專(zhuān)利名稱(chēng)：一種細(xì)菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基(pya)的制作方法
1.名稱(chēng) 細(xì)菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基(PYA)。
2.技術(shù)領(lǐng)域 應(yīng)用研究。
3.現(xiàn)有技術(shù) 新研制的細(xì)菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基PYA不同于中國(guó)藥典2000年版收載的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，亦不同于USP 26版，BP2002版收載的大豆-胰酪胨瓊脂培養(yǎng)基，國(guó)內(nèi)首創(chuàng)。
4.發(fā)明目的 擬載入中國(guó)藥典，作為微生物限度檢查方法中細(xì)菌計(jì)數(shù)的專(zhuān)用培養(yǎng)基。
5.技術(shù)方案首先通過(guò)4株菌對(duì)中國(guó)藥典的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、美國(guó)藥典的大豆胰酪胨瓊脂培養(yǎng)基、真菌細(xì)菌培養(yǎng)基和PYA培養(yǎng)基進(jìn)行生長(zhǎng)試驗(yàn)初篩，發(fā)現(xiàn)PYA培養(yǎng)基生長(zhǎng)的菌落數(shù)和菌落直徑比營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的菌落數(shù)多，菌落直徑大。然后針對(duì)PYA培養(yǎng)基的組分及配比中的問(wèn)題進(jìn)行了一系列的試驗(yàn)研究和優(yōu)化，添加了微量元素和維生素，使PYA培養(yǎng)基促生長(zhǎng)的特性得以展現(xiàn)。并對(duì)本培養(yǎng)基擴(kuò)大菌株試驗(yàn)，再次與營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、大豆胰酪胨瓊脂培養(yǎng)基對(duì)比試驗(yàn)，證明了本培養(yǎng)基優(yōu)于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，與國(guó)產(chǎn)大豆胰酪胨瓊脂培養(yǎng)基質(zhì)量接近。最后，通過(guò)20批樣品初步考察，結(jié)果證明本培養(yǎng)基更適合細(xì)菌生長(zhǎng)，能提高細(xì)菌檢出率。
6.優(yōu)點(diǎn)和效果6.1與藥典營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基比較，促生長(zhǎng)性能增強(qiáng) 該培養(yǎng)基更適合細(xì)菌生長(zhǎng)。通過(guò)大量生長(zhǎng)性能測(cè)試，24小時(shí)內(nèi)細(xì)菌數(shù)和菌落直徑多于藥典培養(yǎng)基，與國(guó)產(chǎn)USP大豆—胰酪胨瓊脂培養(yǎng)基的質(zhì)量接近。這說(shuō)明本研究成果具有較高的實(shí)用價(jià)值。
6.2與藥典營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基比較，對(duì)半數(shù)樣品提高細(xì)菌檢出率，大大增加了藥品的安全性 通過(guò)20批樣品的初步考察結(jié)果說(shuō)明，PYA培養(yǎng)基在相同條件下除去20％批次細(xì)菌數(shù)增幅不大外，對(duì)半數(shù)樣品不同程度地提高細(xì)菌檢出率17％以上，優(yōu)于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。
營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基主要成分為蛋白胨和牛肉浸出粉，營(yíng)養(yǎng)成分較單一。PYA培養(yǎng)基中除主要成分蛋白胨對(duì)微生物生長(zhǎng)有明顯影響外，還增加了酵母浸出粉、鉀、鎂、磷、錳、鋅等微量元素和維生素，這些是微生物生長(zhǎng)不可或缺的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。
