一種檸檬酸發(fā)酵種子罐培養(yǎng)工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檸檬酸發(fā)酵領(lǐng)域，涉及一種檸檬酸發(fā)酵種子罐培養(yǎng)工藝。
【背景技術(shù)】
[0002] 檸檬酸（Citric acid)又名枸櫞酸，學(xué)名2-羥基丙烷-1,2, 3-三羧酸，分子式 C6H8O7(無水物），為白色顆粒狀或白色結(jié)晶粉末，相對密度為1. 6550,無臭，具有令人愉快 的強(qiáng)烈的酸味，入口爽快，無后酸味，安全無毒，被廣泛用作食品和飲料的酸味劑，全球范圍 內(nèi)檸檬酸的生產(chǎn)主要通過產(chǎn)檸檬酸的黑曲霉發(fā)酵玉米、瓜干、木薯等原料來生產(chǎn)檸檬酸，其 中以玉米作為原料的居多，而發(fā)酵過程一般分為種子罐培育過程和發(fā)酵罐發(fā)酵兩部分，其 中尤以前期的種子罐培養(yǎng)更為重要，但是以玉米為原料的檸檬酸發(fā)酵種子罐培養(yǎng)過程中， 存在部分孢子發(fā)芽較早，料液PH下降，最終抑制其他孢子正常萌發(fā)，種子罐中出現(xiàn)菌種極 不均勻的狀態(tài)，這樣會導(dǎo)致種子罐中菌種生長不理想，如果以這樣的菌種接入發(fā)酵罐，極易 導(dǎo)致發(fā)酵生長不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致產(chǎn)能下降嚴(yán)重。
[0003] 現(xiàn)有解決方法一般以優(yōu)化菌種為主要技術(shù)手段，其調(diào)整周期長，其菌種的優(yōu)化需 要多種條件配合，一般在短時(shí)間內(nèi)難以達(dá)到很好的想效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對現(xiàn)有檸檬酸發(fā)酵種子罐培養(yǎng)遇到的諸多技術(shù)瓶頸，提供了一種檸檬酸 發(fā)酵種子罐培養(yǎng)工藝，其特點(diǎn)是在檸檬酸發(fā)酵種子罐培養(yǎng)中，不同培養(yǎng)階段控制不同的培 養(yǎng)溫度、罐壓、通風(fēng)比、攪拌速率，達(dá)到理想的培養(yǎng)效果；本發(fā)明根據(jù)菌種不同生長階段的特 性以及生長需要，調(diào)控培養(yǎng)溫度、罐壓、通風(fēng)比、攪拌速率，以達(dá)到最優(yōu)的培養(yǎng)效果。采用本 發(fā)明的工藝后，不僅能提高檸檬酸發(fā)酵種子培養(yǎng)效果，提高發(fā)酵穩(wěn)定性，而且能加快發(fā)酵生 產(chǎn)強(qiáng)度、提高發(fā)酵糖酸轉(zhuǎn)化率和設(shè)備利用率，進(jìn)而提高了企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，提升了企業(yè)的競 爭力。
[0005] 本發(fā)明僅對種子罐培育階段進(jìn)行了改進(jìn)，所采用的具體技術(shù)方案如下：其具體步 驟為：
[0006] (1)將玉米液化液打入發(fā)酵罐中，添加氮源、飲用水調(diào)節(jié)N含量與總糖濃度，制備 朽1檬酸發(fā)酵種子罐培養(yǎng)基；
[0007] (2)制備黑曲霉孢子懸浮液，按照每毫升種子液中接入70-90萬個(gè)孢子的比例，通 過血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算出所需孢子懸浮液的體積，通過火焰圈法將孢子懸浮液接入種子 罐中培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，檸檬酸發(fā)酵種子罐培養(yǎng)過程按照培養(yǎng)時(shí)間分為4個(gè)階段：培養(yǎng)0-12h 階段；培養(yǎng)12_16h階段；培養(yǎng)16-24h階段；培養(yǎng)24h至培養(yǎng)結(jié)束；
[0008] 其中培養(yǎng)0-12h階段，控制培養(yǎng)溫度：28-35 °C ;罐壓：0.05-0. IOMPa;通風(fēng)比V/ V · min :0· 05-0. 08 ;攪拌速率：50-60rpm ;
