本發(fā)明屬于分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及中藥及中藥材鑒定領(lǐng)域，特別涉及一種用于鑒定霍山石斛與河南石斛的方法。
背景技術(shù)：
：霍山石斛（Dendrobiumhuoshanense）是安徽省大別山區(qū)特有的、國家重點(diǎn)保護(hù)的名貴中草藥，隸屬于蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）。河南石斛（Dendrobiumhenanense）為霍山石斛的同屬近緣種，兩者形態(tài)特征比較相近，尤其制成楓斗后兩者更加難以通過外形進(jìn)行鑒別，導(dǎo)致在市場上河南石斛成為霍山石斛的混淆品之一。由于霍山石斛與河南石斛通過外形鑒別比較困難，采用傳統(tǒng)的鑒定方法有一定的局限。因此，亟需尋找一種快速、準(zhǔn)確的鑒定方法，以確?；羯绞幉蔫b定的準(zhǔn)確性。栗丹等利用DNA條形碼ITS序列對(duì)霍山石斛及其近緣物種進(jìn)行了鑒定（栗丹，李振堅(jiān)，毛萍，嚴(yán)雪鋒，淳澤，馬欣榮，基于ITS序列石斛材料的鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析，園藝學(xué)報(bào)，2012，39（8）：1539），但該方法需要進(jìn)行測序，耗時(shí)較長，且使用大型儀器，不利于實(shí)現(xiàn)快速、現(xiàn)場檢測。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種霍山石斛與河南石斛的對(duì)比鑒定方法。一種霍山石斛與河南石斛的對(duì)比鑒定操作步驟如下：（1）從待測的兩種樣品中分別提取基因組DNA作為模板，采用引物對(duì)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到兩種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；所述引物對(duì)為：上游引物CP29s：5’-TTCGTGGGATGGGGTCC-3’，下游引物CP29a：5’-TGCACATCCGAGCCTAA-3’；（2）瓊脂糖凝膠電泳法檢測兩種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物若其中一種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中含有262bp條帶的DNA片段，則其中一種或另一種待測樣品中含有或候選含有霍山石斛；若PCR產(chǎn)物中不含有262bp條帶的DNA片段，則一種或另一種待測樣品中不含有或候選不含有霍山石斛。進(jìn)一步限定的鑒定操作技術(shù)方案如下：步驟（1）PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，PCR反應(yīng)體系的總體積25μL，其中0.5μL一種或另一種待測樣品的DNA，1.0μL含量為10pmol的上游引物CP29s，1.0μL含量為10pmol的下游引物CP29a，2.5μL10×buffer緩沖液，1.5μL濃度為25mM的氯化鎂水溶液，0.5μL濃度為10mM的dNTPs，0.5μL濃度為5U/μL的TaqDNA聚合酶，無菌雙蒸水補(bǔ)足至25μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。步驟（2）中，取5μL一種或另一種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用2%的瓊脂糖凝膠，在電壓80-90V下電泳30分鐘，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照；若一種或另一種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中含有262bp的DNA片段，則所述待測樣品為霍山石斛；若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中未含有262bp的DNA片段，則所述待測樣品為非霍山石斛。一種用于霍山石斛與河南石斛對(duì)比鑒定的檢測試劑盒，將PCR反應(yīng)體系中的上游引物CP29s和下游引物CP29a分別單獨(dú)包裝，將PCR反應(yīng)體系中除待測樣品的DNA、上游引物CP29s和下游引物CP29a外的其它物質(zhì)混合均勻單獨(dú)包裝，將以上分別單獨(dú)包裝的物質(zhì)放置于同一個(gè)試劑盒內(nèi)，組成一個(gè)用于鑒定霍山石斛的檢測試劑盒。進(jìn)一步限定的檢測試劑盒的技術(shù)方案如下：根據(jù)進(jìn)一步限定的鑒定操作技術(shù)方案所述的檢測試劑盒，在每次檢測時(shí)，需要從檢測試劑盒中取用不同的物質(zhì)，各種物質(zhì)所取的量必須滿足進(jìn)一步限定的鑒定操作技術(shù)方案中PCR反應(yīng)體系中各物質(zhì)量的要求。本發(fā)明的有益技術(shù)效果體現(xiàn)在以下方面：1.