本發(fā)明屬于分子體外診斷領(lǐng)域，具體涉及特別適用于血液病相關(guān)基因特定的結(jié)構(gòu)變異的體外診斷的基因捕獲試劑盒。

背景技術(shù)：

血液病作為非實(shí)體瘤，其基因相關(guān)研究在癌癥中處于領(lǐng)先定位，血液病相關(guān)基因的檢測(cè)也是最早進(jìn)入臨床應(yīng)用的。近年來，由于分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)血液病細(xì)胞分子遺傳學(xué)改變的了解也不斷深入。迄今報(bào)道血液病涉及至少數(shù)十種融合基因。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到大部分的血液病中存在著染色體結(jié)構(gòu)畸變，包括缺失、重復(fù)、倒位、易位等，導(dǎo)致原癌基因及抑癌基因結(jié)構(gòu)變異，原癌基因激活或抑癌基因失活，產(chǎn)生新的融合基因，編碼融合蛋白。有些基因是調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡的轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)基因發(fā)生變異，直接影響了下游信號(hào)傳遞途徑，導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)、凋亡障礙、分化障礙等，產(chǎn)生血液病表型。隨著血液病致病機(jī)理研究的深入和基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，血液病的遺傳物質(zhì)改變研究經(jīng)歷了染色體核型分析(細(xì)胞遺傳學(xué))檢測(cè)，融合基因基因檢測(cè)到點(diǎn)突變和微小缺失重復(fù)檢測(cè)。這三種不同維度的檢測(cè)，逐步成為血液病診治的依據(jù)和參考。

新一代高通量快速基因測(cè)序技術(shù)是國(guó)際上近十年發(fā)展起來的新技術(shù)，對(duì)于研究人類某些疾病的科學(xué)家來說，他們感興趣的往往只是很小部分的基因組區(qū)域，因此選擇性地對(duì)這些區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，將使測(cè)序總成本顯著降低同時(shí)也能縮短測(cè)序時(shí)間。序列捕獲技術(shù)是一種對(duì)基因組特定區(qū)域進(jìn)行選擇性富集的技術(shù)，其通過合適的方法將感興趣的區(qū)域從基因組中分離出來，然后再對(duì)該目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，目標(biāo)區(qū)域測(cè)序技術(shù)可以快速、全面地檢測(cè)出目標(biāo)基因突變。

基于雜交的序列捕獲技術(shù)是目前在第二代測(cè)序平臺(tái)中使用較多的序列富集方法，主要分為固相芯片雜交和液相雜交兩種。液相雜交技術(shù)是制備雜交探針庫(kù)，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行富集，液相雜交在動(dòng)力學(xué)上相對(duì)固相雜交更具優(yōu)勢(shì)，能降低對(duì)于樣品起始量要求。

基因的拷貝數(shù)變異(Copy Number Variation，CNV)是一類在臨床上非常重要的結(jié)構(gòu)變異，與血液病的診斷、預(yù)后、靶向藥物的敏感性相關(guān)。可靠的CNV檢測(cè)結(jié)果可以為診斷、臨床用藥以及病情評(píng)估等提供十分重要的依據(jù)。

基于新一代測(cè)序(Next-Generation Sequencing，NGS)平臺(tái)的CNV檢測(cè)，可以在保證檢測(cè)性能的前提下一次性給出多個(gè)基因的CNV檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)對(duì)于低純度腫瘤樣本有更好的檢測(cè)效果。

傳統(tǒng)的基于NGS平臺(tái)的CNV檢測(cè)使用全基因組低深度測(cè)序數(shù)據(jù)。隨著NGS技術(shù)的不斷進(jìn)步，基于目標(biāo)區(qū)域捕獲的高深度測(cè)序技術(shù)在臨床檢測(cè)的應(yīng)用場(chǎng)景下逐漸表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)。

對(duì)于基于NGS平臺(tái)的CNV檢測(cè)而言，需要在后期的數(shù)據(jù)處理中引入背景數(shù)據(jù)庫(kù)。這種引入背景數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)處理方式存在下述缺點(diǎn)：1.背景數(shù)據(jù)庫(kù)一般獲得自健康正常人的目標(biāo)基因測(cè)序數(shù)據(jù)，需要單獨(dú)建立，成本高；2.背景數(shù)據(jù)庫(kù)受建立時(shí)的實(shí)驗(yàn)條件、測(cè)序平臺(tái)的影響大，如何確保獲得目標(biāo)基因測(cè)序數(shù)據(jù)時(shí)的實(shí)驗(yàn)條件、測(cè)序平臺(tái)與建立背景數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)的實(shí)驗(yàn)條件、測(cè)序平臺(tái)的一致性是一個(gè)難題；3.對(duì)于全基因組測(cè)序這種偏好性相對(duì)較小的數(shù)據(jù)而言，背景庫(kù)的建立過于繁瑣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種新的基因捕獲試劑盒，如果在基于基因捕獲測(cè)序的血液病相關(guān)基因的CNV檢測(cè)中，使用該基因捕獲試劑盒進(jìn)行基因捕獲，則即使在后期的數(shù)據(jù)處理中不使用背景數(shù)據(jù)庫(kù)的情況下，仍能夠獲得良好的檢測(cè)結(jié)果。

