本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于結(jié)腸癌預(yù)測轉(zhuǎn)移的血漿miRNA組合、其探針組合物及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

結(jié)腸癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均很高。結(jié)腸癌在男性癌癥發(fā)病率中位居第三位，僅次于肺癌和前列腺癌，在女性癌癥發(fā)病率僅次于肺癌和乳腺癌。其易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)率高是一直困擾臨床的重要問題。近年來，結(jié)腸癌的發(fā)病率呈不斷上升趨勢，結(jié)腸癌的發(fā)生是一個涉及遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)異常的復(fù)雜過程，結(jié)腸癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移等因素密切相關(guān)，至今仍未能充分闡明結(jié)腸癌的癌變機(jī)制并建立易于推廣的預(yù)測轉(zhuǎn)移及有效診斷手段。早期結(jié)腸癌是可以治愈的，但進(jìn)展期的結(jié)腸癌則預(yù)后較差。因而，早期發(fā)現(xiàn)、早期預(yù)測是治療和改善結(jié)腸癌預(yù)后的關(guān)鍵。當(dāng)前對結(jié)腸癌患者的預(yù)后情況進(jìn)行預(yù)測，主要依賴于當(dāng)前的分期系統(tǒng)，這是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，因?yàn)榫哂型瑯优R床特征的結(jié)腸癌患者的預(yù)后情況可能存在很大的差異。因而，我們亟需開發(fā)更加明確而有效的生物標(biāo)志物，對不同特征的結(jié)腸癌患者，進(jìn)行更加科學(xué)的個體化治療，尤其是早期患者的預(yù)測轉(zhuǎn)移和風(fēng)險(xiǎn)評估。這將有助于改善患者的生存質(zhì)量以及延長患者生存時間。

微小核糖核酸，英文名micRNAs(即miRNAs)，是近年來腫瘤分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的一個熱點(diǎn)。成熟miRNA通常的長度為18～25nt，是廣泛存在于真核生物中，不具有蛋白質(zhì)編碼基因和開放閱讀框架的單鏈小分子RNA，它與其靶mRNA分子的3’端非翻譯區(qū)(3’-untranslated region,3’-UTR)互補(bǔ)結(jié)合，可通過誘導(dǎo)mRNA的切割、降解等機(jī)制抑制靶基因的表達(dá)。MiRNA的特點(diǎn)主要表現(xiàn)為它的保守性、基因族集現(xiàn)象、時序性和特異性表達(dá)?，F(xiàn)在的許多研究表明，miRNAs在細(xì)胞發(fā)育、變異、增殖和凋亡等細(xì)胞發(fā)展的過程中起著重要的作用，可調(diào)控約60％的基因表達(dá)，在疾病的各個發(fā)展階段起著非常重要的作用。此外，越來越多的證據(jù)表明miRNAs在腫瘤的致癌作用和腫瘤的發(fā)展中起著十分重要的作用，在各種腫瘤中(如肺癌、乳腺癌、食管癌等)，多種miRNA被發(fā)現(xiàn)是上調(diào)或者下調(diào)的，表達(dá)上調(diào)的miRNA可能發(fā)揮與癌基因相似的作用，而表達(dá)下調(diào)的miRNA可能與抑癌基因有相似的作用，這對腫瘤的臨床診斷、治療方案的選擇和預(yù)后具有指導(dǎo)意義。因而，miRNA作為一種新型的腫瘤生物標(biāo)志物，備受關(guān)注。

組織標(biāo)本取材屬創(chuàng)傷性檢出，且無法實(shí)現(xiàn)腫瘤的預(yù)測和早期診斷，因此，研究人員力圖尋找一種非創(chuàng)傷性檢查的檢測手段，用于結(jié)腸癌的預(yù)測轉(zhuǎn)移，但是，目前沒有報(bào)道稱得到了結(jié)腸癌預(yù)測轉(zhuǎn)移的非創(chuàng)傷性檢查的檢測手段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷和問題，本發(fā)明的目的是提供一種用于結(jié)腸癌預(yù)測轉(zhuǎn)移的血漿miRNA組合、其探針組合物及應(yīng)用。本發(fā)明通過對患者的血液樣本中血漿的miRNA進(jìn)行檢測和對比，分析miRNA表達(dá)水平與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系，篩選出一組與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的血漿miRNA，并利用這些miRNA的TaqMan探針，制備適應(yīng)于臨床診斷用途的試劑盒，為結(jié)腸癌患者提供特異性且快速、無創(chuàng)傷的檢測手段。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的一種用于結(jié)腸癌預(yù)測轉(zhuǎn)移的血漿miRNA組合，所述miRNA組合包括以下miRNA中一種或者其中至少兩種的組合：miR-190、miR-422a、miR-592、miR-639。

