一種滅螺細(xì)菌及其制備生物滅螺劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種微生物，尤其涉及一種滅螺細(xì)菌及其制備生物滅螺劑的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 釘螺作為血吸蟲唯一的中間宿主，其繁衍和分布與血吸蟲病的流行傳播密切相 關(guān)，所以抑螺滅螺被認(rèn)為是阻止血吸蟲病傳播的重要途徑。目前主要的滅螺劑是化學(xué)藥物 類，這類藥物容易對環(huán)境造成不可逆破壞。近年來植物內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)得到廣泛的關(guān)注 和研究，國內(nèi)外學(xué)者經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)植物體內(nèi)存在大量的微生物，這些微生物在動(dòng)物的生長、 發(fā)育、健康等方面都起到重要作用，因此，本發(fā)明將研究的方向?qū)?zhǔn)了植物內(nèi)的微生物群 落，希望能找到一種選擇性強(qiáng)、對環(huán)境影響較小的生物滅螺劑，以替代傳統(tǒng)化學(xué)滅螺劑，保 護(hù)環(huán)境。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的就在于提供一種解決上述問題，選擇性強(qiáng)、對環(huán)境影響較小的滅螺 細(xì)菌及其制備生物滅螺劑的方法。
[0004] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種滅螺細(xì)菌，分類命名為 EnterobactercloacaeB2,所述滅螺細(xì)菌的生物保藏號為CCTCCM2014103,保藏單位為 中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢大學(xué)，保藏日期為2014年3月26日；
[0005] -種構(gòu)建CCTCCM2014103的方法，所述方法包括以下步驟：
[0006] a.培養(yǎng)基的制備：
[0007] 1)YEB液體培養(yǎng)基：牛肉浸膏為5.0g/L，酵母膏為1.0g/L，蛋白胨為5.0g/L， MgS04 ? 7H20 為 4g/L，蔗糖為 5.Og/L，pH7. 0 ?7. 5 ;
[0008] 2)YEB固體培養(yǎng)基：將上述YEB液體培養(yǎng)基中加入15g/L的瓊脂；
[0009] b?進(jìn)行篩選：
[0010] 1)在無菌條件下，取新鮮柏樹枝葉，用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精浸泡1分鐘，0. 1% 升汞浸泡12分鐘，無菌生理鹽水沖洗3遍后，將柏樹枝葉研磨，獲得組織碎末；
[0011] 2)將上一步驟的組織碎末接種到100mL的YEB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12?16 小時(shí)，培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為180rpm，獲得培養(yǎng)液；
[0012] 3)按體積計(jì)，將上一步驟的培養(yǎng)液用無菌生理鹽水依次稀釋為10'10'KT3、 1〇-4、1〇_5、1〇- 6和10'獲得稀釋液；
[0013] 4)將上一步驟的稀釋液涂于YEB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)12?16小時(shí)，挑取單菌 落進(jìn)行純化，即獲得所述滅螺細(xì)菌CCTCCM2014103;
[0014] c.獲取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并檢測；
[0015] 作為優(yōu)選，步驟c中，將上述純化后的滅螺細(xì)菌CCTCCM2014103接種到Y(jié)EB固體 培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)12?16小時(shí)，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR，所述菌落PCR的引物為細(xì)菌 16SrRNA通用引物27F和R518,所述引物的序列為：
[0016]SEQNO. 2 ：27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
[0017]SEQNO. 3 ：R518：ATTACCGCGGCTGCTGG；
[0018] 所述菌落PCR的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性3分鐘，94°C變性30秒，55 °C退火30秒， 72°C延伸1分鐘，循環(huán)30次，72°C繼續(xù)延伸7分鐘，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0019] 一種滅螺細(xì)菌制備生物滅螺劑的方法，
[0020] 1)滅螺劑的制備