本發(fā)明人為解決上述問題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：通過在基于基因捕獲測(cè)序的血液病相關(guān)基因的CNV檢測(cè)中，使用包含針對(duì)內(nèi)參基因的探針的基因捕獲試劑盒，即使在后期的數(shù)據(jù)處理中不使用背景數(shù)據(jù)庫(kù)的情況下，也能夠獲得良好的檢測(cè)結(jié)果，從而完成了本發(fā)明。需要說明的是，在本說明書中，特定的結(jié)構(gòu)變異是指基因拷貝數(shù)變異、大片段重排或部分串聯(lián)重復(fù)。

即，本發(fā)明包括：

1.一種血液病相關(guān)基因的基因捕獲試劑盒，其包括用于基因捕獲的探針，所述用于基因捕獲的探針包括：

針對(duì)血液病相關(guān)的目標(biāo)基因的探針；以及

針對(duì)內(nèi)參基因的探針；

其中，所述內(nèi)參基因包括選自下組中的一個(gè)或兩個(gè)以上：

ABL1基因的外顯子4、

ABL2基因的外顯子5、

CUX1基因的外顯子1、

CUX1基因的外顯子2、

CUX1基因的外顯子3、

CUX1基因的外顯子4、

CUX1基因的外顯子5、

CUX1基因的外顯子6、

CUX1基因的外顯子7、

CUX1基因的外顯子8、

CUX1基因的外顯子9、

CUX1基因的外顯子10、

CUX1基因的外顯子11、

CUX1基因的外顯子12、

CUX1基因的外顯子13、

CUX1基因的外顯子14、

CUX1基因的外顯子15、

CUX1基因的外顯子16、

CUX1基因的外顯子17、

CUX1基因的外顯子18、

CUX1基因的外顯子19、

CUX1基因的外顯子20、

CUX1基因的外顯子21、

CUX1基因的外顯子22、

CUX1基因的外顯子23、

CUX1基因的外顯子24、

CUX1基因的內(nèi)含子2、

CUX1基因的內(nèi)含子16、

CUX1基因的內(nèi)含子17、

CUX1基因的內(nèi)含子22、

CUX1基因的內(nèi)含子23、

DNAH9基因的內(nèi)含子52、

FBXW7基因的外顯子8、

FBXW7基因的外顯子9、

FBXW7基因的外顯子10、

FBXW7基因的外顯子11、

GNAS基因的外顯子1、

GNAS基因的外顯子8、

GNAS基因的外顯子9、

NTRK2基因的外顯子1、

NTRK2基因的外顯子2、

NTRK2基因的外顯子3、

NTRK2基因的外顯子4、以及

NTRK2基因的外顯子5。

2.根據(jù)項(xiàng)1所述的基因捕獲試劑盒，其中，所述用于基因捕獲的探針是生物素化的。

3.根據(jù)項(xiàng)1或2所述的基因捕獲試劑盒，其中，該基因捕獲試劑盒還包括鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠。

4.根據(jù)項(xiàng)1～3中任一項(xiàng)所述的基因捕獲試劑盒，其中，該基因捕獲試劑盒還包括用于阻斷非特異性雜交的DNA片段。

5.根據(jù)項(xiàng)1～4中任一項(xiàng)所述的基因捕獲試劑盒，其中，該基因捕獲試劑盒還包括用于提供雜交捕獲反應(yīng)的離子環(huán)境的緩沖液。

6.根據(jù)項(xiàng)1～5中任一項(xiàng)所述的基因捕獲試劑盒，其中，該基因捕獲試劑盒還包括用于洗脫物理吸附或非特異性雜交的清洗液。

7.根據(jù)項(xiàng)1～6中任一項(xiàng)所述的基因捕獲試劑盒，其中，該基因捕獲試劑盒還包括用于對(duì)捕獲到的目標(biāo)基因和/或內(nèi)參基因進(jìn)行擴(kuò)增的引物。