優(yōu)選采用其中任意兩種、三種或者四種的組合。

優(yōu)選地，所述miRNA組合為miR-190、miR-422a和miR-639的組合。

優(yōu)選地，所述miRNA組合為miR-190、miR-422a、miR-592和miR-639的組合。

本發(fā)明的一種用于結(jié)腸癌預(yù)測轉(zhuǎn)移的血漿miRNA的TaqMan探針組合物，所述TaqMan探針組合物包括以下miRNA的TaqMan探針中的一種或者其中至少兩種的組合：miR-190的TaqMan探針、miR-422a的TaqMan探針、miR-592的TaqMan探針、miR-639的TaqMan探針。

優(yōu)選采用其中任意兩種、三種或者四種TaqMan探針的組合物。

進(jìn)一步地，所述miR-190的TaqMan探針序列如SEQ ID NO：1所示；

所述miR-422a的TaqMan探針序列如SEQ ID NO：2所示；

所述miR-592的TaqMan探針序列如SEQ ID NO：3所示；

所述miR-639的TaqMan探針序列如SEQ ID NO：4所示。

優(yōu)選地，所述血漿miRNA的TaqMan探針組合物為miR-190、miR-422a和miR-639的TaqMan探針組合物。

優(yōu)選地，所述血漿miRNA的TaqMan探針組合物為miR-190、miR-422a、miR-592和miR-639的TaqMan探針組合物。

本發(fā)明還提供了如上述用于結(jié)腸癌預(yù)測轉(zhuǎn)移的血漿miRNA的TaqMan探針組合物在制備結(jié)腸癌預(yù)測轉(zhuǎn)移試劑或工具中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了用于結(jié)腸癌預(yù)測轉(zhuǎn)移的試劑盒，所述試劑盒包括上述的用于結(jié)腸癌預(yù)測轉(zhuǎn)移的血漿miRNA的TaqMan探針組合物。

進(jìn)一步地，所述用于結(jié)腸癌預(yù)測轉(zhuǎn)移的試劑盒還包括：Taqman Universal PCR Master Mix、cDNA和H₂O。

本發(fā)明基于血清/血漿中存在上百種miRNAs，其性質(zhì)穩(wěn)定、含量豐富、易于定量檢測，且存在顯著的疾病特異性的研究發(fā)現(xiàn)，在開展miRNAs作為癌癥標(biāo)志物方面的研究時，發(fā)現(xiàn)多種miRNAs(如miR-190、miR-422a、miR-592和miR-639等)與結(jié)腸癌相關(guān)，因此，本發(fā)明以血漿作為檢測樣本，篩選出與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的特異或異常表達(dá)的miRNAs，并研制相應(yīng)的診斷試劑盒，為結(jié)腸癌患者提供特異性且快速、無創(chuàng)傷的檢測手段。

本發(fā)明中，存在于血漿中的與結(jié)腸癌相關(guān)的多種miRNA必然也存在于結(jié)腸癌細(xì)胞的外泌體中。細(xì)胞外泌體(外泌體)是細(xì)胞經(jīng)過“內(nèi)吞—融合—外排”等一系列調(diào)控過程形成并可分泌的分子直徑為40～100nm的亞細(xì)胞雙層膜囊泡，是一類細(xì)胞間信號傳遞的關(guān)鍵媒介。而且外泌體不含DNA片段，但含與其來源細(xì)胞相類似的細(xì)胞因子、生長因子等蛋白質(zhì)，以及脂質(zhì)、編碼或非編碼RNA(如miRNA)等生物活性物質(zhì)，在調(diào)控細(xì)胞生理功能方面具有重要作用。因而，本發(fā)明用于結(jié)腸癌預(yù)測轉(zhuǎn)移的血漿miRNA及其TaqMan探針組合物制備的結(jié)腸癌預(yù)測轉(zhuǎn)移試劑或工具(如，試劑盒)，也適用于以血漿外泌體作為檢測樣本，從而為結(jié)腸癌患者提供特異性且快速、無創(chuàng)傷的檢測手段。

本發(fā)明中，血漿較易獲得，性質(zhì)穩(wěn)定，無需其他組織，屬于無創(chuàng)型檢查；血漿miRNA反映的是機(jī)體整體病理以及生理情況，將其作為預(yù)測轉(zhuǎn)移標(biāo)志物，可提高檢測的準(zhǔn)確性；所述試劑盒可簡化TaqMan探針庫，提高檢測的特異性和靈敏度，更具針對性和實(shí)用性，降低了制作成本和生產(chǎn)時間；所述組合、方法、試劑盒可高效便捷的應(yīng)用于結(jié)腸癌的預(yù)測轉(zhuǎn)移。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是本發(fā)明的miR-190、miR-422a、miR-592和miR-639分別在高轉(zhuǎn)移組和低轉(zhuǎn)移組之間的表達(dá)差異圖；

圖2是本發(fā)明的miR-190、miR-422a、miR-592和miR-639各自的ROC曲線圖；

圖3為本發(fā)明的miR-190、miR-422a和miR-639組合的ROC曲線圖；

圖4為本發(fā)明的miR-190、miR-422a、miR-592和miR-639組合的ROC曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1