6.3精心設(shè)計(jì)，創(chuàng)新組方，保證質(zhì)量 該處方具有適合細(xì)菌生長(zhǎng)的主要營(yíng)養(yǎng)組分，同時(shí)添加了微量元素和維生素。我們沒(méi)有墨守成規(guī)，而是科學(xué)組方，合理添加，充分發(fā)揮了激活酶的活性，促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。為保證產(chǎn)品質(zhì)量，在藥典微生物限度檢查法中首次建立了培養(yǎng)基的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。毫無(wú)疑問(wèn)，它在保證檢驗(yàn)方法科學(xué)、準(zhǔn)確和藥品微生物質(zhì)量方面將發(fā)揮重要作用。
6.4原料來(lái)源 不靠進(jìn)口，成本比英、歐、美、日藥典微生物限度檢查用大豆—胰酪胨培養(yǎng)基低1/4。
7實(shí)施例7.1培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)菌株來(lái)源枯草桿菌[CMCC(B)63501]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、藤黃微球菌[CMCC(B)28001]、大腸桿菌[CMCC(B)44102]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、表皮葡萄球菌[CMCC(B)26069]、糞鏈球菌[CMCC(B)32225]、雞腸球菌(27地方株)、乙型鏈球菌(28地方株)、乙型鏈球菌[CMCC(B)32210]。
培養(yǎng)基大豆胰酪胨瓊脂培養(yǎng)基(SCDA)(批號(hào) 020226 北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)(批號(hào) 030117 北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司)。
真菌細(xì)菌瓊脂培養(yǎng)基(FBA)和胨酵母浸出粉瓊脂培養(yǎng)基(PYA)(自己配制)培養(yǎng)基處方①大豆胰酪胨瓊脂培養(yǎng)基(SCDA)胰酪胨17g，大豆粉木瓜蛋白3g，葡萄糖2.5g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀2.5g，瓊脂14g，蒸餾水1000ml。pH7.2±0.2。
②真菌細(xì)菌培養(yǎng)基(FBA)胨15g，酵母浸出粉2g，葡萄糖10g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂0.25g，瓊脂14g，蒸餾水1000ml。pH7.1±0.2。
③胨酵母浸出粉瓊脂培養(yǎng)基(PYA)胨10g，酵母浸出粉3g，葡萄糖3g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂0.2g，瓊脂14g，蒸餾水1000ml。pH7.1±0.2。
④營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)胨10g，牛肉浸出粉3g，氯化鈉5g，瓊脂14g，蒸餾水1000ml。
以上培養(yǎng)基121℃滅菌20分鐘。
菌液的制備 取枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌和大腸桿菌等的18-24h營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1ml，用0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液10倍稀釋。大腸桿菌、銅綠假單胞菌的菌液分別稀釋至10-7、其他各菌株的菌液分別稀釋至10-6。
取上述稀釋級(jí)的最高兩稀釋級(jí)菌液各1ml，每一稀釋級(jí)分別加入2個(gè)平皿，加入溶化的各試驗(yàn)培養(yǎng)基，搖勻，凝固(即澆碟法)，倒置于30-35℃培養(yǎng)24-48h，逐日觀察并記錄，結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 4株菌在各培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果
注表內(nèi)數(shù)據(jù)為不同稀釋級(jí)生長(zhǎng)的菌落數(shù)，，直徑-菌落直徑，單位-mm。
PYA-蛋白胨酵母浸出粉瓊脂培養(yǎng)基。
表1說(shuō)明枯草桿菌、大腸桿菌、藤黃微球菌和金黃色葡萄球菌的不同稀釋級(jí)在PYA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌落數(shù)及菌落直徑均明顯優(yōu)于其他三種培養(yǎng)基。尤以大腸桿菌和枯草桿菌在PYA平板上的菌落直徑最大(見(jiàn)平板菌落照)。
