一種分離昆蟲(chóng)內(nèi)生細(xì)菌的專(zhuān)用培養(yǎng)基及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種分離昆蟲(chóng)內(nèi)生細(xì)菌的專(zhuān)用培養(yǎng)基及其制 備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物資源是指對(duì)人類(lèi)具有實(shí)際或潛在用途或價(jià)值的遺傳資源、生物體或其部分、 生物群體或生態(tài)系統(tǒng)中任何其他生物組成部分。不斷的拓展和開(kāi)發(fā)生物資源是當(dāng)今社會(huì)發(fā) 展的必然趨勢(shì)和選擇，對(duì)微生物來(lái)源的生物資源開(kāi)發(fā)一直是研宄的熱門(mén)領(lǐng)域，其中昆蟲(chóng)內(nèi) 生源來(lái)源的微生物資源日益得到人們的重視，因?yàn)樽匀唤绮淮嬖跓o(wú)菌動(dòng)物，作為動(dòng)物界群 體的重要組成部分，昆蟲(chóng)種類(lèi)多、分布廣、生態(tài)型豐富，具有巨大的內(nèi)生菌資源有待開(kāi)發(fā)。微 生物蛋白酶資源的開(kāi)發(fā)利用在整個(gè)微生物資源中占有關(guān)鍵的地位，無(wú)論在數(shù)量上和多樣性 組成上，蛋白酶資源都占有主導(dǎo)地位，是主要的工業(yè)酶，占世界市場(chǎng)的65%以上，而昆蟲(chóng)內(nèi) 生菌是昆蟲(chóng)和各類(lèi)微生物經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化形成的一種穩(wěn)定的共生或寄生關(guān)系，所以?xún)?nèi) 生菌產(chǎn)生的各類(lèi)生物活性物質(zhì)對(duì)動(dòng)物往往無(wú)毒或毒性極低，與其他微生物來(lái)源的活性物質(zhì) 相比較，這是非常重要的優(yōu)勢(shì)，但昆蟲(chóng)內(nèi)生菌資源開(kāi)發(fā)利用的關(guān)鍵前提之一仍然是資源菌 株的有效分離和培養(yǎng)，昆蟲(chóng)內(nèi)生環(huán)境的多樣性，決定了分離和培養(yǎng)內(nèi)生菌的培養(yǎng)基也不能 千篇一律，所以不斷創(chuàng)新和開(kāi)發(fā)昆蟲(chóng)內(nèi)生菌資源的培養(yǎng)基，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和實(shí)踐價(jià) 值，是開(kāi)展相關(guān)研宄的關(guān)鍵性基礎(chǔ)工作之一。
[0003] 目前，各類(lèi)文獻(xiàn)報(bào)道的昆蟲(chóng)內(nèi)生細(xì)菌固體平板分離培養(yǎng)基基本上都是借用了現(xiàn)有 的通用細(xì)菌培養(yǎng)基，即牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，其配方如下：
[0004] 牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，瓊脂粉15-20g/L，蒸餾水定容至1 000ml， 自然pH7. 0-7. 2,121°C高壓蒸汽滅菌20min。
[0005] 上述技術(shù)方案中，采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基雖然可以分離出昆蟲(chóng)內(nèi)生細(xì)菌，但存 在的問(wèn)題也較為突出，這些不足集中體現(xiàn)在兩個(gè)方面（1)作為最傳統(tǒng)和常用的細(xì)菌培養(yǎng)基 配方，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的反復(fù)使用，已經(jīng)很難再分離出稀有菌或非常見(jiàn)菌資源，很多時(shí)候無(wú)法達(dá) 到實(shí)驗(yàn)初衷；(2)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基適用于一般細(xì)菌的分離培養(yǎng)，尤其是土壤樣品、活性 污泥和水樣等實(shí)驗(yàn)樣品，對(duì)昆蟲(chóng)內(nèi)生細(xì)菌則并沒(méi)有很好的針對(duì)性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)存在的缺陷，提供一種分離昆蟲(chóng)內(nèi)生細(xì)菌的專(zhuān)用 培養(yǎng)基及其制備方法，解決以下兩個(gè)技術(shù)問(wèn)題：
