本發(fā)明屬于分子生物學分子標記領域，尤其涉及甘薯SSR引物對的開發(fā)及其在品種鑒定中的應用。
背景技術：
：甘薯(Ipomoeabatatas(L.)Lam.)屬于旋花科(Convolvulaceae)、甘薯屬(Ipomoea)、甘薯組(SectionBatatas)同源六倍體植物，廣泛種植于世界上100多個國家和地區(qū)，年種植面積802.99萬hm2，年總產(chǎn)量10445.94萬噸，在世界糧食生產(chǎn)中甘薯總產(chǎn)量排在第7位，是重要的糧食、飼料、工業(yè)原料及新型能源用塊根植物。中國作為世界上最大的甘薯生產(chǎn)國，年種植面積約338.29萬hm2，占世界總種植面積的42.13％，年總產(chǎn)量7096.36萬噸，占世界總產(chǎn)量的67.93％(FAO,2014)。甘薯品種數(shù)量繁多，而高頻率地使用少數(shù)骨干親本育種造成了甘薯的遺傳基礎趨于狹隘，使得通過表型性狀來鑒定、區(qū)別不同甘薯品種難上加難。隨著分子生物學技術的發(fā)展，實現(xiàn)了DNA分子標記在基因水平對甘薯品種進行鑒定，此方法較表型性狀鑒定法更為準確有效，為甘薯品種鑒定提供了新的途徑。SSR、AFLP、RAPD等分子標記均可用于甘薯遺傳多樣性分析，其中SSR分子標記較其它標記具有以下優(yōu)點：(1)數(shù)量豐富，廣泛分布于整個基因組；(2)實驗重復性較好，結果可靠；(3)具有較多的等位性變異；(4)對DNA質量要求低，用量少，不需使用同位素；(5)共顯性標記，可以鑒別雜合子和純合子的基因型。因此，SSR分子標記可以高效準確地應用于甘薯指紋圖譜的構建。目前已公布的甘薯SSR分子標記中，高效、多態(tài)的標記較少，盲目地使用SSR分子標記對甘薯品種進行鑒定不僅費時費力，也難以得到準確的鑒定結果。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的第1個目的是提供甘薯SSR引物對。本發(fā)明提供鑒定甘薯品種的成套SSR引物，由引物對1-引物對7組成，所述引物對1為如下1)或2)：1)由序列表中序列1所示的單鏈引物和序列表中序列2所示的單鏈引物組成；2)由與序列1所示的單鏈引物至少具有70％同源性的單鏈DNA分子和與序列2所示的單鏈引物至少具有70％同源性的單鏈DNA分子組成；所述引物對2為如下1)或2)：1)由序列表中序列3所示的單鏈引物和序列表中序列4所示的單鏈引物組成；2)由與序列3所示的單鏈引物至少具有70％同源性的單鏈DNA分子和與序列4所示的單鏈引物至少具有70％同源性的單鏈DNA分子組成；所述引物對3為如下1)或2)：1)由序列表中序列5所示的單鏈引物和序列表中序列6所示的單鏈引物組成；2)由與序列5所示的單鏈引物至少具有70％同源性的單鏈DNA分子和與序列6所示的單鏈引物至少具有70％同源性的單鏈DNA分子組成；所述引物對4為如下1)或2)：1)由序列表中序列7所示的單鏈引物和序列表中序列8所示的單鏈引物組成；2)由與序列7所示的單鏈引物至少具有70％同源性的單鏈DNA分子和與序列8所示的單鏈引物至少具有70％同源性的單鏈DNA分子組成；所述引物對5為如下1)或2)：1)由序列表中序列9所示的單鏈引物和序列表中序列10所示的單鏈引物組成；2)由與序列9所示的單鏈引物至少具有70％同源性的單鏈DNA分子和與序列10所示的單鏈引物至少具有70％同源性的單鏈DNA分子組成；所述引物對6為如下1)或2)：1)由序列表中序列11所示的單鏈引物和序列表中序列12所示的單鏈引物組成；2)由與序列11所示的單鏈引物至少具有70％同源性的單鏈DNA分子和與序列12所示的單鏈引物至少具有70％同源性的單鏈DNA分子組成；所述引物對7為如下1)或2)：1)由序列表中序列13所示的單鏈引物和序列表中序列14所示的單鏈引物組成；2)由與序列13所示的單鏈引物至少具有70％同源性的單鏈DNA分子和與序列14所示的單鏈引物至少具有70％同源性的單鏈DNA分子組成。至少具有70％同源性為大于95％同源性或大于98％同源性。7個引物對均獨立包裝。本發(fā)明第2個目的是提供鑒定甘薯品種的成套PCR試劑。本發(fā)明提供的成套PCR試劑，由7個PCR試劑組成，每個PCR試劑中含有上述1個引物對；每個PCR試劑中各個引物對中各條引物的摩爾比為1:1；或每個PCR試劑中各個引物對中各條引物的濃度為10umol/l。