[0021] 將滅螺細(xì)菌CCTCCM2014103接種于100mL的YEB液體培養(yǎng)基中，37°C下培養(yǎng)24 小時(shí)，培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為180rpm，得到種子液，將lmL種子液轉(zhuǎn)移到100mL的YEB液體培養(yǎng)基中， 37°C培養(yǎng)12?16小時(shí)，培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為180rpm，獲得發(fā)酵液，即為生物滅螺劑；
[0022] 2)滅螺劑稀釋液的配制
[0023] 將滅螺劑用去氯水配制成體積分?jǐn)?shù)為10%的溶液，即為滅螺劑稀釋液。
[0024] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：該滅螺細(xì)菌CCTCCM2014103是從柏樹枝 葉中篩選獲得的，能夠作為生物滅螺劑快速有效地殺滅釘螺，可直接作為生物滅螺劑使用， 用該滅螺細(xì)菌CCTCCM2014103制備的生物滅螺劑與傳統(tǒng)化學(xué)滅螺劑相比，制備方法簡單， 成本低，對環(huán)境友好。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面將對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0026] 實(shí)施例：一種滅螺細(xì)菌，Enterobactercloacae,B2,所述滅螺細(xì)菌的生物保藏號 為CCTCCM2014103,為陰溝腸桿菌。
[0027] 本發(fā)明的滅螺細(xì)菌CCTCCM2014103是從柏樹枝葉中篩選獲得的，其生物學(xué)特征 如下：
[0028] (1)形態(tài)學(xué)特征：該細(xì)菌革蘭氏染色為陰性，在光學(xué)顯微鏡16X100油鏡下觀察 該細(xì)菌呈粗短桿狀。
[0029] (2)培養(yǎng)特征：在YEB固體培養(yǎng)基中生長良好，菌落圓潤，初期呈白色半透明，后期 呈淡黃色，菌落大而濕潤呈黏液狀。
[0030] 所述滅螺細(xì)菌CCTCCM2014103的16SrRNA序列如SEQIDNO. 1所示，其中所述 16srRNA序列有462個(gè)堿基，將序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 該 16srRNA序列與陰溝腸桿菌S9(Enterobactercloacae，S9)的 16srRNA序列（GenBank 登錄號：HG421017. 1)同源性為99%，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和培養(yǎng)特征鑒定該滅螺細(xì)菌CCTCCM 2014103 為陰溝腸桿菌（Enterobactercloacae)。
[0031] 滅螺細(xì)菌CCTCCM2014103菌株的篩選：
[0032] 1、培養(yǎng)基的配制：
[0033] 1)YEB液體培養(yǎng)基：牛肉浸膏為5.0g/L，酵母膏為l.Og/L，蛋白胨為5.0g/L， MgS04 ? 7H20 為 4g/L，蔗糖為 5. 0g/L，pH7. 0 ?7. 5 ;
[0034] 2)YEB固體培養(yǎng)基：將上述YEB液體培養(yǎng)基中加入15g/L的瓊脂。
[0035] 2、篩選步驟：
[0036] 1)在無菌條件下，取新鮮柏樹枝葉，用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精浸泡1分鐘，0. 1% 升汞浸泡12分鐘，無菌生理鹽水沖洗3遍后，將柏樹枝葉研磨，獲得組織碎末；
[0037] 2)將步驟1)的組織碎末接種到lOOmL的YEB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12?16小 時(shí)，培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為180rpm，獲得培養(yǎng)液；
[0038] 3)按體積計(jì)，將步驟2)的培養(yǎng)液用無菌生理鹽水依次稀釋為10'KT2、10'10' 10'KT6和1(T7,獲得稀釋液；
[0039] 4)將步驟3)的稀釋液涂于YEB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)12?16小時(shí)，挑取單菌 落進(jìn)行純化，即獲得所述滅螺細(xì)菌CCTCCM2014103。
[0040] 3、獲取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并檢測：
[0041] 將上述純化后的滅螺細(xì)菌CCTCCM2014103接種到Y(jié)EB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng) 12?16小時(shí)，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR，所述菌落PCR的引物為細(xì)菌16SrRNA通用引物27F 和R518,所述引物的序列為：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種滅螺細(xì)菌，分類命名為陰溝腸桿菌Enterobacter cloacae B2,所述滅螺細(xì)菌的 生物保藏號為CCTCC M 2014103,保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武 漢大學(xué)，保藏日期為2014年3月26日。
