本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及高油酸油菜的育種，具體涉及兩個(gè)高油酸油菜鑒別基因及其篩選方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

高油酸菜油有很好的營(yíng)養(yǎng)保健功能，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值可與橄欖油、茶油相媲美，因而其大規(guī)模推廣對(duì)于油菜產(chǎn)業(yè)的優(yōu)化升級(jí)及改善我國(guó)人民的食用油水平有很重要的作用。同時(shí)，也可增加油菜種植戶的效益，有效增加油菜生產(chǎn)，促進(jìn)我國(guó)油菜產(chǎn)業(yè)的大規(guī)模發(fā)展，保障我國(guó)食用油安全。

目前國(guó)內(nèi)外雖然選育出一些品種，但仍難以滿足日益增長(zhǎng)的大量需求，究其原因主要是高油酸油菜新品種選育多通過雜交或定向選育技術(shù)獲得材料，在田間種植，成熟后利用氣相色譜儀對(duì)收獲的種子進(jìn)行分析，根據(jù)結(jié)果確定其是否為高油酸材料。該方法耗時(shí)久(每年僅一季)，且田間工作管理及后期分析檢測(cè)工作較為繁重，新品種選育難度大；同時(shí)，還需投入大量的人力資源，增加了育種成本，不利于新品種大規(guī)模推廣；因此采用一種簡(jiǎn)單、快速的篩選方法來確定高油酸油菜材料成為當(dāng)前高油酸油菜育種研究的關(guān)鍵。

早期篩選高油酸油菜育種材料的研究中，如王敬喬等通過觀察置于含有次氯酸鈉和吐溫的混合溶液中葉片氧化變白的快慢在早期階段鑒別高油酸突變體。高建芹等發(fā)現(xiàn)除花期外，各生育期營(yíng)養(yǎng)器官與生殖器官中的油酸相對(duì)含量呈極顯著正相關(guān)。Noelle A等通過利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)高油酸花生及其野生型種子和葉片中FAD2基因表達(dá)量快速檢測(cè)高油酸花生基因型。這些方法可減少育種中的繁瑣工作，但沒有進(jìn)行系統(tǒng)的研究及后續(xù)驗(yàn)證，因此難以在生產(chǎn)中應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為解決油菜育種中工作繁瑣，育種周期長(zhǎng)的技術(shù)問題，提供了兩個(gè)高油酸油菜鑒別基因及其篩選方法和應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

兩種高油酸油菜鑒別基因，所述高油酸油菜鑒別基因1為atpB基因，其序列如SEQ ID NO：1所述；所述高油酸油菜鑒別基因2為肌酸磷酸激酶基因，其序列如SEQ ID NO：2所述。

兩個(gè)高油酸油菜鑒別基因的篩選方法，步驟如下：

(1)根據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析，篩選高油酸油菜育種材料早期篩選的候選基因；

(2)采集油酸含量不同的不同生育期油菜材料，測(cè)定候選基因的差異表達(dá)量；

(3)通過氣相色譜法測(cè)定步驟(2)中油菜成熟種子的脂肪酸成分；

(4)將步驟(2)中的差異表達(dá)量與步驟(3)中的脂肪酸成分進(jìn)行對(duì)比，篩選高油酸油菜基因。

兩個(gè)高油酸油菜鑒別基因的篩選方法作為篩選高油酸油菜育種材料的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于：

1.在油菜育種材料營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期進(jìn)行有效篩選，減少大量繁瑣的后期田間管理及分析檢測(cè)工作，降低育種成本。

2.對(duì)大量未知材料進(jìn)行篩選，獲得大批有高油酸潛力的育種材料，進(jìn)行后期研究，加快育種進(jìn)程，促進(jìn)高油酸油菜新品種選育。