本實(shí)施例1的一種用于結(jié)腸癌預(yù)測轉(zhuǎn)移的血漿miRNA組合，所述miRNA組合包括以下miRNA中一種或者其中至少兩種的組合：miR-190、miR-422a、miR-592、miR-639。

優(yōu)選的血漿miRNA組合樣品1為：miR-190、miR-422a和miR-639的組合。

優(yōu)選的血漿miRNA組合樣品2為：miR-190、miR-422a、miR-592和miR-639的組合。

本實(shí)施例1的血漿miRNA組合的篩選過程如下：

(1)分別收集結(jié)腸癌患者同源性高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株和低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株所分泌的外泌體，提取總RNA；

(2)采用高靈敏度、高精確性和高重復(fù)性的Affymetrix全轉(zhuǎn)錄本芯片技術(shù)進(jìn)行miRNAs檢測，篩選出與轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異表達(dá)的一組miRNAs；該組miRNAs包括9種miRNAs中篩選出在高轉(zhuǎn)移組和低轉(zhuǎn)移組患者中表達(dá)差異顯著的miRNAs；如表1中所示；

(3)用實(shí)時熒光定量PCR方法(TaqMan探針法)對一組標(biāo)本進(jìn)行逐個檢測，從Affymetrix全轉(zhuǎn)錄本芯片技術(shù)初篩出的miRNA中復(fù)篩出表達(dá)差異顯著的miRNAs；

(4)進(jìn)一步用定量PCR方法對大批量標(biāo)本進(jìn)行逐個驗(yàn)證，篩選出穩(wěn)定的表達(dá)差異顯著的一組miRNAs，如表2和圖1所示。

表1為采用Affymetrix全轉(zhuǎn)錄本芯片技術(shù)初篩出的高轉(zhuǎn)移組和低轉(zhuǎn)移組血漿中差異表達(dá)的miRNAs。

表1

表2為定量PCR方法復(fù)篩出的miRNAs。

表2

由表2可知，初篩出的9種miRNAs中有4種miRNAs在2組樣本間存在差異(絕對含量表示方法為均值±標(biāo)準(zhǔn)差，p<0.001)。

本實(shí)施例1中，對篩選出的miRNA的進(jìn)行臨床價值評估。從miRNA的表達(dá)調(diào)節(jié)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的角度，對結(jié)腸癌患者在高轉(zhuǎn)移組和低轉(zhuǎn)移組中miRNAs表達(dá)水平進(jìn)行分析。分析發(fā)現(xiàn)，miR-190、miR-422a、miR-592和miR-639四種miRNAs在兩組人群中的表達(dá)存在顯著差異，并進(jìn)一步對篩選出的miRNA運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行臨床價值分析。結(jié)果顯示miR-190、miR-422a、miR-592和miR-639中的任意兩種或三種或四種組合的診斷準(zhǔn)確性遠(yuǎn)高于其中任一種單獨(dú)作用，選取比較有代表性的列出，如圖2，圖3，圖4。

實(shí)施例2

本實(shí)施例2的一種用于結(jié)腸癌預(yù)測轉(zhuǎn)移的血漿miRNA的TaqMan探針組合物，所述TaqMan探針組合物包括以下miRNA的TaqMan探針中的一種或者其中至少兩種的組合：miR-190的TaqMan探針、miR-422a的TaqMan探針、miR-592的TaqMan探針、miR-639的TaqMan探針。

上述的四種miRNAs的TaqMan探針的具體內(nèi)容如下表3所示。

表3

優(yōu)選的所述血漿miRNA的TaqMan探針組合物為miR-190、miR-422a和miR-639的TaqMan探針組合物。

優(yōu)選的所述血漿miRNA的TaqMan探針組合物為miR-190、miR-422a、miR-592和miR-639的TaqMan探針組合物。

實(shí)施例3

本實(shí)施例3為用于結(jié)腸癌預(yù)測轉(zhuǎn)移的試劑盒，所述試劑盒包括上述實(shí)施例2中的用于結(jié)腸癌預(yù)測轉(zhuǎn)移的血漿miRNA的TaqMan探針組合物；還包括：Taqman Universal PCR Master Mix、cDNA和H₂O。

具體地，本實(shí)施例3給出了一種具體的試劑盒組成：10μl Taqman Universal PCR Master Mix，1μl TaqMan探針溶液，9μl cDNA和H₂O的混合溶液。

所制備試劑盒的具體操作流程如下：

(1)收集受試者的血漿外泌體樣本，提取RNA后逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA樣品；

(2)按照上述配方加樣；

(3)進(jìn)行PCR反應(yīng)，條件為95℃、30s進(jìn)行一個循環(huán)；95℃、3s，60℃、30s進(jìn)行40個循環(huán)。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)所述以權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。