7.2PYA培養(yǎng)基的組分配比試驗(yàn)培養(yǎng)基是人工合成的供給微生物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。微生物生長(zhǎng)的快慢與培養(yǎng)基的組分和配比是否合理有關(guān)。為促進(jìn)PYA培養(yǎng)基中的微生物生長(zhǎng)，除蛋白胨外，擬增加維生素和磷、鉀、鎂、錳、鋅等微量元素。
7.2.1硫酸鎂(MgSO4)量的比較PYA培養(yǎng)基中硫酸鎂的量分成0.25，0.2，0.15，0.125％(w/v)四組。通過(guò)4株菌的生長(zhǎng)試驗(yàn)，了解硫酸鎂的量對(duì)上述菌株生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。
表24株菌在不同量的硫酸鎂培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果
注表內(nèi)數(shù)據(jù)為不同培養(yǎng)時(shí)間的菌落直徑，單位mm。括號(hào)內(nèi)的千分號(hào)為各培養(yǎng)基中硫酸鎂的含量。
表2說(shuō)明4株菌在PYA培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度明顯優(yōu)于其他二種培養(yǎng)基。即24h的菌落直徑大，生長(zhǎng)快；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)慢PYA培養(yǎng)基中硫酸鎂的量在0.25‰～0.125‰之間對(duì)4株菌的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。
7.2.2磷酸氫二鉀量的比較PYA培養(yǎng)基中磷酸鹽的量分別按0.25，0.2，0.15，0.1％(w/v)四組試驗(yàn)。在配制該培養(yǎng)基中，磷酸氫二鉀的量為.0.1％，不調(diào)pH值，滅菌后，不產(chǎn)生沉淀。測(cè)得pH值為6.6。如調(diào)pH值為7.3，滅菌后產(chǎn)生沉淀。本試驗(yàn)說(shuō)明，PYA培養(yǎng)基產(chǎn)生沉淀與磷酸鹽和pH值有關(guān)。
擬對(duì)大豆胰酪胨瓊脂培養(yǎng)基、胨酵母浸出粉瓊脂培養(yǎng)基(PYA，處方同1.2.③。其中硫酸鎂為0.2g，碳酸鈉0.5g替代磷酸氫二鉀)和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用3株菌進(jìn)行比較試驗(yàn)，觀察碳酸鈉對(duì)3株菌的生長(zhǎng)有無(wú)影響。結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 3株菌在不含磷酸氫二鉀的培養(yǎng)基中24小時(shí)的生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果
注表內(nèi)數(shù)據(jù)為不同稀釋級(jí)生長(zhǎng)的菌落數(shù)，直徑-菌落直徑，單位-mm.PYA2不含磷酸氫二鉀。
表3說(shuō)明大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌在PYA2培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌落數(shù)(62，47，79)，落直徑(3.5，3.2，1.8)比大豆胰酪胨瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌落數(shù)(56，44，69；55，44，57)多，菌落直徑(1.8，3，1.3；3，2，1.5)也大。PYA2培養(yǎng)基優(yōu)于其他二種培養(yǎng)基，但不如表1所列數(shù)據(jù)那么顯著。說(shuō)明磷酸氫二鉀在PYA培養(yǎng)基中不僅有調(diào)節(jié)pH的作用，而且是微生物生長(zhǎng)不可或缺的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。碳酸鈉不可替代磷酸氫二鉀。
那么，不同量的磷酸鹽(0.25，0.2，0.15，0.1％)和pH值對(duì)微生物生長(zhǎng)有無(wú)影響？擬用4株菌在NA培養(yǎng)基與PYA1培養(yǎng)基、PYA2培養(yǎng)基、PYA3培養(yǎng)基、PYA4培養(yǎng)基平板的生長(zhǎng)試驗(yàn)進(jìn)行比較。PYA1、PYA2、PYA3、PYA4培養(yǎng)基的基礎(chǔ)方處方同1.2.③。其中PYA1培養(yǎng)基磷酸氫二鉀為0.25％，不調(diào)pH值為6.82；PYA2培養(yǎng)基磷酸氫二鉀為0.2％，不調(diào)pH值為6.77；PYA3培養(yǎng)基磷酸氫二鉀為0.2％，調(diào)pH值為7.3；PYA4培養(yǎng)基磷酸氫二鉀為0.15％，調(diào)pH值為7.3。結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 4株菌在不同量的磷酸鹽培養(yǎng)基中二次生長(zhǎng)試驗(yàn)的結(jié)果