本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)了霍山石斛與河南石斛的快速、準(zhǔn)確鑒別。2.與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法相比，本發(fā)明不需要形態(tài)分類學(xué)基礎(chǔ)且實(shí)現(xiàn)了快速鑒定霍山石斛與河南石斛，解決了根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定較為困難的問題。3.技術(shù)通用性強(qiáng)，對(duì)儀器設(shè)備要求不高，在實(shí)際工作中容易推廣應(yīng)用，操作過程簡單、耗時(shí)較短、靈敏度高且較穩(wěn)定。附圖說明圖1為霍山石斛、河南石斛及部分相似種的系統(tǒng)發(fā)育樹。其中，譜系分支節(jié)點(diǎn)上方為BI樹的后驗(yàn)概率PP和MP樹的自舉支持度BS，在斜線的左邊為PP值，斜線的右邊為BS值。圖2為通用引物擴(kuò)增凝膠電泳圖。M：DNA分子標(biāo)準(zhǔn)（DNAMarker，從上到下依次為2000、1000、750、500、250和100bp）；1：霍山石斛；2：河南石斛；3：：空白對(duì)照。圖3為特異性PCR引物對(duì)CP29（上游引物CP29s和上游引物CP29a）擴(kuò)增凝膠電泳圖。M：DNA分子標(biāo)準(zhǔn)（DNAMarker，從上到下依次為2000、1000、750、500、250和100bp）；1：用特異性PCR引物對(duì)CP29擴(kuò)增1個(gè)霍山石斛樣本的結(jié)果；2：特異性PCR引物對(duì)CP29擴(kuò)增1個(gè)河南石斛的結(jié)果；3：空白對(duì)照。圖4為特異性PCR引物對(duì)CP29（上游引物CP29s和上游引物CP29a）擴(kuò)增凝膠電泳圖。M：DNA分子標(biāo)準(zhǔn)（DNAMarker，從上到下依次為2000、1000、750、500、250和100bp）；1到7：霍山石斛DNA模板濃度依次為156ng/μl、78ng/μl、39ng/μl、19ng/μl、10ng/μl、5ng/μl和2ng/μl；8到14：河南石斛DNA模板濃度依次為156ng/μl、78ng/μl、39ng/μl、19ng/μl、10ng/μl、5ng/μl和2ng/μl。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地描述。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、用于鑒定霍山石斛的試劑盒的制備及使用方法一、用于鑒定霍山石斛的引物對(duì)的設(shè)計(jì)與合成從GenBank查找或通過本研究進(jìn)行測序獲得霍山石斛及混淆品的ITS序列，詳見下表1。其中，本研究測序所得單倍型序列（包括Hap5，Hap6和Hap7）詳見序列表中序列4至序列6所示。表1霍山石斛、河南石斛及部分相似種的ITS序列編號(hào)樣品名稱樣品數(shù)量單倍型GenBank登錄號(hào)本研究所得序列編號(hào)1鐵皮石斛Dendrobiumcatenatum1Hap1KP7435432鐵皮石斛Dendrobiumcatenatum1Hap2KF1434393金釵石斛Dendrobiumnobile1Hap3EF6187324金釵石斛Dendrobiumnobile1Hap4JN3885795河南石斛Dendrobiumhenanense1Hap5IHN1H6河南石斛Dendrobiumhenanense6Hap6IHN1C;IHN1E;IHN1F;IHN1G;HNITS01;IHN1D7霍山石斛Dendrobiumhuoshanense3Hap7KF143476IHS1AIHS2D8霍山石斛Dendrobiumhuoshanense1Hap8JN388567分別用貝葉斯法（Bayesianinference,BI）和簡約法（maximumparsimony,MP）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建BI和MP兩種系統(tǒng)樹。構(gòu)建系統(tǒng)樹時(shí)，用菱唇石斛Dendrobiumleptocladum的2條ITS序列（GenBank登錄號(hào)分別為AF521612和EU840697）作為外群。其中BI樹用MrBayesversion3.1.2軟件構(gòu)建，MP樹用PAUP*version4.0beta10軟件構(gòu)建。構(gòu)建BI樹時(shí)，用MrModeltestversion2.3軟件根據(jù)AIC（AkaikeInformationCriterion）檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)選擇數(shù)據(jù)的最適模型，所選最適模型是（SYM+G）。馬爾科夫鏈的蒙特卡洛方法（MarkovChainsMonteCarlo,MCMC）設(shè)置為四條鏈并運(yùn)行500000代。