含有上述的引物或上述的PCR試劑的試劑盒也是本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明第3個目的是提供制備上述成套引物的方法。本發(fā)明提供的方法，包括將所述引物對組中的所述7個引物對分別單獨包裝的步驟。各條引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。本發(fā)明第4個目的是提供制備上述成套PCR試劑的方法。本發(fā)明提供的方法，包括將所述成套PCR試劑中的所述7種PCR試劑分別單獨包裝的步驟。上述的引物或上述的PCR試劑或上述的試劑盒在鑒定甘薯品種中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明第5個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定甘薯品種的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：用上述的引物中的7個引物對分別對甘薯品種進行SSR擴增，得到不同甘薯品種7個SSR擴增產(chǎn)物；電泳檢測不同甘薯品種7個SSR擴增產(chǎn)物，若不同甘薯品種中某兩個甘薯品種的7個SSR擴增產(chǎn)物中至少2個擴增帶型不同，則該兩品種為或候選為不同品種；若不同甘薯品種中某兩個甘薯品種的7個SSR擴增產(chǎn)物中小于2個擴增帶型不同，則該兩品種為或候選為相同品種。本發(fā)明第6個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定甘薯品種的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：用上述的引物中的7個引物對分別對甘薯品種進行SSR擴增，得到不同甘薯品種7個SSR擴增產(chǎn)物；電泳檢測所述不同甘薯品種7個SSR擴增產(chǎn)物，將所述不同甘薯品種的7個SSR擴增產(chǎn)物分別以“1”表示條帶有且“0”表示條帶無，構建7個分子指紋圖譜，每個分子指紋圖譜對應1個SSR擴增產(chǎn)物和1個引物對；若不同甘薯品種中某兩個甘薯品種的7個分子指紋圖譜中至少2個不同，則該兩品種為或候選為不同品種；若不同甘薯品種中某兩個甘薯品種的7個分子指紋圖譜中小于2個不同，則該兩品種為或候選為相同品種。上述方法中，所述SSR擴增的退火溫度為56.8℃-59℃。上述方法中，所述SSR擴增的模板為基因組DNA。上述甘薯品種為表3所示的甘薯品種。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明利用7對多態(tài)性豐富的SSR引物對甘薯品種進行遺傳多樣性分析，與表型鑒定方法相比更加準確。而且本方法采用的是普通引物進行擴增并用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，與熒光標記引物的毛細管電泳檢測方法相比更經(jīng)濟實惠易于操作。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、利用7對SSR引物鑒定甘薯品種的方法的建立一、7對SSR引物對組合選擇表1所示的7對SSR引物進行鑒定實驗。表17對SSR引物人工合成上述引物對1-引物對7。其中，SP1的正向引物對應序列表中的1號序列,反向引物對應序列表中的2號序列；SP2的正向引物對應序列表中的3號序列，反向引物對應序列表中的4號序列；SP3的正向引物對應序列表中的5號序列，反向引物對應序列表中的6號序列；SP4的正向引物對應序列表中的7號序列，反向引物對應序列表中的8號序列；SP5的正向引物序列對應序列表中的9號序列，反向引物對應序列表中的10號序列；SP6的正向引物對應序列表中的11號序列，反向引物對應序列表中的12號序列；SP7的正向引物對應序列表中的13號序列，反向引物對應序列表中的14號序列。二、用于鑒定甘薯品種的方法建立1、甘薯品種的DNA提取參照改良的CTAB法，具體操作如下：1)選取不同甘薯品種的潔凈、幼嫩、無病蟲害葉片4-6片，液氮速凍，置于-80℃冷凍保存。2)將冷凍的葉片放入預冷的研缽中，加入PVP少許，在液氮冷凍狀態(tài)下，迅速研磨成粉末后轉入10mL的離心管中，約為離心管容量的1/3。