[0007] (1)創(chuàng)新昆蟲(chóng)內(nèi)生細(xì)菌分離的培養(yǎng)基配方，拓展資源微生物篩選途徑；（2)提高篩 出菌株資源的多樣性，減少和降低不必要的重復(fù)篩選，為稀有種類(lèi)的篩出提供更多可能，豐 富昆蟲(chóng)內(nèi)生菌開(kāi)發(fā)利用理論。
[0008] 其具體技術(shù)方案為：
[0009] 一種分離昆蟲(chóng)內(nèi)生細(xì)菌的專(zhuān)用培養(yǎng)基，其配方具體為：黃粉蟲(chóng)干粉2g，酵母粉lg， 吉蘭糖膠3g，海藻糖0.5g，NaCl 9g，胡蘿卜浸汁100ml，瓊脂粉18g，蒸餾水定容至1 000ml， 自然pH。
[0010] 進(jìn)一步，所述胡蘿卜浸汁l〇〇ml由300g紅色胡蘿卜制備所得。
[0011] -種本發(fā)明所述分離昆蟲(chóng)內(nèi)生細(xì)菌的專(zhuān)用培養(yǎng)基的制備方法，按制備1000ml培 養(yǎng)基計(jì)，包括以下步驟：
[0012]A.制備黃粉蟲(chóng)干粉：稱(chēng)取黃粉蟲(chóng)老熟幼蟲(chóng)適量，50°C烘干12h，用研缽研碎至無(wú)明 顯顆粒，過(guò)200目篩，即得黃粉蟲(chóng)干粉；
[0013]B.制備胡蘿卜浸汁：稱(chēng)取紅色胡蘿卜300g，切成2cm3方塊，用小型粉碎機(jī)粉碎后， 轉(zhuǎn)移至三角瓶，加入蒸餾水200ml，180r/min，室溫震蕩混勾20min，最后用四層紗布過(guò)濾， 濾液再用砂芯過(guò)濾器二次過(guò)濾，即得所需胡蘿卜浸汁，現(xiàn)用現(xiàn)做，置60°C烘箱保溫；
[0014]C.首先稱(chēng)取吉蘭糖膠3g，用蒸餾水800ml緩慢溶解，再依次加入黃粉蟲(chóng)干粉2g，酵 母粉lg，海藻糖〇. 5g，NaCl9g，用蒸餾水定容至900ml，攪拌均勻后轉(zhuǎn)入三角瓶，121°C條件 下高壓蒸汽滅菌20min;當(dāng)冷卻至60°C左右時(shí)，在超凈工作臺(tái)中使用0. 22ym濾膜規(guī)格的針 頭過(guò)濾器加入胡蘿卜浸汁l〇〇ml，同方向輕柔轉(zhuǎn)動(dòng)混勻，即得昆蟲(chóng)內(nèi)生細(xì)分離培養(yǎng)基。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0016] 本發(fā)明技術(shù)通過(guò)不斷的探索、優(yōu)化，摸索出了有效分離昆蟲(chóng)內(nèi)生細(xì)菌的培養(yǎng)基配 方及其制備程序，豐富了昆蟲(chóng)內(nèi)生菌分離篩選的方法和途徑的多樣性，在一定程度上提高 了稀有菌的出菌率，在實(shí)踐中可行性強(qiáng)。
[0017] 在本發(fā)明技術(shù)方案中，將黃粉蟲(chóng)老熟幼蟲(chóng)干粉引入培養(yǎng)基，是基于黃粉蟲(chóng)干品一 般含脂肪30%，蛋白質(zhì)含量更是高達(dá)50%以上，還含有磷、鉀、鐵、鈉、鋁等常量元素和多種 微量元素，動(dòng)物生長(zhǎng)所必需的18種氨基酸，被譽(yù)為被譽(yù)為"蛋白質(zhì)飼料寶庫(kù)"。在培養(yǎng)基中 黃粉蟲(chóng)豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與配方中的酵母粉互為補(bǔ)充，旨在提高對(duì)昆蟲(chóng)內(nèi)生菌生長(zhǎng)需求的廣 譜適應(yīng)性；配方中添加的吉蘭糖膠和海藻糖有刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、保護(hù)弱勢(shì)菌株、降低菌體死亡 率和增強(qiáng)適應(yīng)性的作用，對(duì)盡可能的分離出不同種類(lèi)昆蟲(chóng)內(nèi)生菌，提高菌株的多樣性和生 長(zhǎng)狀況幫助很大。