注表內(nèi)數(shù)據(jù)為不同稀釋級(jí)生長(zhǎng)的菌落數(shù)；直徑-菌落直徑，單位-mm表4結(jié)果說(shuō)明①PYA1、PYA2培養(yǎng)基為不調(diào)pH值(下同)，大腸桿菌在該培養(yǎng)基平板上二次試驗(yàn)24小時(shí)的菌落數(shù)(14，4；56，55個(gè))和菌落直徑(3，3；2.5，3mm)比營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落數(shù)(35，33個(gè))多，菌落直徑(2.1，2.2mm)大1mm以上，且菌苔較厚。說(shuō)明大腸桿菌在PYA1、PYA2培養(yǎng)基中比在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的更好。
②PYA3和PYA4培養(yǎng)基為調(diào)pH值的培養(yǎng)基(pH值為7.2，下同)，大腸桿菌在該培養(yǎng)基上二次24小時(shí)的菌落數(shù)(47，44；40，41個(gè))和菌落直徑(4，3.5；4，4mm)比PYA1、PYA2培養(yǎng)基的菌落數(shù)(41，42；56，55個(gè))稍少，菌落直徑(3，3；2.5，3mm)大1mm。說(shuō)明pH值和磷酸鹽的量對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)有一定影響(pH偏酸，大腸桿菌菌落多，但菌落直徑小)。
③枯草桿菌在.PYA1、PYA2培養(yǎng)基平板上二次24小時(shí)的菌落數(shù)(10，4；18，3個(gè))和菌落直徑(2，2；3，3mm)比營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落數(shù)(12，3個(gè))稍多，菌落直徑(1，0.5mm)大1mm以上，且菌苔較厚。說(shuō)明枯草桿菌在PYA1、PYA2培養(yǎng)基中比在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的更好；枯草桿菌在PYA1、PYA2培養(yǎng)基上的菌落數(shù)和菌落直徑與PYA3和PYA4培養(yǎng)基的菌落數(shù)(11，6；4，11個(gè))相當(dāng)，菌落直徑(5，5；2，3mm)有差異，小約2mm。說(shuō)明pH值和磷酸鹽的量對(duì)枯草桿菌的生長(zhǎng)有一定影響(在偏堿性的PYA3和PYA4培養(yǎng)基中比在PYA1、PYA2培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌落大)。
④金黃色葡萄球菌在PYA1、PYA2培養(yǎng)基平板上二次24小時(shí)的菌落數(shù)(100，100；100，100個(gè))和菌落直徑(2.5，2.5；2.5，2.5mm)比營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落數(shù)(95，85個(gè))稍多，菌落直徑(1.7，1.7mm)大0.8mm；與.PYA3和PYA4培養(yǎng)基中菌落數(shù)(110，104；103，103個(gè))和菌落直徑(2.6，2.6；2.5，2.6mm)均相當(dāng)。說(shuō)明pH值和磷酸鹽的量對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)均無(wú)明顯影響。
⑤藤黃微球菌在PYA1、PYA2培養(yǎng)基平板上二次24小時(shí)的菌落數(shù)(36，49；42，47個(gè))和菌落直徑(1，1；1，1mm)比營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落數(shù)(33，32個(gè))多，菌落直徑(0.5，0.5mm)大2倍；比.PYA3和PYA4為調(diào)pH值的培養(yǎng)基中菌落數(shù)(40，47；30，46個(gè))和菌落直徑(1，1；1，1mm)均相當(dāng)。說(shuō)明pH值和磷酸鹽的量對(duì)藤黃微球菌的生長(zhǎng)均無(wú)明顯影響。
45小時(shí)觀察，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌在PYA1、2、3、4培養(yǎng)基平板上的菌落比NA培養(yǎng)基上的菌落更大，金黃色典型，以PYA1、PYA3培養(yǎng)基為佳。
