專利名稱：藍(lán)細(xì)菌血紅蛋白基因及其在促進(jìn)微生物及植物生長中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域。更具體的說，本發(fā)明涉及一種促進(jìn)微生物和植物生長的基因以及含有該基因具有加速生長的轉(zhuǎn)化體及其進(jìn)一步涉及培育生長周期短的轉(zhuǎn)基因油菜。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的抗生素工業(yè)以及近年來發(fā)展的基因工程菌高密度培養(yǎng)，都遇到發(fā)酵設(shè)備的供氧能力與生產(chǎn)菌株對(duì)氧的需求量之間的矛盾。氧是好氣性微生物進(jìn)行能量代謝的重要物質(zhì)，在正常狀態(tài)下,空氣中的氧在培養(yǎng)基中的溶解度大約只有
0.25mol/m3左右，而培養(yǎng)液中的氧還須經(jīng)過氣膜、液膜、細(xì)胞團(tuán)塊、細(xì)胞膜等一系列傳遞過程最后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)到達(dá)呼吸鏈，此過程需要克服相當(dāng)大的阻力，供氧己成為微生物工業(yè)中提高產(chǎn)品產(chǎn)量的主要限制因素之一。目前，提高供氧水平通常從設(shè)備和操作角度考慮，例如，改進(jìn)發(fā)酵罐設(shè)計(jì)、通氣攪拌優(yōu)化配置、輸入富氧或純氧或加入化學(xué)物質(zhì)增加液相中氧氣的溶解度等。這些方法都著眼于提高溶氧(DO)水平或氣液傳質(zhì)系數(shù)，雖然有一定效果,但都不同程度地受到設(shè)備、能源或操作條件的制約，同時(shí)也使發(fā)酵工業(yè)成為一個(gè)高能耗的工業(yè)。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，在以溶氧為限制條件的生物反應(yīng)器中，尤其是在
大規(guī)模、高密度微生物發(fā)酵和動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)解決供氧問題領(lǐng)域，運(yùn)用基因工程改造微生物，獲得利用氧能力增加的基因工程菌株是解決上述問題的有效策略和手段。
在農(nóng)業(yè)方面，尤其在我國耕地面積有限的條件下，如何利用冬置閑田，對(duì)于提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)量具有重要意義。油菜是我國最重要的油料作物之一，"雙低"菜籽油中Q8不飽和脂肪酸含量高(60%以上)，是一種健康的食用油；低芥酸菜籽油的脂肪酸碳鏈長度和結(jié)構(gòu)接近化石柴油，是一種適宜于生產(chǎn)生物柴油的植物油，已被歐美各國作為解決全球能源短缺的重要原料作物。雖與大豆、向日葵等夏季油料作物相比，油菜是越冬作物，但因油菜生長周期較長，在一定程度上與其他主要糧食作物如水稻生產(chǎn)周期相沖突，如果能夠培育出生長周期較短的油菜品種，則能夠充分地利用南方大量的冬置閑田，就會(huì)解決上述矛盾，從而會(huì)大大地提高油菜產(chǎn)量。
研究表明，血紅蛋白都能夠與氧可逆性地結(jié)合并運(yùn)輸，從而能夠促進(jìn)生物的生長與發(fā)育。透明顫菌血紅蛋白(VHb)能在限氧條件下，顯著促進(jìn)大腸桿菌和釀酒酵母細(xì)胞生長，提高蛋白質(zhì)合成能力，增加目的產(chǎn)物的產(chǎn)量；1997年，Holmberg等將透明顫菌(Vitreoscilla)的血紅蛋白基因轉(zhuǎn)化煙草后，能促進(jìn)煙草的生長、提高煙草葉中葉綠素與尼古丁的含量等，并且花期明顯提前。血紅蛋白存在于動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌和藻類等生物體內(nèi)，分析多種生物的血紅蛋白氨基酸序列顯示，它們擁有一個(gè)由"three-on-three"三明治式的a-螺旋組成的保守結(jié)構(gòu)。這一結(jié)果說明幾乎所有的血紅蛋白均來自一個(gè)共同的血紅蛋白袓先。
為了解決上述在工業(yè)和農(nóng)業(yè)中的問題，我們克隆出藍(lán)細(xì)菌SynechocystisspJPCC6803的血紅蛋白基因，并應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)證明了這個(gè)血紅蛋白基因具有促進(jìn)微生物和植物生長的功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種促進(jìn)微生物和植物生長的基因SLR2097，該基因具有如SEQ.ID.No.l所示的核苷酸序列。本專利采用分子生物學(xué)方法從藍(lán)細(xì)菌Synechocystis sp.PCC 6803的基因組DNA中克隆出了血紅蛋白基因SLR2097,速度快、效率高。該基因能夠促進(jìn)微生物和植物生長，對(duì)培育高密度發(fā)酵菌株和生長周期短的作物有重要意義。
本發(fā)明還在于構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-30a-SLR2097和酵母表達(dá)載體pYES2-SLR2097，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌和酵母，獲得了表達(dá)菌株，在以溶氧為限制條件和高密度微生物發(fā)酵領(lǐng)域有重要意義。