附圖說明

圖1為atpB基因在高油酸油菜和低油酸油菜中不同時(shí)期的表達(dá)量。

圖2為肌酸磷酸激酶基因在高油酸油菜和低油酸油菜中不同時(shí)期的表達(dá)量。

圖3為atpB基因在不同油酸含量的油菜中的表達(dá)量。

圖4為肌酸磷酸激酶基因在不同油酸含量的油菜中的表達(dá)量。

圖5為atpB基因在雜交種子出苗7天中的表達(dá)量。

圖6為atpB基因在雜交種子5-6葉期的表達(dá)量。

圖7為atpB基因在雜交種子越冬期的表達(dá)量。

圖8為肌酸磷酸激酶基因在雜交種子出苗7天中的表達(dá)量。

圖9為肌酸磷酸激酶基因在雜交種子5-6葉期的表達(dá)量。

圖10為肌酸磷酸激酶基因在雜交種子越冬期的表達(dá)量。

具體實(shí)施方式

1.材料準(zhǔn)備

高油酸油菜材料、湘油15及不同油酸含量材料均由國(guó)家油料改良中心湖南分中心提供。

2.試驗(yàn)方法

2.1定量PCR檢測(cè)

樣品制備：在出苗后7d取10株，5-6葉期(12月初)和越冬期(元旦左右)各取10株油菜嫩葉(1片/株)備用，花期(3月中旬)各取10株自交套袋的花(3朵/株)，在授粉后20-35d(4月中旬)各取10株自交的未成熟種子(0.5g/株)及其角果皮(3個(gè)/株)混合保存于-80℃。

RNA提取：提取總RNA采用TransZol Up Plus RNA Kit(Trans GeneBiotech)，具體方法參照說明書。經(jīng)Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(jì)(Thermo)及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)符合要求，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

定量PCR分析：

(1)根據(jù)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果(由華大基因代為進(jìn)行)分析，兩個(gè)基因不同生育期材料中表達(dá)情況分析；

(2)兩個(gè)基因在56％、65％、75％和81％油菜5-6葉期葉片中表達(dá)情況分析，結(jié)果如圖3所示；

(3)高油酸材料(油酸含量81.4％)和湘油15(油酸含量62.5％)雜交后代不同生育期的差異基因表達(dá)情況分析。

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用TransScript All-in-One First-Strand cDNA(Trans GeneBiotech)，具體方法參照說明書。引物采用Primer 5.0設(shè)計(jì)，由上海生工技術(shù)公司合成。使用CFX96TM Real-Time System(BIO-RAD,USA)采用兩步循環(huán)法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)熒光信號(hào)通過CFX manager software program進(jìn)行信號(hào)收集和分析。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s,隨后進(jìn)入40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)中95℃變性5s，最后60℃退火30s，72℃延伸15s。UBC21(ubiquitin-conjugating enzyme 21)作為內(nèi)參基因，上游引物序列如SEQ ID NO：7所示，下游引物序列如SEQ ID NO：8所示?；虮磉_(dá)情況采用比較周期閾值法進(jìn)行評(píng)。數(shù)據(jù)分析采用ANOVA和Post Hoc test，p值<0.05表示存在顯著差異。

2.2油菜種子品質(zhì)分析

實(shí)驗(yàn)儀器：SP-6890型氣相色譜儀、FID檢測(cè)器和N3000色譜工作站毛細(xì)管色譜柱DB-23(安捷倫科技有限公司)；AL204電子天平(梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司)。

色譜條件：進(jìn)樣口溫度270℃；柱溫190℃；以5℃/min升至230℃，保持1min；檢測(cè)器溫度260℃；氮?dú)饬髁?50mL·min^-1；氫氣流量30mL·min^-1；空氣流量300mL·min^-1；分流比40：1；柱流量1.0mL·min^-1；進(jìn)樣量：1.0μL。

樣品制備與測(cè)定：取0.2g種子烘干，用高速粉碎機(jī)粉碎，置于10mL帶塞試管中，再加入2mL體積比為1：1的乙醚-石油醚加入到10mL試管中，加入1mL 0.5M的KOH-甲醇做催化劑，將試管置于40℃的恒溫水浴中，反應(yīng)24h后，靜止分層，從上層取樣。