8.根據(jù)項(xiàng)1～7中任一項(xiàng)所述的基因捕獲試劑盒，其中，該基因捕獲試劑盒用于在血液病相關(guān)基因的基因捕獲測(cè)序中進(jìn)行基因捕獲；優(yōu)選地，所述基因捕獲測(cè)序用于檢測(cè)血液病相關(guān)基因的基因拷貝數(shù)變異、大片段重排或部分串聯(lián)重復(fù)。

9.一種血液病相關(guān)基因的基因捕獲方法，其使用項(xiàng)1～8中任一項(xiàng)所述的基因捕獲試劑盒進(jìn)行基因捕獲。

10.一種用于血液病相關(guān)基因的基因拷貝數(shù)變異、大片段重排或部分串聯(lián)重復(fù)檢測(cè)的二代測(cè)序DNA文庫(kù)的構(gòu)建方法，其包括：對(duì)DNA文庫(kù)中的血液病相關(guān)的目標(biāo)基因和內(nèi)參基因進(jìn)行基因捕獲的步驟，其中，所述基因捕獲使用項(xiàng)1～8中任一項(xiàng)所述的基因捕獲試劑盒進(jìn)行。

根據(jù)本發(fā)明，在基于基因捕獲測(cè)序的血液病相關(guān)基因的CNV檢測(cè)中，即使在后期的數(shù)據(jù)處理中不使用背景數(shù)據(jù)庫(kù)的情況下，也能夠獲得良好的檢測(cè)結(jié)果。

附圖說明

圖1顯示在實(shí)施例1的數(shù)據(jù)處理步驟中，采用A方案的數(shù)據(jù)處理結(jié)果的圖。

圖2顯示在實(shí)施例1的數(shù)據(jù)處理步驟中，采用B方案的數(shù)據(jù)處理結(jié)果的圖。

發(fā)明的具體實(shí)施方式

本說明書中提及的科技術(shù)語具有與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義，如有沖突以本說明書中的定義為準(zhǔn)。

首先，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種血液病相關(guān)基因的基因捕獲試劑盒(本發(fā)明的基因捕獲試劑盒)，其包括用于基因捕獲的探針，所述用于基因捕獲的探針包括：針對(duì)血液病相關(guān)的目標(biāo)基因的探針、以及針對(duì)內(nèi)參基因的探針。

在本說明書中，基因捕獲是指：基于核苷酸序列之間的互補(bǔ)配對(duì)原理，利用帶有標(biāo)記(例如生物素)的寡核苷酸探針調(diào)取一個(gè)或多個(gè)目的基因，并通過鏈霉親和素磁珠將目的基因從基因文庫(kù)中分離出來。

在本說明書中，寡核苷酸、多核苷酸與核酸三者可以互換使用，構(gòu)成上述三者的基本單元均是核苷酸(包括核糖核苷酸和/或脫氧核糖核苷酸)。

在本說明書中，目標(biāo)基因是指：可反映目標(biāo)疾病狀態(tài)、指導(dǎo)目標(biāo)疾病用藥和/或預(yù)測(cè)預(yù)后的基因。通常認(rèn)為，在罹患目標(biāo)疾病的患者中，該基因具有拷貝數(shù)變異。例如，在所述目標(biāo)疾病為癌癥的情況下，所述目標(biāo)基因可以是在癌癥中可能發(fā)生拷貝數(shù)變異的基因。

作為目標(biāo)基因，因不同的目標(biāo)疾病而異，通常是不同的。所述目標(biāo)疾病可以是例如：血液病(例如白血病)或?qū)嶓w癌(例如胃癌、乳腺、結(jié)腸直腸癌、肺癌等)。

在本發(fā)明中，所述目標(biāo)疾病是血液病。在本說明書中，血液病相關(guān)基因，血液病相關(guān)的目標(biāo)基因是指：可用作診斷血液病、指導(dǎo)血液病用藥和/或預(yù)測(cè)血液病預(yù)后的基因。通常認(rèn)為，在罹患血液病的患者中，該基因具有特定的結(jié)構(gòu)變異。例如，該基因可以是MLL基因。

在本說明書中，內(nèi)參基因是指：不能用作檢測(cè)目標(biāo)疾病的基因、但可用作參照，提供背景數(shù)據(jù)信息的染色體DNA區(qū)域或基因。內(nèi)參基因是人類基因組上拷貝數(shù)相對(duì)穩(wěn)定的基因或區(qū)域，其是一段高度保守、且不具有特定的結(jié)構(gòu)變異的DNA序列。通常認(rèn)為，無論是在健康正常人中，還是在目標(biāo)疾病的患者中，該基因都不具有特定的結(jié)構(gòu)變異。