本發(fā)明還在于構(gòu)建了植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1300-CaMV35S-SLR2097并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，將其轉(zhuǎn)化擬南芥和油菜，作物生長明顯加快。油菜轉(zhuǎn)化株種子萌發(fā)明顯加快，開花也明顯提前。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)如下
根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的藍(lán)細(xì)菌血紅蛋白基因的序列(8八000022.2)設(shè)計(jì)引物，用藍(lán)細(xì)菌Synechocystis sp.PCC 6803的基因組DNA作為模板，從藍(lán)細(xì)菌中克隆了血紅蛋白基因SLR2097。
為了檢測該基因?qū)?xì)菌生長的影響，PCR和酶切鑒定正確的SLR2097陽性重組克隆質(zhì)粒用KpnI和BamHI雙酶切后，回收目的片段SLR2097，并與同樣雙酶切回收的大腸桿菌原核表達(dá)載體pET-30a在16t:連接過夜，獲得陽性重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-SLR2097。用熱激法將構(gòu)建好的pET-30a-SLR2097轉(zhuǎn)化大腸桿菌E coli DH5a感受態(tài)，然后測驗(yàn)表達(dá)藍(lán)細(xì)菌血紅蛋白基因的大腸桿菌的生長曲線，發(fā)現(xiàn)該基因?qū)Υ竽c桿菌的生長有顯著促進(jìn)功能。
為了檢測該基因?qū)湍干L的影響，用上述同樣的方法構(gòu)建了酵母表達(dá)載體pYES2-SLR2097。將酵母表達(dá)載體pYES2-SLR2097轉(zhuǎn)化酵母PEP4感受態(tài)。然后測驗(yàn)表達(dá)藍(lán)細(xì)菌血紅蛋白基因的酵母的生長曲線，發(fā)現(xiàn)該基因?qū)湍傅纳L有顯著促進(jìn)功能。
為了進(jìn)一步檢測該基因?qū)χ参锷L的影響，我們構(gòu)建了植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1300-CaMV35S-SLR2097，并將其轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，用floral-dip法
轉(zhuǎn)化擬南芥和油菜，并調(diào)査轉(zhuǎn)基因植物生長情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因?qū)M南芥和油菜生長有明顯的促進(jìn)作用，另外，轉(zhuǎn)基因油菜種子表現(xiàn)出萌發(fā)提前，花期也有所提前。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
1、 從藍(lán)細(xì)菌的基因組DNA中克隆血紅蛋白基因速度快、效率高。
2、 本發(fā)明克隆的血紅蛋白基因SLR2097在低氧條件下對(duì)大腸桿菌、酵母的生長有明顯的促進(jìn)功能，在以溶氧為限制條件的生物反應(yīng)器中，尤其是在大規(guī)模、高密度微生物發(fā)酵和動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)解決供氧問題領(lǐng)域有重要意義。
3、 本發(fā)明將植物雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)出明顯的生長加快，對(duì)研究該基因在植物中的生物學(xué)功能有重要意義。
4、 本發(fā)明還將植物雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)化了油菜，轉(zhuǎn)基因植株種子萌發(fā)有所提前，花期也明顯提前，為解決油菜生長周期與其他主要糧食作物生產(chǎn)周期相沖突而導(dǎo)致全國大量農(nóng)田冬季閑置問題提供了新方法。


圖l從藍(lán)細(xì)菌Synechocystissp.PCC6803中擴(kuò)增SLR2097基因。M: marker; 1-2:血紅蛋白DNA片段的擴(kuò)增。
圖2氧氣含量極度缺乏情況下，SLR2097轉(zhuǎn)基因菌株與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ站甑纳L曲線。
圖3氧氣充足的情況下，SLR2097轉(zhuǎn)基因菌株與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ站甑纳L曲線。圖4 SLR2097轉(zhuǎn)基因酵母和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ站甑纳L曲線。圖5雙元表達(dá)載體pCAMBIA1300-CaMV35S-SLR2097轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101的鑒
定。M: marker; 1-2:血紅蛋白DNA片段的擴(kuò)增;+:陽性對(duì)照；-:陰性對(duì)照。
圖6抗生素篩選擬南芥轉(zhuǎn)基因植株。