3)之后迅速加入3mL已預熱好的CTAB提取液【CTAB(20g/L)，NaCl(1.4mol/L)，EDTA(10mmol/L)，三羥甲基氨基甲烷(100mmol/L)，β-巰基乙醇(20ml/L)，pH8.0】，并放入65℃水浴鍋預熱，保溫30～60min，期間上下輕晃數(shù)次。4)加入3-4mL氯仿:異戊醇(24:1)混合液，上下顛倒300～500次混勻直至呈乳白色，15～20℃，11000rpm離心15min。5)取上清，加入2mL氯仿:異戊醇(24:1)混合液，上下顛倒100-200次混勻，4℃，11000rpm離心15min。6)取上清，加0.6倍上清液體積的預冷的異丙醇，水平搖均，放于4℃冰箱靜置30min，有白色DNA絮狀物析出，用毛細玻璃管挑出，70％乙醇漂洗2次，轉入1.5mL離心管中自然干燥。7)將干燥的DNA溶于100μL0.1×TE緩沖液中【EDTA(0.1mmol/L)、Tris(1mmol/L)，pH8.0】，短期4℃或-20℃保存，長期放入-80℃冰箱中儲存。8)少量DNA用于0.8％瓊脂糖膠的電泳檢測其純度，以l×TBE【Tris(10.8g/L)、硼酸(5.5g/L)、EDTA(0.744g/L)，pH8.3】為電泳緩沖液，100V穩(wěn)壓電泳30min；將1μLDNA原液在紫外分光光度計上測定DNA濃度及OD260/OD280。并稀釋到50ng/μL待用。根據(jù)上述方法得到不同甘薯品種的基因組DNA。2、甘薯材料的SSR-PCR擴增利用上述一的7對SSR引物對甘薯品種的基因組DNA進行PCR擴增，反應體系和程序如下：1)PCR擴增體反應體系的總體積和組分的終濃度參照表2進行配置，可以根據(jù)實驗條件不同做出相應調整。試劑由北京全式金生物技術有限公司提供，AP111-13、AD101-12。表2PCR擴增反應體系反應組分原濃度終濃度反應體積(20.0μL)10×PCRBuffer(含MgCl2)10×1×2.0μLdNTP10mmol/L0.4μmol/μL0.8μLTaqE5U/μL0.05U/μL0.2μLSSR正向引物10μmol/L0.5μmol/μL1.0μLSSR反向引物10μmol/L0.5μmol/μL1.0μLDNA50ng/μL7.5ng/μL3.0μLddH2O--12.0μL2)反應程序：94℃預變性5min；94℃變性30s，56.8℃～59℃(依據(jù)引物的退火溫度改變)退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。根據(jù)上述方法得到不同甘薯品種的7種SSR擴增產(chǎn)物。3、電泳并構建指紋圖譜1)電泳將上述不同甘薯品種的7種SSR擴增產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳，具體如下：使用JY-CX2A型電泳槽(北京君意華鑫可以有限公司)，操作步驟如下：1)凝膠附著板的處理：仔細刷洗玻璃板，蒸餾水沖洗干凈，豎置晾干。將玻璃板水平放置，利用95％乙醇縱向橫向各擦拭板面3次。5min后，用親和硅烷溶液(親和硅烷:95％乙醇＝1:250，V/V)擦拭板面3次(擦拭方式同上)，晾置5min后備用。2)凝膠背板的處理：仔細刷洗背板，蒸餾水沖洗干凈，水平放置晾干。用95％乙醇縱向橫向各擦拭板面表面3次，晾置5min。再用剝離硅烷溶液(剝離硅烷:95％乙醇＝1:49，V/V)擦拭背板表面3次(擦拭方式同上)，晾置5min后備用。3)灌膠：將間隔條、附著板和背板組裝成凝膠夾層裝置，水平放置，用夾子在兩側夾好；量取50mL6％變性聚丙烯酰胺凝膠溶液【尿素(210g/L)，45％聚丙烯酰胺凝膠(133mL/L)，10×TBE(100mL/L)】，加入100μL20％APS(過硫酸銨20g/100mL)和50μLTEMED，混勻后利用灌膠瓶將其灌入夾層中，鯊魚齒梳子倒插入兩板之間，室溫下放置1～1.5h使凝膠凝固。4)預電泳：凝膠聚合后，卸下夾子，將凝膠裝置安裝于電泳槽上，加入1000mL左右的1×TBE緩沖液，液面高度需沒過膠面一定高度。拔出鯊魚齒梳子。同時，電泳槽中加入400mL左右的1×TBE緩沖液。打開電泳儀，恒功率為65W，預電泳約20～30min。