[0009] 培養(yǎng)12_16h階段，控制培養(yǎng)溫度：調(diào)節(jié)降溫系統(tǒng)，通過菌種生長產(chǎn)生的熱量 將罐溫升溫至35-39 °C ;罐壓：0. 08-0. IOMPa ;通風(fēng)比V/V · min :0. 12-0. 14,攪拌速率： 80-100rpm ；
[0010] 培養(yǎng)16-24h階段，控制培養(yǎng)溫度：35-39 °C ;罐壓：0. 10-0. 12MPa ;通風(fēng)比V/ V · min :0· 20-0. 22 ;攪拌速率：80-100rpm ;
[0011] 培養(yǎng)24h至培養(yǎng)結(jié)束階段，控制培養(yǎng)溫度：35-39°C ;罐壓：0. 10-0. 12MPa ;通風(fēng)比 V/V · min :0· 26-0. 28 ;攪拌速率：80-100rrpm。
[0012] 其中，之所以控制培養(yǎng)〇_12h階段的上述參數(shù)，主要原因在于其屬于孢子萌發(fā)階 段，28-35?即能夠有效限制活力旺盛的孢子過快的萌發(fā)，又不影響活力較弱的孢子萌發(fā)， 從而有效地將此階段的培養(yǎng)基pH值保持在4. 5以上，當(dāng)培養(yǎng)基pH值低于4. 5時(shí)，就會對孢 子萌發(fā)產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用故而控制上述溫度范圍；此外，孢子萌發(fā)階段需氧量比較低，所 以要求的罐壓、通風(fēng)比、攪拌速率都比較低，以維持萌發(fā)階段的需要為主；
[0013] 而在12_16h階段屬于菌絲球形成階段，此時(shí)孢子發(fā)芽后逐漸成球，此生長過程產(chǎn) 生熱量使得罐溫逐漸升高，因此通過控制溫度維持在35-39?是菌絲球的最佳生長溫度范 圍，而由于菌絲球的生長菌體的需氧量也逐漸提高，故而較之上一階段提高了通風(fēng)比和攪 拌速率以增加氧氣的供給量；
[0014] 培養(yǎng)16_24h階段屬于菌體的快速生長階段，菌體在此階段生長代謝旺盛，呼吸作 用加快，其最適生長溫度與上一階段相同均在35-39?范圍內(nèi)，但是由于其營養(yǎng)物質(zhì)消耗 快，菌體需氧量大，故而在上一階段的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高了通風(fēng)比以增加氧氣的供給量，但 是此時(shí)產(chǎn)酸量較低不能過度提高通風(fēng)比，防止菌體生長與產(chǎn)酸不能同步增長；
[0015] 培養(yǎng)24h至培養(yǎng)結(jié)束階段屬于菌體成熟產(chǎn)酸階段，菌體在此階段生長與產(chǎn)酸代謝 旺盛，檸檬酸產(chǎn)量較上一階段大大提高，菌體的呼吸作用旺盛，營養(yǎng)物質(zhì)消耗快，菌體需氧 量最大，故而還需要進(jìn)一步的提高通風(fēng)比，以保證產(chǎn)酸的需氧量；
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的最主要特征就是對種子罐培養(yǎng)過程進(jìn)行了細(xì)化，并對 細(xì)化后的工藝參數(shù)進(jìn)行了重新的調(diào)整，較之現(xiàn)有技術(shù)有著更好的效果，經(jīng)過上述細(xì)化后發(fā) 明人通過對菌體的生長的趨勢研宄以及相應(yīng)產(chǎn)酸量的影響，將細(xì)化后的每個(gè)培養(yǎng)段工藝參 數(shù)進(jìn)行了培養(yǎng)，更能夠適應(yīng)菌體的需要，較之現(xiàn)有技術(shù)中種子罐培養(yǎng)條件一成不變的情況， 可以給菌體提供更好的生長條件，提高了菌體的轉(zhuǎn)化和存活率，且產(chǎn)酸效率大大提高。
[0017] 其中步驟（1)中玉米液化液的總糖濃度為18. 00-24. 00g/100mL ;之后經(jīng)過添加 氮源、飲用水調(diào)節(jié)N含量與總糖濃度后所獲得的檸檬酸發(fā)酵種子罐培養(yǎng)基中總糖濃度為 8.00-12. 00g/100mL。