為了確定其收斂情況，MCMC分別運(yùn)行兩次。每100代抽取一個(gè)樣本，共形成10002個(gè)樣本。經(jīng)過分析得知，整個(gè)運(yùn)行在20000代后達(dá)到平穩(wěn)，這樣，總共剩余的樣本數(shù)為9602，用剩余樣本重建系統(tǒng)樹并估計(jì)其后驗(yàn)概率值。構(gòu)建MP樹時(shí)，設(shè)置自舉重復(fù)次數(shù)bootstrapnreps為1000次，使用啟發(fā)式搜索分析自舉重復(fù)數(shù)據(jù)集，啟發(fā)式搜索設(shè)置為由隨機(jī)逐步添加法產(chǎn)生起始樹，重復(fù)10次，采用TBR分支交換。通過BI法和MP法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，2種方法構(gòu)建的系統(tǒng)樹主干一致（圖1）。圖1中各譜系分支的節(jié)點(diǎn)處標(biāo)有BI樹的后驗(yàn)概率（posteriorprobability,PP）值和MP樹的自舉支持度（Bootstrap,BS）。結(jié)果表明，霍山石斛所有序列的單倍型形成單系（PP=1.00,BS=96）。在確定霍山石斛為單系群的前提下，用軟件ClustalX1.81對(duì)表1中所有ITS序列進(jìn)行對(duì)位排序和比較，找到差異片段，設(shè)計(jì)霍山石斛檢測特異性PCR引物，如下：上游引物CP29s：5’-TTCGTGGGATGGGGTcC-3’（序列1）；下游引物CP29a：5’-TGCACATCCGAGCCTaA-3’（序列2）。理論P(yáng)CR產(chǎn)物長度為262bp（序列3）二、用于鑒定霍山石斛的試劑盒的組裝將步驟一設(shè)計(jì)合成的上游引物CP29s和下游引物CP29a分別單獨(dú)包裝后，將PCR反應(yīng)體系中除待測樣品的DNA、上游引物CP29s和下游引物CP29a外的其它物質(zhì)混合均勻單獨(dú)包裝，將以上分別單獨(dú)包裝的物質(zhì)放置于同一個(gè)試劑盒內(nèi)，組成一個(gè)用于鑒定霍山石斛的檢測試劑盒。三、鑒定待測樣品中是否含有霍山石斛的方法采用步驟二的試劑盒按照包括如下步驟的方法鑒定待測樣品中是否含有霍山石斛：1、PCR擴(kuò)增從待測樣品中提取基因組DNA作為模板，采用步驟一設(shè)計(jì)合成的上游引物CP29s和下游引物CP29a（序列1和序列2）按照如下進(jìn)行PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)總體積25μL，包括以下試劑：0.5μL模板DNA，1.0μL上游引物CP29s（10pmol），1.0μL下游引物CP29a（10pmol），2.5μL10×buffer緩沖液，1.5μL濃度為25mM的MgCl2水溶液，0.5μL濃度為10mM的dNTPs，0.5μL濃度為5U/μL的TaqDNA聚合酶，無菌雙蒸水補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)液配制完后，輕輕震蕩混勻，將PCR管放入PCR儀中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體反應(yīng)條件如下：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，45個(gè)循環(huán)；72℃10min。2、PCR產(chǎn)物檢測采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測PCR產(chǎn)物，具體如下：取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物，采用2%的瓊脂糖凝膠，在電壓80-90V下電泳30分鐘，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。根據(jù)目的條帶的大小，按照如下方法確定待測樣品中是否含有霍山石斛：若獲得大小約為262bp的目的條帶（序列3），則所述待測樣品中含有霍山石斛；若沒有獲得大小為262bp的目的條帶（序列3），則所述待測樣品中不含有霍山石斛。實(shí)施例2、采用實(shí)施例1制備的試劑盒鑒定霍山石斛的特異性分析待測樣品：霍山石斛（采自于安徽霍山）和河南石斛（采自于安徽霍山）。均符合中國植物志和相關(guān)文獻(xiàn)的鑒別特征描述。通過鑒定，各樣品的實(shí)物與名稱相符，質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)。一、從待測樣品中提取基因組DNA分別取約50mg干燥樣品（當(dāng)然也可采用100mg新鮮樣品進(jìn)行基因組DNA提?。?，用CTAB法提取總DNA。具體如下：將無霉變的干燥藥材置于粉碎機(jī)中研磨粉碎，過40目篩。將粉末轉(zhuǎn)移到2.0mL的微量離心管中，加入900μL已滅菌的CTAB提取液（配方：2%(2g/100ml)CTAB，100mmol/LTris-HClpH=8.0，20mmol/LEDTA，1.4mol/LNaCl）、0.02gPVP40000、10μLβ-巰基乙醇充分振蕩混勻，65℃水浴1.5h-2h，期間輕搖2-3次。