所述內(nèi)參基因可以是選自下組中的一個(gè)或兩個(gè)以上：

除了針對(duì)目標(biāo)基因的探針和針對(duì)內(nèi)參基因的探針以外，所述用于基因捕獲的探針還可以包括針對(duì)與目標(biāo)疾病相關(guān)的其它基因的探針。與目標(biāo)疾病相關(guān)的其它基因是指：在目標(biāo)疾病中可能發(fā)生各種類型突變的基因，其可用作診斷目標(biāo)疾病、指導(dǎo)目標(biāo)疾病用藥和/或預(yù)測(cè)預(yù)后的基因，但在罹患目標(biāo)疾病的患者的患病細(xì)胞的基因組中，該基因的特定的結(jié)構(gòu)變異不常見或不具備臨床意義。

優(yōu)選地，所述用于基因捕獲的探針是生物素化的。這樣，可以使用鏈霉親和素標(biāo)記的固相載體將捕獲了目標(biāo)基因后的探針分離出來，所述固相載體優(yōu)選為磁珠。因此，優(yōu)選地，本發(fā)明的基因捕獲試劑盒還包括鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠。

在基因捕獲二代測(cè)序中，基因捕獲的處理對(duì)象一般是通過PCR擴(kuò)增得到的帶有標(biāo)簽(Index)的DNA文庫(kù)，該DNA文庫(kù)中的DNA分子的末端通常帶有接頭序列。在進(jìn)行基因捕獲時(shí)，通常需要將該接頭序列封閉。因此，優(yōu)選地，本發(fā)明的基因捕獲試劑盒中還包含用于封閉所述接頭序列的寡核苷酸，其通常可以是PCR擴(kuò)增得到的所述DNA文庫(kù)時(shí)使用的上下游引物。

優(yōu)選地，本發(fā)明的基因捕獲試劑盒中還包含用于阻斷非特異性雜交的DNA片段，其用于封閉基因組上的重復(fù)區(qū)域。所述用于阻斷非特異性雜交的DNA片段可以是胎盤來源的DNA，其長(zhǎng)度主要為50～300bp，并且富含重復(fù)的DNA序列，通常用于在微陣列篩選中阻斷非特異型雜交，還能用于抑制重復(fù)DNA序列，可以采用例如羅氏的COT human DNA或者ThermoFisher公司的Human Cot-I DNA。

優(yōu)選地，本發(fā)明的基因捕獲試劑盒中還包含用于提供雜交捕獲反應(yīng)的離子環(huán)境的緩沖液。

優(yōu)選地，本發(fā)明的基因捕獲試劑盒中還包含用于洗脫物理吸附或非特異性雜交的清洗液，它們用于提高基因捕獲的特異性。

優(yōu)選地，本發(fā)明的基因捕獲試劑盒中還包含該基因捕獲試劑盒還包括用于對(duì)捕獲到的目標(biāo)基因和/或內(nèi)參基因進(jìn)行擴(kuò)增的引物和/或PCR反應(yīng)液。

優(yōu)選地，本發(fā)明的基因捕獲試劑盒中還包含對(duì)照品，其用作陽性對(duì)照和/或陰性對(duì)照。

本發(fā)明的基因捕獲試劑盒中的各個(gè)組分優(yōu)選獨(dú)立地包裝于容器中，但在不影響使用的前提下，也可以將其中的一些組分合并包裝。

本發(fā)明的基因捕獲試劑盒，可以用于在基因捕獲測(cè)序中進(jìn)行血液病相關(guān)基因的基因捕獲。優(yōu)選地，所述基因捕獲測(cè)序可以用于檢測(cè)血液病相關(guān)基因的特定的結(jié)構(gòu)變異。

本發(fā)明的基因捕獲試劑盒可用于構(gòu)建基因捕獲二代測(cè)序DNA文庫(kù)，該基因捕獲二代測(cè)序DNA文庫(kù)可用于血液病相關(guān)基因的特定的結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)。因此，在另一方面中，本發(fā)明提供一種用于血液病相關(guān)基因的特定的結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)的二代測(cè)序DNA文庫(kù)的構(gòu)建方法(本發(fā)明的構(gòu)建方法)，其包括：對(duì)DNA文庫(kù)中的血液病相關(guān)的目標(biāo)基因和內(nèi)參基因進(jìn)行基因捕獲的步驟，其中，所述基因捕獲使用本發(fā)明的基因捕獲試劑盒進(jìn)行。將本發(fā)明的基因捕獲試劑盒用于構(gòu)建基因捕獲二代測(cè)序DNA文庫(kù)時(shí)，基因捕獲、構(gòu)建文庫(kù)的操作可以采用本技術(shù)領(lǐng)域已知的操作。

