng)基體系中植物乳桿菌植物亞種細菌素與Nisin聯(lián)合使用對單增李斯特菌 的抑制作用
[0020] 在國標(biāo)GB/T2760-2007要求Nisin的限量0. 5g/kg范圍內(nèi)，用無菌水將植物乳桿 菌植物亞種細菌素和Nisin稀釋為所需濃度（見表1)，向接種量為1 %的10mL單增李斯特 培養(yǎng)液中添加6組不同配比的細菌素抑菌劑，利用比濁法測定儀WBS-100測定單增李斯特 氏菌的生長狀況。
[0021] 由表2單增李斯特氏菌的生長趨勢可得，添加抑菌劑后不同程度地抑制了單 增李斯特菌的生長，并且在抑菌劑抑菌總活力相同，均為32AU時，Z:N(3: 1)組和 Z:N(1: 1)組抑菌劑對單增李斯特氏菌的抑制效果優(yōu)于單獨使用細菌素（Zhang-LL組 和Nisin組），Z:N(3: 1)組細菌素復(fù)合抑菌劑在單增李斯特氏菌的生長的22h內(nèi)完全 抑制其生長，確定Z:N(3: 1)組為細菌素抑菌最佳配比。
[0022] 表1不同濃度細菌素配比
[0023]
【主權(quán)項】
1. 植物乳桿菌植物亞種（Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang_LL CGMCC No. 6936。
2. -種植物乳桿菌植物亞種細菌素Zhang-LL與Nisin復(fù)合抑菌劑的制備方法，其特征 在于：取效價為1280AU/mL植物乳桿菌植物亞種細菌素用無菌蒸餾水進行二倍梯度稀釋至 320AU/mL;Nisin配制成5% (W/V)的工作液，其效價為320AU/mL。植物乳桿菌植物亞種細 菌素和Nisin按照3 : 1體積比混合，得到復(fù)合抑菌劑。
3. -種植物乳桿菌植物亞種細菌素Zhang-LL與Nisin復(fù)合抑菌劑在冷鮮肉中應(yīng)用方 法，其特征在于：活豬、致昏、放血、去頭、剝皮、摘除內(nèi)臟、消毒、冷卻、分割剔骨、噴灑復(fù)合抑 菌劑、包裝。在分割后噴灑效價為320AU/mL復(fù)合抑菌劑，噴灑量為0. lmL/cm2,每公斤冷鮮 肉需噴灑約10mL抑菌劑，4°C風(fēng)干后保藏。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種植物乳桿菌植物亞種細菌素與Nisin復(fù)合抑菌劑及其在冷鮮肉中的應(yīng)用，適用于各類食品中致病菌的控制，屬于食品防腐保鮮領(lǐng)域。本發(fā)明從福建農(nóng)貿(mào)市場的臘肉中篩選得到植物乳桿菌植物亞種(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang-LL(CGMCCNo.6936)。將該菌所產(chǎn)細菌素與Nisin聯(lián)合使用制備復(fù)合抑菌劑，應(yīng)用于冷鮮肉的防腐保鮮中，其抑制單增李斯特菌的效果比單獨使用細菌素效果提高了1000倍，使得冷鮮肉的保藏期延長了13d。該復(fù)合抑菌劑應(yīng)用于冷鮮肉的防腐，其處理手段簡單，細菌素用量少，成本低，適用于規(guī)模化冷鮮肉的防腐保鮮。CGMCC No.693620121204
【IPC分類】C12R1-25, C12N1-20, A01P3-00, A01N63-02, A23B4-20, A01P1-00
【公開號】CN104531561
【申請?zhí)枴緾N201410743209
【發(fā)明人】張紅星, 劉慧 , 白永強, 許宏愿, 段慧霞, 郝艷芳, 謝遠紅, 金君華, 熊利霞, 高秀芝
【申請人】北京農(nóng)學(xué)院, 北京和美科盛生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月9日