7.2.3蛋白胨、微量元素及維生素本試驗(yàn)以營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基為對(duì)照，PYA2培養(yǎng)基(處方與上同)和PYA0培養(yǎng)基(基礎(chǔ)方同PYA2，增加適量微量元素硫酸錳05-10mg和硫酸鋅05-10mg)三種，用4株菌進(jìn)行了試驗(yàn)比較，結(jié)果見(jiàn)表5。
表5 4株菌在含微量元素及維生素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)試驗(yàn)的結(jié)果
注直徑-菌落直徑，單位-mm。
表5說(shuō)明①枯草桿菌、大腸桿菌在PYA2培養(yǎng)基中24小時(shí)生長(zhǎng)的菌落數(shù)(63，32個(gè))和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的菌落數(shù)(60，23個(gè))基本相當(dāng)；PYA2培養(yǎng)基的菌落直徑(6，6mm)比營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的菌落直徑(3，4mm)大2mm以上。藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌在PYA2培養(yǎng)基中48小時(shí)生長(zhǎng)的菌落數(shù)(21，99個(gè))和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的菌落數(shù)(23，90個(gè))基本相當(dāng)；PYA2培養(yǎng)基的菌落直徑(2.4，3.5mm)比營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的菌落直徑(1.5，2mm)大1～1.5mm。這一差距不如表1中PYA2培養(yǎng)基菌落直徑(4，5mm)比營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的菌落直徑(0.5，3mm)大2～3mm那么明顯。表1、表5中的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基為同一批，而PYA2培養(yǎng)基中的蛋白胨是不同廠家生產(chǎn)。說(shuō)明后者的蛋白胨的質(zhì)量不如前者好，蛋白胨對(duì)微生物生長(zhǎng)有一定影響。
②枯草桿菌、大腸桿菌在PYA0培養(yǎng)基中24小時(shí)生長(zhǎng)的菌落數(shù)(55，35個(gè))和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的菌落數(shù)(60，23個(gè))基本相當(dāng)；PYA0培養(yǎng)基的菌落直徑(12，7mm)比營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(3，4mm)大4，2倍。藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌在PYA0培養(yǎng)基中48小時(shí)生長(zhǎng)的菌落數(shù)(30，93個(gè))和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的菌落數(shù)(23，90個(gè))基本相當(dāng)；PYA0培養(yǎng)基的菌落直徑(3，3.6mm)比營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的菌落直徑(1.5，2mm)大2倍。
③枯草桿菌、大腸桿菌在PYA0培養(yǎng)基中24小時(shí)生長(zhǎng)的菌落數(shù)(55，35個(gè))和PYA2培養(yǎng)基中的菌落數(shù)(63，32個(gè))基本相當(dāng)；PYA0培養(yǎng)基的菌落直徑(12，7mm)比PYA2培養(yǎng)基菌落直徑(6，6mm)大6，1m。藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌在PYA0培養(yǎng)基中48小時(shí)生長(zhǎng)的菌落數(shù)(30，93個(gè))和PYA2培養(yǎng)基中的菌落數(shù)(21，99個(gè))基本相當(dāng)；PYA0培養(yǎng)基的菌落直徑(3，3.6mm)比.PYA2培養(yǎng)基的菌落直徑(2.4，3.5mm)略大。PYA0培養(yǎng)基增加了酵母浸出粉1/3和其他微量元素，初步結(jié)果說(shuō)明，該培養(yǎng)基中適量添加維生素和微量元素對(duì)枯草桿菌、大腸桿菌和藤黃微球菌有明顯的促生長(zhǎng)作用；對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)的影響不明顯。