一般而言，本發(fā)明的構(gòu)建方法可以包括下述步驟：

步驟A：將希望進(jìn)行測(cè)序的樣本中的DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)，得到多組平末端DNA片段；

步驟B：將所述平末端DNA片段進(jìn)行3′端加A，得到3′端加A的DNA片段；

步驟C：將所述3′端加A的DNA片段進(jìn)行加接頭，得到加接頭DNA片段；

步驟D：將所述加接頭DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物(例如帶有標(biāo)簽的DNA文庫(kù))；

步驟E：以所述擴(kuò)增產(chǎn)物作為對(duì)象，使用本發(fā)明的基因捕獲試劑盒進(jìn)行基因捕獲，并對(duì)捕獲到的基因(包括目標(biāo)基因和內(nèi)參基因，視情況還可以包括與目標(biāo)疾病相關(guān)的其它基因)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到捕獲基因文庫(kù)。

所述樣本可以選自血液、腦脊液、胸腹水、組織或FFPE樣本。所述樣本中的DNA片段例如可以是循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)。所述樣本可以是一個(gè)，也可以是多個(gè)，例如2個(gè)以上，再例如5個(gè)以上，再例如10個(gè)以上。

所述捕獲基因文庫(kù)可以經(jīng)質(zhì)檢后上機(jī)測(cè)序，從而得到測(cè)序數(shù)據(jù)。測(cè)序平臺(tái)可以是例如用Illumina HiSeq 2500、4000平臺(tái)或者NextSeq 550AR平臺(tái)。

在對(duì)所述測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理的過程中，傳統(tǒng)上需要引入背景數(shù)據(jù)庫(kù)。但是，如果構(gòu)建基因捕獲二代測(cè)序DNA文庫(kù)的過程中，使用了本發(fā)明的基因捕獲試劑盒進(jìn)行基因捕獲，則可以將獲取的內(nèi)參基因的測(cè)序數(shù)據(jù)作為背景，而無需引入背景數(shù)據(jù)庫(kù)(當(dāng)然，引入背景數(shù)據(jù)庫(kù)也可以)。這種方式的優(yōu)點(diǎn)包括：(1)無需單獨(dú)建立背景數(shù)據(jù)庫(kù)，節(jié)約了成本；(2)獲得內(nèi)參基因的測(cè)序數(shù)據(jù)時(shí)的實(shí)驗(yàn)條件、測(cè)序平臺(tái)與獲得目標(biāo)基因的測(cè)序數(shù)據(jù)時(shí)的實(shí)驗(yàn)條件、測(cè)序平臺(tái)完全一致。

因此，根據(jù)本發(fā)明，在基于基因捕獲測(cè)序的CNV檢測(cè)中，即使在后期的數(shù)據(jù)處理中不使用背景數(shù)據(jù)庫(kù)(當(dāng)然，也可以使用背景數(shù)據(jù)庫(kù))的情況下，也能夠獲得良好的檢測(cè)結(jié)果。在本說明書中，“檢測(cè)結(jié)果良好”是指：在基于基因捕獲測(cè)序的CNV檢測(cè)中，在使用本發(fā)明的基因捕獲試劑盒進(jìn)行基因捕獲的情況下，通過將獲取的內(nèi)參基因的測(cè)序數(shù)據(jù)作為背景，所得檢測(cè)結(jié)果與通過引入背景數(shù)據(jù)庫(kù)而獲得的檢測(cè)結(jié)果一致。

實(shí)施例

以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的實(shí)施例是用于解釋本發(fā)明，而非用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例1

1.1血液病基因檢測(cè)液體芯片的設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI-PDB、PubMed、COSMIC、Clinvar、HGMD、GeneCards、zj-LOVD等)的信息，選擇了用于血液病檢測(cè)的目標(biāo)基因，其中，MLL基因在血液病患者中可能具有部分串聯(lián)重復(fù)，其位于第11號(hào)染色體。探針針對(duì)特定疾病致病基因的外顯子(或外顯子前后兩端200bp)或特定目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)好的探針與NCBI等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)，并且要確保探針的堿基個(gè)數(shù)在60～80nt之間、TM值適中、無回文序列等特殊結(jié)構(gòu)、與序列同源性在50％～80％之間，通過這些數(shù)值以確保探針的特異性。