圖7轉(zhuǎn)基因擬南芥與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甑纳L比較。
圖8轉(zhuǎn)基因油菜與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甑纳L比較。
圖9在24h時(shí)，轉(zhuǎn)基因油菜種子與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ辗N子的萌發(fā)率。
圖IO在48h時(shí)，轉(zhuǎn)基因油菜種子與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ辗N子的胚根生長比較。
圖ll在72h時(shí)，轉(zhuǎn)基因油菜種子與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ辗N子的胚根長度比較。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明， 一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。
下面結(jié)合具體的實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。
本發(fā)明實(shí)施例中涉及的由發(fā)明人保存的生物材料，均可向公眾提供20年。
本發(fā)明中所使用到的微生物以及載體來源如下
1、 藍(lán)細(xì)菌Synechocystis sp.PCC 6803由江蘇大學(xué)環(huán)境學(xué)院寧德剛教授提供。
2、 pYES2由美國華盛頓州立大學(xué)的J. I. Gordon教授提供。
3、 大腸桿菌DH5a來源于江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院。
4、 PEP4細(xì)胞的尿嘧啶缺陷型來源于江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院。5、 載體pET-30a來源于江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院。
6、 載體pCAMBIA1300來源于江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院。
7、 農(nóng)桿菌GV3101來源于江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院。
8、 農(nóng)桿菌LBA4404來源于江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院。
9、 pMD18-T來源于TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司。實(shí)施例一藍(lán)細(xì)菌血紅蛋白基因SLR2097的克隆
根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中血紅蛋白基因的序列(BA000022.2)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，正向引物HemoglobinF為[5'-ggtaccATGTCAACTTTGTATG-3']，反向引物HemoglobinR為[5'-ctgcag TCACTGATTAAGCACG-3']，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。用藍(lán)細(xì)菌Synechocystis sp.PCC 6803的基因組DNA作為模板,PCR體系含l^iL的DNA模板，2pL的dNTP(終濃度為2mmol/L)， 2jiL的10xPCR緩沖液，HemoglobinF、 HemoglobinR各lML， 0.2nL的LA-Taq酶，用超純水補(bǔ)足總體積20 pL。反應(yīng)程序?yàn)?4。C預(yù)變性5 min;94。C變性40 sec， 57。C退火40 sec， 72。C延伸40sec;40個(gè)循環(huán)；最后72'C延伸10 min。
PCR產(chǎn)物進(jìn)行1X瓊脂糖凝膠電泳(如圖l所示)，切膠回收目的片段，直接與pMD-18T Simple Vector 16。C連接過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞EcoliDH5a，經(jīng)PCR和酶切鑒定確定陽性重組質(zhì)粒，并由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，核苷酸序列如SEQ.ID.No.l所示。
實(shí)施例二原核表達(dá)載體pET-30a-SLR2097和酵母表達(dá)載體pYES2-SLR2097的構(gòu)建
以上PCR和酶切鑒定正確的陽性重組克隆質(zhì)粒分別用Kpnl和BamHI雙酶切后，回收目的片段SLR2097，并與同樣雙酶切回收的表達(dá)載體pET-30a在16。C連接過夜，并將獲得的陽性重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pET-30a-SLR2097。將口￡1-3(^-SLR2097轉(zhuǎn)化感受態(tài)EcoliDH5a菌株，同時(shí)轉(zhuǎn)化pET-30a空載體作為對(duì)照，提取質(zhì)粒，PCR和雙酶切鑒定。