7.3.PYA培養(yǎng)基與NA培養(yǎng)基的比較試驗(yàn)為進(jìn)一步驗(yàn)證PYA培養(yǎng)基是否優(yōu)于NA培養(yǎng)基，有必要擴(kuò)大菌株進(jìn)行試驗(yàn)比較。
取大腸桿菌、枯草桿菌、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌、糞鏈球菌、A型鏈球菌、乙型鏈球菌和雞腸球菌(A型鏈球菌、乙型鏈球菌用5％血肉湯培養(yǎng)基)的新鮮培養(yǎng)液1ml稀釋至10-5、10-6。其中大腸桿菌、銅綠假單胞菌的培養(yǎng)液稀釋至10-7。糞鏈球菌的10-5、10-6稀釋液各取0.5ml。其他均取最后兩稀釋級(jí)菌液各1ml加入平皿，每稀釋級(jí)4個(gè)平皿，其中2個(gè)平皿傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、另2個(gè)平皿傾注PYA培養(yǎng)基；A型鏈球菌、乙型鏈球菌稀釋菌液的2個(gè)平皿傾注5％血營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、另2個(gè)平皿傾注5％血PYA培養(yǎng)基，搖勻，凝固，倒置于規(guī)定的溫度培養(yǎng)24-48小時(shí)，觀察結(jié)果。結(jié)果見(jiàn)表6。
表6 4株菌在PYA培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中二次生長(zhǎng)試驗(yàn)的結(jié)果
注①48h兩種培養(yǎng)基的菌落大小一致，但菌落顏色明顯不同。②兩種培養(yǎng)基溶血環(huán)大小不同。
表6說(shuō)明
①大腸桿菌在PYA培養(yǎng)基中24h的菌落數(shù)(15，69個(gè))與NA培養(yǎng)基中的菌落數(shù)(10，64個(gè))相當(dāng)，而菌落直徑(9，8mm)比NA培養(yǎng)基中的菌落直徑(2，4mm)大。
②枯草桿菌在在PYA培養(yǎng)基中24h的菌落數(shù)(40，37個(gè))比NA培養(yǎng)基中菌落數(shù)(46，41個(gè))略少，而菌落直徑(8，6mm)比NA培養(yǎng)基(4，3mm)大2倍。
③金黃色葡萄球菌在PYA的菌落數(shù)(77，88個(gè))比NA培養(yǎng)基中菌落數(shù)(113，105個(gè))少，而菌落直徑(1.2，1.7mm)與NA培養(yǎng)基的菌落直徑(1，1.8mm)相當(dāng)。
④藤黃微球菌在PYA培養(yǎng)基中24h的菌落數(shù)(28，6個(gè))與NA培養(yǎng)基中菌落數(shù)(29，5個(gè))相當(dāng)，而菌落直徑(0.6，0.5mm)比NA培養(yǎng)基的菌落直徑(0.1，0.1mm)大5倍。
⑤.銅綠假單胞在PYA培養(yǎng)基中24h的菌落數(shù)(40，61個(gè))與NA培養(yǎng)基中菌落數(shù)(42，64個(gè))相當(dāng)，而菌落直徑(4.5，5.5mm)比NA培養(yǎng)基的菌落直徑(3.8，3.6mm)大。且菌落周?chē)鸀辄S綠色，NA培養(yǎng)基上為淺污褐色。
⑥表皮葡萄球菌、糞鏈球菌在PYA培養(yǎng)基中的菌落數(shù)和菌落直徑與NA培養(yǎng)基中的菌落數(shù)及菌落直徑基本相當(dāng)。
⑦雞腸球菌在PYA培養(yǎng)基中菌落數(shù)比NA培養(yǎng)基中的菌落數(shù)多，菌落直徑梢大。
⑧乙型鏈球菌(28)在PYA培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基中的菌落數(shù)相近，比NA培養(yǎng)基菌落直徑梢大⑨乙型鏈球菌在血營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中24h的溶血環(huán)較大，有的溶血環(huán)互溶；而在血PYA培養(yǎng)基中的溶血環(huán)較小，不好看結(jié)果。但在48h，PYA培養(yǎng)基中的菌落直徑比營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的菌落直徑大。
7.4.PYA培養(yǎng)基與NA、SCDA培養(yǎng)基的對(duì)對(duì)比試驗(yàn)用5株菌以澆碟法進(jìn)行了二次試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表7。
表7 5株菌在三種培養(yǎng)基中的二次生長(zhǎng)試驗(yàn)(澆碟法)結(jié)果