將設(shè)計(jì)出的探針序列合成為寡核苷酸探針，PCR驗(yàn)證后獲得血液病相關(guān)基因捕獲探針克隆庫(kù)。

此外，將下述基因作為內(nèi)參基因：ABL1、CUX1、DNAH9、FBXW7、GNAS、NTRK2、SMAD4和SYK，具體區(qū)域及在人類基因組中的位置請(qǐng)參見說明書中的描述。針對(duì)內(nèi)參基因的探針的設(shè)計(jì)及合成與針對(duì)目標(biāo)基因的探針的設(shè)計(jì)及合成相同。

利用生物素標(biāo)記數(shù)量和位置確定的擴(kuò)增引物或接頭元件制備含有利于靶標(biāo)片段抓取的捕獲探針文庫(kù)，最終得到已知生物素標(biāo)記數(shù)量和位置的捕獲探針集即帶有生物素標(biāo)記的捕獲探針庫(kù)。

1.2DNA提取

使用過膜法提取血液基因組DNA，具體步驟參照天根血液提取試劑盒步驟。

1.3末端修復(fù)(End Repair)：

(1)預(yù)先從-20℃保存的試劑盒中取出所需試劑，將其置于冰盒上化凍并震蕩混勻。

單個(gè)樣本配制量參見表2，多樣本可按比例配制Mix。

表2

(2)末端修復(fù)反應(yīng)：向1.5mL的離心管中分裝好25μL Mix，分裝完成并確認(rèn)加入無誤后，加入DNA樣本將1.5mL離心管置于Thermomixer中20℃溫浴30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后使用1.8×核酸純化磁珠回收純化反應(yīng)體系中的DNA，溶于32μL EB。

1.4末端加“A”(A-Tailing)

(1)預(yù)先從-20℃保存的試劑盒中取出所需試劑，將其置于冰盒上化凍并震蕩混勻。單個(gè)樣本配制量參見表3，多樣本可按比例配制Mix：

表3

(2)末端加“A”反應(yīng)：向1.5mL的離心管中分裝18μLMix，確認(rèn)無誤后，加入32μL上一步純化回收的DNA。加完后震蕩混勻并離心，將1.5mL離心管置于Thermomixer中37℃溫浴30分鐘。使用1.8×核酸純化磁珠回收純化反應(yīng)體系中的DNA，溶于18μL EB中。

1.5接頭的連接(Adapter Ligation)

(1)預(yù)先從-20℃保存的試劑盒中取出所需試劑，將其置于冰盒上化凍并震蕩混勻。單個(gè)樣本配制量參見表4，多樣本可按比例配制Mix：

表4

(2)接頭的連接反應(yīng)：向1.5mL的離心管中分裝27μL Mix，確認(rèn)無誤后，加入加入18μL上一步純化回收的DNA。加完后震蕩混勻并離心，將樣本管置于Thermomixer中20℃溫浴15分鐘。使用1.8×核酸純化磁珠回收純化反應(yīng)體系中的DNA，溶于30μL的EB中。

1.6PCR反應(yīng)

(1)從-20℃保存的試劑盒中取出所需試劑，將其置于冰盒上化凍并震蕩混勻。0.2mL的PCR管中配制PCR反應(yīng)體系，多樣本可按比例配制Mix：

表5

(2)設(shè)定PCR程序，PCR反應(yīng)的程序設(shè)定如下：

反應(yīng)結(jié)束及時(shí)將樣品取出放入4℃冰箱保存并按要求退出或關(guān)閉儀器。

(3)用0.9×核酸純化磁珠回收純化反應(yīng)體系中的DNA，純化后的文庫(kù)溶于20μL的ddH₂O中。貼好標(biāo)簽，小片段文庫(kù)建庫(kù)完成。對(duì)文庫(kù)進(jìn)行Qubit檢測(cè)，記錄各個(gè)文庫(kù)濃度大小。將文庫(kù)送檢安捷倫2100，保存峰圖結(jié)果。

1.7準(zhǔn)備雜交文庫(kù)

(1)本實(shí)驗(yàn)中，用于提供雜交捕獲反應(yīng)的離子環(huán)境的緩沖液、以及用于洗脫物理吸附或非特異性雜交的清洗液、漂洗液均購(gòu)自Roche公司。

(2)準(zhǔn)備雜交文庫(kù)：將待雜交的DNA文庫(kù)在冰上融化，取總質(zhì)量1μg(在后續(xù)操作步驟中將此DNA文庫(kù)稱為樣本文庫(kù))。

(3)制備Ann引物Pool：將樣本文庫(kù)Index對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽引物In1(100μM)及公共引物(1000μM)置于冰上融化，各各取1000pmol混合混合，(在后續(xù)操作步驟中將此混合物稱為Ann引物pool)。