5)樣品的制備：將PCR擴增產(chǎn)物加入5～10μL上樣緩沖液【溴酚藍(0.04～0.05g)、二甲苯青(0.04～0.05g)、去離子甲酰胺(98mL)、0.5mol/LEDTA(2mL)】離心混勻。95℃變性5min后迅速放于冰水混合物中冷卻待用。6)電泳：預電泳結束后，暫停電泳儀，用吸管吹打膠面，去除碎膠和尿素，避免堵塞點樣孔，以使條帶整齊。將梳子輕輕插入膠面1～2mm，取適量樣品(4.5～6.5μL)點入泳道，恒功率65W，開始電泳。約1h后，待二甲苯青指示劑條帶跑至膠板的最下層時，終止電泳。7)銀染：①固定，將兩層玻璃板從電泳裝置上卸下，拆開兩層玻璃板，后將附著膠的玻璃板膠面朝上放入2L固定液【蒸餾水(1790mL)，無水乙醇(200mL)、冰醋酸(10mL)】中，置于轉速50～60rpm的搖床上輕搖20min左右，至指示劑顏色消失。②漂洗，從固定液中取出凝膠玻璃板，用去離子水漂洗3min。③染色，取出凝膠玻璃板置于2L硝酸銀溶液【硝酸銀(6g)、蒸餾水(2000mL)】中，于轉速50～60rpm的搖床上輕搖30～40min，使染色充分。④漂洗。取出凝膠玻璃板放入2L去離子水中，漂洗30～60s。⑤顯色，取出凝膠玻璃板放入2L顯色液【氫氧化鈉(30g)、甲醛溶液(6mL)、去離子水(2000mL)】中，于轉速60rpm的搖床上顯色約4～7min，至DNA條帶清晰，完全顯現(xiàn)。⑥漂洗，取出凝膠玻璃板置于2L蒸餾水中漂洗3min，取出后放置于干燥處，晾干后用于后續(xù)標記讀取。注：45％聚丙烯酰胺凝膠：丙烯酰胺434g/L，N,N-亞甲雙丙烯酰胺16g/L。10×TBE：Tris108g/L、硼酸55g、EDTA7.44g/L。0.5mol/LEDTA：稱取18.61g的EDTANa2·2H2O溶于水中，調pH至8.0，加水定容至100mL。2)構建SSR指紋圖譜將甘薯品種同一SSR位點擴增片段的帶型和遷移位置進行比較，在相同遷移位置上，擴增帶型以“1”、“0”分別表示條帶的有無，構建“1”、“0”矩陣。對每對引物(SP1-SP2)的擴增結果進行統(tǒng)計分析，構建甘薯品種的SSR分子指紋圖譜，進行甘薯品種的鑒定。若兩個甘薯品種的7對SSR引物擴增產(chǎn)物中不少于2個擴增帶型不同，則判定該兩個品種為或候選為不同品種；若兩個甘薯品種的7對SSR引物擴增產(chǎn)物中少于2個擴增帶型不同，則判定該兩個品種為或候選為相同品種。實施例2、7對SSR引物對在鑒定甘薯品種中的應用1、甘薯品種的DNA提取采用實施例1的二的1的方法提取表3所示的201個全國甘薯品種的基因組DNA；2、甘薯材料的SSR-PCR擴增以上述201個甘薯品種基因組DNA為模板，利用實施例1的一的7對SSR引物分別進行PCR擴增，得到201個甘薯品種的7對SSR引物的擴增產(chǎn)物。3、電泳并構建指紋圖譜將上述201個甘薯品種的7對SSR引物的擴增產(chǎn)物按照實施例1的二的3的方法進行電泳并構建SSR指紋圖譜，結果如表3所示：表3201個甘薯品種的SSR指紋圖譜*數(shù)字(1：有，0：無)表示品種DNA利用SSR引物進行擴增，在6％變性聚丙烯酰胺凝膠上所得到的條帶。在GeneRulerTM100bpDNALadder標準下，條帶的近似大小依次為:SP1:1000,990,980,970,960,640,610,560,550,530和330bp.SP2:680,670,660,620,450,310和260bp.SP3:860,850,800,780,750,730,710,400,360,330和310bp.SP4:920,890,830,820,810,780,750,740,720,700,660,650,640,630,605,595,580,480,420,380,340,330,320,310,295,280和250bp.SP5:1150,1050,850,800,415,400,340,290和240bp.SP6:705,560,520,500和395bp.SP7:1250,1230,1070,1000,950,940,910,840,820,800,790,750,550,450和440bp.SSR指紋圖譜結果表明上述任意甘薯品種的7對SSR引物擴增產(chǎn)物中有不少于2個擴增帶型不同，故判定上述任意品種為或候選為不同品種。由表3可知，通過本發(fā)明的方法可以將這201個甘薯品種區(qū)別鑒定。當前第1頁1 2 3