[0018] 胡蘿卜被譽(yù)為"小人參"，其鮮品浸汁是一種天然的營(yíng)養(yǎng)液，它的添加，是對(duì)培養(yǎng)基 因高溫滅菌而喪失掉的部分營(yíng)養(yǎng)元素如胡蘿卜素、活性多糖、維生素C、維生素E等的有益 補(bǔ)充和平衡。對(duì)保存和提高昆蟲(chóng)內(nèi)生菌代謝的生理活性和存活幾率起著積極作用。
[0019] 因生境滲透壓的變化而導(dǎo)致一些菌群死亡、消失，是各類(lèi)環(huán)境樣品分離、篩選微生 物資源共同面臨的問(wèn)題之一，活體昆蟲(chóng)內(nèi)生菌的生境更是一個(gè)復(fù)雜的體系，所以，昆蟲(chóng)內(nèi)生 菌的分離和培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基滲透壓的調(diào)控尤為重要。因此，培養(yǎng)基中添加了終濃度為 0. 9%氯化鈉成分，旨在與生理鹽水的濃度保持一致，緩沖因生境的變化對(duì)內(nèi)生菌生長(zhǎng)的影 響。
[0020] 本發(fā)明培養(yǎng)基整體上選料精當(dāng)，制備過(guò)程通俗易懂，便于操作，制得的培養(yǎng)基品相 好，既適合細(xì)菌的分離培養(yǎng)，也可用于劃線純化培養(yǎng)。另外，對(duì)其它類(lèi)型動(dòng)物內(nèi)生細(xì)菌的分 離培養(yǎng)也有很好的借鑒意義。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)明。
[0022] 實(shí)施例1昆蟲(chóng)內(nèi)生細(xì)菌分離培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方（1000ml):
[0023] 黃粉蟲(chóng)干粉2g，酵母粉lg(G0961，生工生物工程（上海）有限公司），吉蘭糖膠 3g(EZ0001，上海伊卡生物技術(shù)有限公司），海藻糖0. 5g(TB0966,生工生物工程（上海）有 限公司），胡蘿卜浸汁l〇〇ml(由300g紅色胡蘿卜制備），NaCl9g(分析純，西隴化工），瓊 脂粉16g(01-023,北京奧博星生物技術(shù)有限公司），蒸餾水定容至1 000ml，自然pH。
[0024] 實(shí)施例2培養(yǎng)基的配制過(guò)程：
[0025]A.制備黃粉蟲(chóng)干粉：稱(chēng)取黃粉蟲(chóng)老熟幼蟲(chóng)適量，50°C烘干12h，用研缽研碎至無(wú)明 顯顆粒，過(guò)200目篩，即得黃粉蟲(chóng)干粉。
[0026]B.制備胡蘿卜浸汁：稱(chēng)取紅色胡蘿卜300g，切成2cm3方塊，用小型粉碎機(jī)粉碎后， 轉(zhuǎn)移至三角瓶，加入蒸餾水200ml，180r/min，室溫震蕩混勾20min。最后用四層紗布過(guò)濾， 將濾液用砂芯過(guò)濾器二次過(guò)濾，即得所需胡蘿卜浸汁，現(xiàn)用現(xiàn)做，置60°C烘箱保溫。
[0027]C.首先稱(chēng)取吉蘭糖膠5g，用蒸餾水800ml緩慢溶解，再依次加入黃粉蟲(chóng)干粉2g，酵 母粉lg，海藻糖〇. 5g，NaCl9g，用蒸餾水定容至900ml，攪拌均勻后轉(zhuǎn)入三角瓶，121°C條件 下高壓蒸汽滅菌20min;當(dāng)冷卻至60°C左右時(shí)，在超凈工作臺(tái)中使用0. 22ym濾膜規(guī)格的針 頭過(guò)濾器加入胡蘿卜浸汁l〇〇ml。同方向輕柔轉(zhuǎn)動(dòng)混勻，即得昆蟲(chóng)內(nèi)生菌細(xì)菌分離培養(yǎng)基。
[0028] 實(shí)施例3