(4)雜交樣本的制備：向1.5mL EP管中加入5μL COT DNA(Human Cot-1DNA，Life technologies，1mg/mL)以及1μg樣本文庫(kù)。向混合物中加入Ann引物pool。用封口膜密封制備好的雜交樣本EP管，調(diào)節(jié)真空干燥儀的溫度至50～60℃，將盛有樣本文庫(kù)pool/COT DNA/Ann引物pool的EP管置于真空裝置中直到完全干燥。

(5)雜交樣本的溶液：向樣本文庫(kù)pool/COT DNA/Ann引物pool的干粉中加入：

7.5μL 2×雜交緩沖液

3μL雜交組分A

至此，EP管中含有以下組分：

1.8準(zhǔn)備雜交文庫(kù)

(1)將加入雜交緩沖液的上述混合物渦旋震蕩10秒，充分混勻后最大轉(zhuǎn)速離心10秒。

(2)將上述混合物置于預(yù)先準(zhǔn)備好的95℃加熱模塊上變性10分鐘。取下變性后的混合物，室溫下最大轉(zhuǎn)數(shù)離心10秒。

(3)將上述混合物轉(zhuǎn)移至含有4.5μL捕獲芯片的0.2mL平蓋PCR管中。渦旋震蕩3秒，充分混勻后最大轉(zhuǎn)數(shù)離心10秒。至此，雜交樣品混合物中含有如下組分：

(4)將雜交樣品混合物置于47℃加熱模塊上16小時(shí)。加熱模塊的熱蓋溫度需設(shè)定為57℃，雜交后產(chǎn)物需進(jìn)行后續(xù)洗脫回收操作。

(5)將10×清洗液(I，II與III)、10×漂洗液和2.5×磁珠清洗液配置成1×工作液。

表8

(6)將下列試劑在47℃加熱模塊中預(yù)熱：

400μL 1×漂洗液

100μL 1×清洗液I

1.9制備親和吸附磁珠

(1)實(shí)驗(yàn)開始前，將鏈霉親和素磁珠(Dynabeads M-280Streptavidin，以下簡(jiǎn)稱磁珠)在室溫下平衡30分鐘后，將磁珠充分渦旋混勻15秒。

(2)向1.5mL離心管中分裝100μL磁珠，1個(gè)1.5mL離心管最多可用來制備6個(gè)雜交捕獲所需的磁珠。

(3)將盛有磁珠的離心管置于磁力架上，約5分鐘后小心吸棄上清，將磁珠留在離心管中，加兩倍于磁珠初始體積的1×磁珠清洗液。將離心管從磁力架上取下，渦旋混勻10秒。將盛有磁珠的離心管放回磁力架，吸附磁珠。待溶液澄清，吸棄上清。重復(fù)次步驟，共洗滌兩次。

(4)洗滌完畢后吸棄磁珠清洗液，用磁珠初始體積的1×磁珠清洗液渦旋重懸磁珠。將重懸的100μL磁珠轉(zhuǎn)入0.2mL的PCR管中。將PCR管置于磁力架上吸附磁珠，溶液澄清后吸棄上清。至此，捕獲DNA所需的親和吸附磁珠制備完畢，應(yīng)立即進(jìn)行下步結(jié)合反應(yīng)。

1.10DNA與親和吸附磁珠的結(jié)合及漂洗

(1)將雜交的樣本文庫(kù)轉(zhuǎn)入盛有親和吸附磁珠的0.2mL PCR管中，吸打10次，將二者混勻。

(2)將0.2mL PCR管置于47℃加熱模塊45分鐘，每隔15分鐘渦旋混勻一次，使DNA與磁珠結(jié)合。

(3)45分鐘孵育后，向15μL捕獲的DNA樣本中加入47℃預(yù)熱的1×清洗液I 100μL。渦旋混勻10秒。將0.2mL PCR管中的全部組分轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中。將1.5mL離心管置于磁力架上吸附磁珠，棄上清。

(4)將1.5mL離心管從磁力架上取下，加入200μL預(yù)熱47℃的1×漂洗液。吸打混勻10次(需迅速操作，防止試劑、樣品溫度低于47℃)?；靹蚝髽颖局糜?7℃加熱模塊上5分鐘。重復(fù)此步驟，用47℃的1×漂洗液共洗滌兩次。將1.5mL的離心管置于磁力架上，吸附磁珠，棄上清。