2. -種構(gòu)建CCTCC M 2014103的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： a. 培養(yǎng)基的制備： 1. YEB液體培養(yǎng)基：牛肉浸膏為5. Og/L，酵母膏為1. Og/L，蛋白胨為5. Og/L， MgS04 ? 7H20 為 4g/L，蔗糖為 5. 0g/L，pH7. 0 ?7. 5 ; 2. YEB固體培養(yǎng)基：將上述YEB液體培養(yǎng)基中加入15g/L的瓊脂； b.進(jìn)行篩選： 1) 在無菌條件下，取新鮮柏樹枝葉，用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精浸泡1分鐘，0. 1%升汞 浸泡12分鐘，無菌生理鹽水沖洗3遍后，將柏樹枝葉研磨，獲得組織碎末； 2) 將上一步驟的組織碎末接種到100mL的YEB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12?16小時(shí)， 培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為180rpm，獲得培養(yǎng)液； 3) 按體積計(jì)，將上一步驟的培養(yǎng)液用無菌生理鹽水依次稀釋為10'10'10'KT4、 10'KT6和1(T 7,獲得稀釋液； 4)將上一步驟的稀釋液涂于YEB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)12?16小時(shí)，挑取單菌落進(jìn) 行純化，即獲得所述滅螺細(xì)菌CCTCC M 2014103 ; c. 獲取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種構(gòu)建CCTCC M 2014103的方法，其特征在于：步驟c中，將 上述純化后的滅螺細(xì)菌CCTCC M 2014103接種到Y(jié)EB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)12?16小 時(shí)，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR，所述菌落PCR的引物為細(xì)菌16SrRNA通用引物27F和R518， 所述引物的序列為： SEQ NO. 2 ：27F ：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG SEQ NO.3 ：R518 ：ATTACCGCGGCTGCTGG ； 所述菌落PCR的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性3分鐘，94°C變性30秒，55 °C退火30秒，72 °C 延伸1分鐘，循環(huán)30次，72 °C繼續(xù)延伸7分鐘，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
4. 一種滅螺細(xì)菌制備生物滅螺劑的方法，其特征在于： 1) 滅螺劑的制備 將滅螺細(xì)菌CCTCC M 2014103接種于100mL的YEB液體培養(yǎng)基中，37°C下培養(yǎng)24小時(shí)， 培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為180rpm，得到種子液，將lmL種子液轉(zhuǎn)移到100mL的YEB液體培養(yǎng)基中，37°C 培養(yǎng)12?16小時(shí)，培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為180rpm，獲得發(fā)酵液，即為生物滅螺劑； 2) 滅螺劑稀釋液的配制 將滅螺劑用去氯水配制成體積分?jǐn)?shù)為10%的溶液，即為滅螺劑稀釋液。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種滅螺細(xì)菌及其制備生物滅螺劑的方法，所述滅螺細(xì)菌Enterobacter cloacae，B2，其生物保藏號為CCTCC M 2014103，該滅螺細(xì)菌CCTCC M 2014103為陰溝腸桿菌，是從柏樹枝葉中篩選獲得的，能夠快速有效地殺滅釘螺。與現(xiàn)有微生物相比較，本發(fā)明提供了一種可以殺滅釘螺的細(xì)菌，可以直接作為生物滅螺劑使用，用該滅螺細(xì)菌CCTCC M 2014103制備的生物滅螺劑與傳統(tǒng)化學(xué)滅螺劑相比，制備方法簡單，成本低，對環(huán)境友好。CCTCC No:M201410320140326
【IPC分類】C12N1-20, C12R1-01, A01P9-00, A01N63-00
【公開號】CN104531547
【申請?zhí)枴緾N201410477758
【發(fā)明人】張倩, 孫啟祥, 袁藝, 丁洲
【申請人】中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年9月17日