[0029] 使用制得的培養(yǎng)基做成平板，用柞蠶Antheraeapernyi腸道勾衆(zhòng)稀釋液進(jìn)行涂板 培養(yǎng)，每份樣品重復(fù)3次，同時(shí)劃線純化具有顯著區(qū)別特征的單菌落，并保種；采用菌落特 征、生理生化指標(biāo)測(cè)定和16SrRNA序列比對(duì)相結(jié)合的方法，對(duì)獲得的典型菌種進(jìn)行了鑒定。 結(jié)果顯示，菌株在所發(fā)明的培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)旺，數(shù)量多，可重復(fù)性強(qiáng)，鑒定出的種類(lèi)豐富，主要 種屬名錄見(jiàn)表1。文獻(xiàn)報(bào)道的柞蠶腸道內(nèi)生細(xì)菌主要隸屬于芽孢桿菌屬Bacillus、葡萄球 菌屬Staphylococcus、腸桿菌屬Enterobacter。因此，通過(guò)本發(fā)明配方分離獲得的內(nèi)生細(xì) 菌種類(lèi)與傳統(tǒng)配方相比，在多樣性上具有明顯優(yōu)勢(shì)。
[0030] 表1本發(fā)明配方分離純化到的柞蠶腸道內(nèi)生細(xì)菌
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種分離昆蟲(chóng)內(nèi)生細(xì)菌的專(zhuān)用培養(yǎng)基，其特征在于，其配方具體為：黃粉蟲(chóng)干粉2g， 酵母粉lg，吉蘭糖膠3g，海藻糖0. 5g，NaCl 9g，胡蘿卜浸汁100ml，瓊脂粉18g，蒸餾水定容 至 1000ml，自然 pH。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離昆蟲(chóng)內(nèi)生細(xì)菌的專(zhuān)用培養(yǎng)基，其特征在于，所述胡蘿卜 浸汁100ml由300g紅色胡蘿卜制備所得。
3. -種權(quán)利要求1所述分離昆蟲(chóng)內(nèi)生細(xì)菌的專(zhuān)用培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，按 制備1000ml培養(yǎng)基計(jì)，包括以下步驟： A. 制備黃粉蟲(chóng)干粉：稱(chēng)取黃粉蟲(chóng)老熟幼蟲(chóng)，50°C烘干12h，用研缽研碎至無(wú)明顯顆粒， 過(guò)200目篩，即得黃粉蟲(chóng)干粉； B. 制備胡蘿卜浸汁：稱(chēng)取紅色胡蘿卜300g，切成2cm3方塊，用小型粉碎機(jī)粉碎后，轉(zhuǎn)移 至三角瓶，加入蒸餾水200ml，180r/min，室溫震蕩混勻20min，最后用四層紗布過(guò)濾，濾液 再用砂芯過(guò)濾器二次過(guò)濾，即得所需胡蘿卜浸汁，現(xiàn)用現(xiàn)做，置60°C烘箱保溫； C. 首先稱(chēng)取吉蘭糖膠3g，用蒸餾水800ml緩慢溶解，再依次加入黃粉蟲(chóng)干粉2g，酵母粉 lg，海藻糖0. 5g，NaCl 9g，用蒸餾水定容至900ml，攪拌均勻后轉(zhuǎn)入三角瓶，121°C條件下高 壓蒸汽滅菌20min ;當(dāng)冷卻至60°C時(shí)，在超凈工作臺(tái)中使用0. 22 y m濾膜規(guī)格的針頭過(guò)濾器 加入胡蘿卜浸汁l〇〇ml，同方向輕柔轉(zhuǎn)動(dòng)混勻，即得昆蟲(chóng)內(nèi)生細(xì)分離培養(yǎng)基。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種分離昆蟲(chóng)內(nèi)生細(xì)菌的專(zhuān)用培養(yǎng)基及其制備方法，該其配方具體為：黃粉蟲(chóng)干粉2g，酵母粉1g，吉蘭糖膠3g，海藻糖0.5g，NaCl9g，胡蘿卜浸汁100ml，瓊脂粉18g，蒸餾水定容至1000ml，自然pH。本發(fā)明培養(yǎng)基整體上選料精當(dāng)，制備過(guò)程通俗易懂，便于操作，制得的培養(yǎng)基品相好，既適合細(xì)菌的分離培養(yǎng)，也可用于劃線純化培養(yǎng)。
【IPC分類(lèi)】C12R1-01, C12R1-385, C12R1-085, C12N1-20
【公開(kāi)號(hào)】CN104531556
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410725619
【發(fā)明人】孫會(huì)忠, 宋月芹, 王小東, 董鈞鋒, 糾敏
【申請(qǐng)人】河南科技大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年11月28日