(5)向上述1.5mL離心管中加入200μL室溫的1×清洗液I，渦旋混勻2分鐘。將離心管置于磁力架上，吸附磁珠，棄上清。向上述1.5mL離心管中加入200μL室溫的1×清洗液II，渦旋混勻1分鐘。將離心管置于磁力架上，吸附磁珠，棄上清。向上述1.5mL離心管中加入200μL室溫的1×清洗液III，渦旋混勻30秒。將離心管置于磁力架上，吸附磁珠，棄上清。

(6)1.5mL離心管從磁力架上取下，加入45μL PCR水，溶解洗脫磁珠捕獲樣本。將磁珠-樣本混合物放在-20℃保存。

1.11捕獲DNA的PCR擴(kuò)增

(1)按下表制備捕獲后PCR mix，制備好后渦旋震蕩混勻。余下的磁珠吸附DNA放在-20℃保存。富集引物F和富集引物R均購(gòu)自英濰捷基公司。

(2)磁珠吸附DNA PCR的擴(kuò)增程序設(shè)定如下：

(3)雜交捕獲DNA PCR產(chǎn)物的回收純化：用核酸純化磁珠回收純化反應(yīng)體系中的DNA，磁珠使用量為0.9×，純化后的文庫(kù)溶于30μL的ddH2O中。貼好標(biāo)簽，雜家捕獲文庫(kù)建庫(kù)完成。

1.12文庫(kù)定量

對(duì)文庫(kù)進(jìn)行2100Bioanalyzer(Agilent)/LabChip GX(Caliper)及QPCR檢測(cè)，記錄文庫(kù)濃度。

1.13文庫(kù)上機(jī)測(cè)序

構(gòu)建好的文庫(kù)用Illumina NextSeq 550AR進(jìn)行測(cè)序。

1.14數(shù)據(jù)處理及分析

將NGS測(cè)序數(shù)據(jù)，采用常規(guī)的比對(duì)算法獲得深度信息，并通過對(duì)待檢測(cè)區(qū)域的深度信息進(jìn)行分析得到CNV檢測(cè)結(jié)果。A方案：引入另行建立的背景數(shù)據(jù)庫(kù)作為背景；B方案：不引入背景數(shù)據(jù)庫(kù)，而是將獲得的內(nèi)參基因的測(cè)序數(shù)據(jù)作為背景。

采用上述A方案和方案B的數(shù)據(jù)分析結(jié)果分別如圖1和圖2所示。

圖1和圖2的數(shù)據(jù)分析結(jié)果均顯示該樣本中MLL基因具有部分串聯(lián)重復(fù)。

A方案使用了背景庫(kù)，由圖1可知，橫軸為人參考基因組(hg19)坐標(biāo)，縱軸為經(jīng)過均一化處理的深度信號(hào)值。一般認(rèn)為該信號(hào)值在0附近波動(dòng)為正常。圖1中標(biāo)記MLL-PTD的區(qū)域?yàn)榇龣z測(cè)區(qū)域：可以看到，待檢測(cè)區(qū)域的深度信號(hào)值已明顯偏離了0附近的區(qū)域，故該結(jié)果被認(rèn)為MLL-PTD陽性。

B方案沒有使用背景庫(kù)，而是將內(nèi)參基因或其部分區(qū)域作為檢測(cè)過程中的參考標(biāo)準(zhǔn)。由圖2可知，橫軸為人參考基因組(hg19)坐標(biāo)，縱軸為經(jīng)過均一化處理的深度信號(hào)值。一般認(rèn)為該信號(hào)值在0附近波動(dòng)為正常。

圖2中除被標(biāo)記為MLL-PTD的區(qū)域以外，均為內(nèi)參基因或其部分區(qū)域。可以看到：其深度信號(hào)值均在0附近波動(dòng)，即，內(nèi)參基因或其部分區(qū)域一般被認(rèn)為不存在特定的基因結(jié)構(gòu)變異。

圖2中被標(biāo)記為MLL-PTD的區(qū)域?yàn)榇龣z測(cè)區(qū)域：可以看到，其深度信號(hào)值已經(jīng)顯著偏離0附近，與內(nèi)參基因區(qū)域的深度信號(hào)值差異顯著，故該檢測(cè)結(jié)果被認(rèn)為是MLL-PTD陽性。

本實(shí)施例通過將內(nèi)參基因的測(cè)序數(shù)據(jù)作為背景，即使在不引入背景數(shù)據(jù)庫(kù)的情況下，仍能夠獲得良好的檢測(cè)結(jié)果。

公共引物序列：

5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′

標(biāo)簽引物In1引物序列：

5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3′

工業(yè)實(shí)用性

根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種特別適于在基因捕獲測(cè)序中作為基因捕獲工具的基因捕獲試劑盒。