結(jié)束后取出冷卻至室溫，加入900μL氯仿-異戊醇（體積比24：1），充分振蕩混勻，12000g離心10min。取上清，加入等體積氯仿-異戊醇（體積比24：1），充分振蕩混勻，12000g離心10min。取上清，加入2/3體積預(yù)冷的異丙醇溶液，-20℃放置0.5h以上。取出，12000g離心10min，棄上清，沉淀用70%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇洗滌兩次，37℃揮干乙醇，用適量滅菌水溶解，-20℃保存。用通用引物TY1s和TY1a檢測以上提取的霍山石斛和河南石斛的基因組DNA質(zhì)量。TY1s：5’-GATGGATGAACCCTCAAATC-3’；TY1a：5’-GGCAGCCAACGAGAAGA-3’。反應(yīng)總體系為25μL，包括DNA模板0.5μL（5-50ng），上游引物1μL（10pmol），下游引物1μL（10pmol），10×PCRBuffer2.5μL，MgCl2（25mM）1.5μL，dNTPs（10mM）0.5μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，ddH2O補(bǔ)足至25μL。通用引物PCR反應(yīng)條件為：95℃5min、35個(gè)循環(huán)（每個(gè)循環(huán)包括95℃30s，55℃30s，72℃30s）、72℃10min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有樣品均能擴(kuò)增出DNA條帶（圖2）。二、PCR擴(kuò)增以步驟一從待測樣品中提取的基因組DNA為模板，采用實(shí)施例1步驟一設(shè)計(jì)的引物對(duì)CP29（上游引物CP29s和下游引物CP29a）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。具體的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同實(shí)施例1步驟三1。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置以雙蒸水為模板作為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。反應(yīng)結(jié)束后，按照實(shí)施例1中步驟三2的方法對(duì)待測樣品進(jìn)行鑒定。結(jié)果如圖3所示，從圖中可以看出：利用本發(fā)明的引物對(duì)CP29（上游引物CP29s和下游引物CP29a）對(duì)霍山石斛和河南石斛進(jìn)行檢測，霍山石斛能夠擴(kuò)增出片段大小約為262bp的目的條帶。而河南石斛未擴(kuò)增出目的條帶。這表明該反應(yīng)體系能將霍山石斛與河南石斛準(zhǔn)確的鑒別出來。將大小約為262bp的目的條帶回收測序，其序列正為序列表中序列3。實(shí)施例3、采用實(shí)施例1制備的試劑盒鑒定霍山石斛的靈敏度分析待測樣品：霍山石斛（采自于安徽霍山）。通過鑒定，樣品實(shí)物與名稱相符，質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)。一、從待測樣品中提取基因組DNA分別取約50mg干燥樣品（當(dāng)然也可采用100mg新鮮樣品進(jìn)行基因組DNA提?。?，用CTAB法提取總DNA。具體操作參見實(shí)施例2步驟一。二、PCR擴(kuò)增將步驟一從霍山石斛中提取的基因組DNA進(jìn)行倍比稀釋，得到基因組DNA濃度分別為156ng/μl、78ng/μl、39ng/μl、19ng/μl、10ng/μl、5ng/μl和2ng/μl的系列稀釋液，以系列稀釋液分別為模板，采用實(shí)施例1步驟一設(shè)計(jì)的引物對(duì)（引物SH-CP29s和SH-CP29a）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。具體的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同實(shí)施例1步驟三1。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置以雙蒸水為模板作為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。反應(yīng)結(jié)束后，按照實(shí)施例1中步驟三2的方法對(duì)待測樣品進(jìn)行鑒定。結(jié)果如圖4所示，從圖中可以看出：利用本發(fā)明的引物對(duì)CP29（上游引物CP29s和下游引物CP29a）對(duì)霍山石斛進(jìn)行檢測，當(dāng)模板濃度為39ng/μl時(shí)仍能夠檢測到大小約為262bp清晰的目的條帶。將大小約為262bp的目的條帶回收測序，其序列正為序列表中序列3。當(dāng)前第1頁1 2 3