3.結(jié)果與分析

3.1兩個(gè)基因不同生育期材料中表達(dá)情況分析

采集油酸含量不同的油菜不同生育期材料，并測(cè)定候選差異基因表達(dá)量；atpB基因的表達(dá)量以引物對(duì)SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4進(jìn)行熒光定量PCR結(jié)果如圖1所示；肌酸磷酸激酶基因的表達(dá)量以引物對(duì)SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6進(jìn)行進(jìn)行熒光定量PCR結(jié)果如圖2所示。根據(jù)結(jié)果可知，這2個(gè)基因在油菜營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期(花期前)表達(dá)有明顯規(guī)律，可用于進(jìn)一步研究。

3.2兩個(gè)基因在56％、65％、75％和81％油菜5-6葉期葉片中表達(dá)情況分析

采集油酸含量為56％、65％、75％和81％的油菜5-6葉期葉片，并測(cè)定候選差異基因表達(dá)量；atpB基因的表達(dá)量以引物對(duì)SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4進(jìn)行熒光定量PCR結(jié)果如圖3所示；肌酸磷酸激酶基因的表達(dá)量以引物對(duì)SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6進(jìn)行進(jìn)行熒光定量PCR結(jié)果如圖4所示。根據(jù)結(jié)果可知，這2個(gè)基因在不同油酸含量油菜5-6葉期葉片中表達(dá)情況比較與油酸含量間有明顯關(guān)聯(lián)，可根據(jù)基因表達(dá)情況預(yù)測(cè)油菜油酸含量。

3.3高油酸材料(油酸含量81.4％)和湘油15(油酸含量62.5％)雜交后代基因表達(dá)情況分析

采集雜交后代不同出苗后7d、5-6葉期和越冬期材料，并測(cè)定候選差異基因表達(dá)量；atpB基因的表達(dá)量以引物對(duì)SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4進(jìn)行熒光定量PCR結(jié)果如圖5-7所示；肌酸磷酸激酶基因的表達(dá)量以引物對(duì)SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6進(jìn)行進(jìn)行熒光定量PCR結(jié)果如圖8-10所示。

3.4高油酸材料(油酸含量81.4％)和湘油15(油酸含量62.5％)雜交后代品質(zhì)分析

采用氣相色譜法測(cè)定雜交后代成熟種子的脂肪酸成分，具體方法參照2.2，結(jié)果如表1，由上述結(jié)果可知，雜交后代主要分布在60-63、69-73和78-82三個(gè)區(qū)域，其中69-76區(qū)域最多，約占50％，符合孟德爾分離規(guī)律。

21個(gè)雜交后代種子油酸含量(湘油15油酸含量62.1％，高油酸油菜種子油酸含量80.5％)

表1

對(duì)比基因表達(dá)結(jié)果可知，這2個(gè)基因在不同雜交后代營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期表達(dá)情況比較與油酸含量間有明顯關(guān)聯(lián)，可用于早期篩選高油酸油菜育種材料。

3.5結(jié)果

最終確定atpB基因和肌酸磷酸激酶基因可用于高油酸油菜育種材料早期篩選，篩選出的atpB基因，其基因序列如SEQ ID NO：1所示，該基因表達(dá)的酶分別位于類囊體膜、質(zhì)膜或線粒體內(nèi)膜上，參與氧化磷酸化與光合磷酸化反應(yīng)，具有氧化磷酸化、光和系統(tǒng)電子轉(zhuǎn)移等作用，在跨膜質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)的推動(dòng)下催化合成生物體的能量“通貨”——ATP。

肌酸磷酸激酶基因，其基因序列如SEQ ID NO：2所示，在代謝(碳代謝、碳水化合物代謝、能量代謝)、轉(zhuǎn)運(yùn)(含磷基團(tuán)、成對(duì)受體磷集團(tuán)轉(zhuǎn)運(yùn)、磷酸激酶)等生理過程中發(fā)揮著重大作用。