表7說(shuō)明PYA培養(yǎng)基中24小時(shí)的大腸桿菌、銅綠假單胞菌、枯草桿菌、藤黃微球菌的菌落直徑(7.5，4.3，5.1，0.6mm)均比營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的菌落直徑(3.7，3.6，2.6，0.2mm)大；金黃色葡萄球菌的菌落直徑兩者相當(dāng)。PYA與大豆酪胨瓊脂培養(yǎng)基比較，除大腸桿菌、銅綠假單胞菌的菌落直徑稍大外，其他三株菌的菌落大小相當(dāng)，說(shuō)明PYA與國(guó)產(chǎn)大豆胰酪胨瓊脂培養(yǎng)基的質(zhì)量接近。
7.5.PYA培養(yǎng)基與NA培養(yǎng)基的考察試驗(yàn)樣品來(lái)自實(shí)驗(yàn)室剩余樣品及同仁堂二廠提供了部分樣品(樣品名見(jiàn)表8)進(jìn)行考察試驗(yàn)，并對(duì)其中同批次有代表性的兩種培養(yǎng)基平板上的菌落拍照。20批樣品考察結(jié)果見(jiàn)表8。
表8 PYA培養(yǎng)基與營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的考察試驗(yàn)結(jié)果
表8說(shuō)明PYA與NA培養(yǎng)基通過(guò)7種20批次中成藥進(jìn)行了細(xì)菌數(shù)測(cè)定考察結(jié)果，PYA培養(yǎng)基測(cè)得的細(xì)菌數(shù)比營(yíng)養(yǎng)瓊脂測(cè)得細(xì)菌數(shù)多者有13批，占65％；細(xì)菌數(shù)相當(dāng)?shù)挠?批(序號(hào)2、3、4、10、19)占25％；有1批(序號(hào)18)細(xì)菌數(shù)減少，占5％。細(xì)菌數(shù)檢出率提高3-10％的有4批(序號(hào)6、8、13、14)，提高18-19％的有4批(序號(hào)5、9、14、16)，提高28％以上的有5批(序號(hào)1、11、12、15、20)。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基(PYA)，該培養(yǎng)基由胨、酵母浸出粉、葡萄糖、氯化鈉、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、硫酸錳、硫酸鋅、瓊脂和水組成。
2.如權(quán)利要求1的細(xì)菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，其中各組份在1000ml水中其含量分別為胨10-15克、酵母浸出粉2-4克、葡萄糖2-5克、氯化鈉4-6克、磷酸氫二鉀1-3克、七水硫酸鎂0.05-0.5克、硫酸錳0.5-10毫克、硫酸鋅0.4-10毫克、瓊脂適量。
3.如權(quán)利要求2的細(xì)菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，其中各組份在1000ml水中其含量分別為胨10克、酵母浸出粉3克、葡萄糖3克、氯化鈉5克、磷酸氫二鉀2克、七水硫酸鎂0.1克、硫酸錳5毫克、硫酸鋅4毫克、瓊脂適量。
全文摘要
本發(fā)明系一種更適合細(xì)菌生長(zhǎng)的微生物限度檢查專(zhuān)用培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基由胨、酵母浸出粉、葡萄糖、氯化鈉、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、硫酸錳、硫酸鋅、瓊脂和水組成。就生長(zhǎng)的細(xì)菌數(shù)和菌落直徑而言，本發(fā)明的培養(yǎng)基優(yōu)于中國(guó)藥典收載的微生物限度檢查細(xì)菌計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基，與國(guó)產(chǎn)美國(guó)藥典收載的微生物限度檢查細(xì)菌計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基的菌落直徑接近。本發(fā)明的細(xì)菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基比中國(guó)藥典培養(yǎng)基對(duì)半數(shù)樣品提高細(xì)菌檢出率17％以上，成本與中國(guó)藥典培養(yǎng)基接近，比國(guó)產(chǎn)美國(guó)藥典培養(yǎng)基低25％。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK1611609SQ20031010226
公開(kāi)日2005年5月4日 申請(qǐng)日期2003年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月30日
發(fā)明者蘇德模, 胡昌勤, 特玉香 申請(qǐng)人:蘇德模, 胡昌勤, 特玉香