[0018] 上述技術(shù)方案中，由于無機(jī)氮源可以被菌體快速吸收利用，而且價(jià)格相對便宜，所 以本發(fā)明氮源采用硫酸銨或尿素或碳銨，N源的加入量為培養(yǎng)基總質(zhì)量的0. 04-0. 08%，總 糖為8. 00-12. 00g/100mL，如果總糖過低，則培養(yǎng)基不能為菌種生長提供足夠的C源；如果 總糖過高，則抑制孢子萌發(fā)和菌體生長。
[0019] 步驟（2)中檸檬酸發(fā)酵種子罐總培養(yǎng)時(shí)間在25-32h。
[0020] 步驟（2)中培養(yǎng)基菌球濃度大于400000個(gè)/ml ;這是由于在現(xiàn)有培養(yǎng)條件下黑曲 霉孢子的萌發(fā)率在60%左右，而為了達(dá)到最佳的培養(yǎng)效果，必須保證菌球濃度在400000個(gè) /ml以上，而為了保證這一菌球濃度，則在接入時(shí)必須控制接入量一般為每毫升種子液中接 入70-90萬個(gè)孢子。
[0021] 上述的方法主要針對的是以黑曲霉為生產(chǎn)菌株的工藝，其中優(yōu)選采用黑曲霉 C〇-827等，其接入量一般為每_升種子液中接入70-90萬個(gè)孢子。
[0022] 經(jīng)過上述改進(jìn)工藝獲得的種子罐菌種可以直接應(yīng)用與后步的發(fā)酵工藝中，例如將 過濾玉米液化清液和玉米液化液混合制備發(fā)酵培養(yǎng)基，打入發(fā)酵罐中消毒后，移入種子罐 培養(yǎng)合格的菌種開始檸檬酸發(fā)酵，種子液體積占總發(fā)酵液體積的12 %，控制發(fā)酵控制參數(shù) 在合理范圍內(nèi)至發(fā)酵終了。但是上述步驟均可以采用現(xiàn)有技術(shù)完成，發(fā)明人在此不再贅述。
[0023] 綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人對種子罐培養(yǎng)過程進(jìn)行了細(xì)化，并對細(xì)化后的工藝參 數(shù)，特別是培養(yǎng)溫度、罐壓、通風(fēng)比、攪拌速率分段控制，有效地縮短了不同孢子之間萌發(fā)速 率的差距，保證在種子培養(yǎng)的每個(gè)階段有合適的PH值、溫度與溶氧，有效地縮小了菌種之 間的差異，增強(qiáng)了檸檬酸發(fā)酵種子罐培養(yǎng)的穩(wěn)定性，從而保證檸檬酸發(fā)酵持續(xù)穩(wěn)定高效進(jìn) 行，提高糖酸轉(zhuǎn)化率與發(fā)酵效率率，從而降低發(fā)酵成本。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面的理解本發(fā) 明，但不以任何方式限制本發(fā)明，其中發(fā)酵罐發(fā)酵時(shí)過濾玉米液化清液與玉米液化液混合 比例等參數(shù)均采用現(xiàn)有常規(guī)檸檬酸發(fā)酵過程中的參數(shù)，其他未標(biāo)明的發(fā)酵罐發(fā)酵階段的參 數(shù)也均參考現(xiàn)有技術(shù)。下述實(shí)施例中所采用的黑曲霉均為黑曲霉Co-827。
[0025] 實(shí)施例1
[0026] 一種檸檬酸發(fā)酵種子罐培養(yǎng)工藝，其具體步驟為：
[0027] (1)將總糖為20. 50g/100mL玉米液化液打入種子罐中，同時(shí)添加飲用水和占 培養(yǎng)基總質(zhì)量〇. 04%的N源，升溫至121°C消毒30分鐘，降溫至29. 5°C后，檢測總糖為 8. 50g/100mL ;制備黑曲霉孢子懸浮液，按照每毫升種子液中接入79萬個(gè)孢子的比例，通過 血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算出所需孢子懸浮液的體積，通過火焰圈法將孢子懸浮液接入種子罐 中培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；
[0028] (2)檸檬酸發(fā)酵種子罐培養(yǎng)的0-12h階段，控制培養(yǎng)溫度：29. 5-33. 5°C ;罐壓： 0· 06-0. 08MPa ;通風(fēng)比：0· 06-0. 07(V/V · min);攪拌速率：55-57rpm。
[0029] (3)檸檬酸發(fā)酵種子罐培養(yǎng)的12_16h階段，控制培養(yǎng)溫度：調(diào)節(jié)降溫系統(tǒng)，通過 菌種生長產(chǎn)生的熱量將罐溫升溫至35. 5°C ;罐壓：0. 08-0. 09MPa ;通風(fēng)比：0. 12-0. 13(V/ V · min)，攬拌速率：80_90rpm ;
[0030] (4)檸檬酸發(fā)酵種子罐培養(yǎng)的16-24h階段，控制培養(yǎng)溫度：36. 0-38. 5°C ;罐壓： 0· 11-0. 12MPa ;通風(fēng)比：0· 21-0. 22(V/V · min);攪拌速率：85-95rpm。
[0031] (5)檸檬酸發(fā)酵種子罐培養(yǎng)的24-29h階段，控制培養(yǎng)溫度：35. 0-39. (TC ;罐壓： 0· 10-0. 12MPa ;通風(fēng)比：0· 27-0. 28(V/V · min);攪拌速率：90-100rpm。
[0032] (6)將過濾玉米液化清液與玉米液化液混合后打入發(fā)酵罐中，開啟攪拌使培養(yǎng)基 混合均勻，升溫至90°C消毒30分鐘，然后降溫至35. 8°C ;
[0033] (7)將培養(yǎng)好的種子液移入發(fā)酵罐中，開始發(fā)酵，種子液體積占總發(fā)酵液體積的 12%，發(fā)酵液中菌球濃度達(dá)到46000個(gè)/mL，通風(fēng)發(fā)酵至發(fā)酵終了；
[0034] 在此條件下，發(fā)酵55h，產(chǎn)酸18. 93%，轉(zhuǎn)化率101. 12%，發(fā)酵指數(shù)為3. 44g/L · h。
[0035] 實(shí)施例2
[0036] 一種檸檬酸發(fā)酵種子罐培養(yǎng)工藝，其具體步驟為：
[0037] (1)將總糖為23. 50g/100mL玉米液化液打入種子罐中，同時(shí)添加飲用水和占 培養(yǎng)基總質(zhì)量0. 07%的N源，升溫至121°C消毒30分鐘，降溫至28. 5°C后，檢測總糖為 11. 80g/100mL ;制備黑曲霉孢子懸浮液，按照每毫升種子液中接入83萬個(gè)孢子的比例，通 過血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算出所需孢子懸浮液的體積，通過火焰圈法將孢子懸浮液接入種子 罐中培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；
[0038] (2)檸檬酸發(fā)酵種子罐培養(yǎng)的0-12h階段，控制培養(yǎng)溫度：28. 5-34. 5°C ;罐壓： 0· 06-0. 095MPa ;通風(fēng)比：0· 07-0. 08 (V/V · min);攪拌速率：53-55rpm ;
[0039] (3)檸檬酸發(fā)酵種子罐培養(yǎng)的12_16h階段，控制培養(yǎng)溫度：調(diào)節(jié)降溫系統(tǒng)，通過 菌種生長產(chǎn)生的熱量將罐溫升溫至35. 8°C ;罐壓：0. 08-0. 09MPa ;通風(fēng)比：0. 13-0. 14(V/ V · min)，攪拌速率：82_92rpm ;
[0040] (4)檸檬酸發(fā)酵種子罐培養(yǎng)的16-24h階段，控制培養(yǎng)溫度：35. 8-38. 5°C ;罐壓： 0· 10-0. 12MPa ;通風(fēng)比：0· 21-0. 22(V/V · min);攪拌速率：85-95rpm ;
[0041] (5)檸檬酸發(fā)酵種子罐培養(yǎng)的24-30h階段，控制培養(yǎng)溫度：36. 0-39. (TC ;罐壓： 0· 11-0. 12MPa ;通風(fēng)比：0· 27-0. 28(V/V · min);攪拌速率：85-95rpm ;
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