用Kpnl和BamHI雙酶切后的表達(dá)載體pYES2與鑒定正確后回收的目的片段SLR2097在16t連接過夜，并將獲得的陽性重組表達(dá)質(zhì)粒pYES2-SLR2097轉(zhuǎn)化酵母菌PEP4感受態(tài)細(xì)胞，PEP4是一個(gè)水解蛋白酶缺陷型菌株，含有少量相關(guān)的主要水解酶的細(xì)胞。因此，血紅蛋白能夠相對(duì)提高蛋白含量。同時(shí)轉(zhuǎn)化pYES2空載體作為對(duì)照。生長到對(duì)數(shù)期中后期的酵母細(xì)胞分別涂布到DOBA培養(yǎng)基上，30'C培養(yǎng)2 4 d。挑取單菌落到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基(2。/。 bacteriological peptone,1% yeast extract)中培養(yǎng)12h，收集菌體用含2。/。半乳糖不含葡萄糖的YPD液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)12-16h。
實(shí)施例三:藍(lán)細(xì)菌血紅蛋白基因顯著促進(jìn)大腸桿菌和酵母的生長為了驗(yàn)證該血紅蛋白基因在氧含量發(fā)生變化時(shí)對(duì)生物生長的影響，我們按Sambrook的方法，將含有藍(lán)細(xì)菌血紅蛋白基因的原核表達(dá)載體pET-30a轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株DH5a中。在密封搖動(dòng)狀態(tài)(氧氣極度缺)和搖動(dòng)狀態(tài)(氧氣充足)狀態(tài)下控制接種量使各組合一致；除了氧氣含量外，各生長條件一致，重復(fù)三次。分別繪制細(xì)菌的生長曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在氧氣含量極度缺乏(氧脅迫)情況下(密封搖動(dòng)狀態(tài)，37°C， 300r/min)， SLR2097的轉(zhuǎn)基因菌株長勢明顯好于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?含有無SLR2097的空載體DH5a菌株)菌株，在對(duì)數(shù)生長期，SLR2097的轉(zhuǎn)基因菌株比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ站晟L明顯加快(圖2所示)， 而在氧氣含量充足條件下(搖動(dòng)狀態(tài)，37°C， 300 r/min), SLR2097的轉(zhuǎn)基因菌株比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ站晟L也稍微加快(圖3所示)。在上述兩種情況下，SLR2097的轉(zhuǎn)基因菌株及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ站甓家匝醭渥銜r(shí)的生長好，氧脅迫時(shí)生長弱。
我們同時(shí)將含有藍(lán)細(xì)菌血紅蛋白基因的酵母表達(dá)載體pYES2轉(zhuǎn)入酵母菌株P(guān)EP4中，在密封搖動(dòng)狀態(tài)(氧氣極度缺乏)和搖動(dòng)狀態(tài)(氧氣充足)狀態(tài)下控制接種量使各組合一致;除了氧氣含量外，各生長條件一致，重復(fù)三次。分別繪制細(xì)菌的生長曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在兩種狀態(tài)下，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ站晗啾萐LR2097的轉(zhuǎn)基因菌株生長較快(如圖4所示)。
實(shí)施例四雙元表達(dá)載體pCAMBIA1300-CaMV35S-SLR2097的構(gòu)建將質(zhì)粒載體pCAMBIA1300與CaMV35S-sGFP(S65T)-nos3'用BamHI與Xbal進(jìn)行雙酶切。用試劑盒回收大約8 950bp與400bp的DNA片段，然后用T4DNA連接酶將二者連接。用同樣的方法將SLR2097連接到載體pCAMBIA1300-CaMV35S上。
實(shí)施例五擬南芥轉(zhuǎn)化及篩選
1. 植物培養(yǎng)
擬南芥種子在4°C暗處理48h后，播種于1/3 B5培養(yǎng)液浸泡過的蛭石中，23。C連續(xù)光照，光照強(qiáng)度為80-120 Mmolm,sec'1。在培養(yǎng)基上種植時(shí)，將擬南芥種子用70%酒精表面殺菌3—5min后，用10% Bleach浸泡滅菌10-15min，無菌水洗3-4次。滅菌后的種子播于1/2 MS固體培養(yǎng)基(含2%蔗糖，0.3%phytagel)上，23。C連續(xù)光照。
2. 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
取40nl轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，加入1^1 (約300ng)構(gòu)建好的雙元表達(dá)載體pCAMBIA1300-CaMV35S-SLR2097， 2.5KV電擊轉(zhuǎn)化，然后迅速加入l毫升SOC; 28°C, 200rpm搖lh后，取200^1菌液涂布于含卡那霉素和利福平的LB固體培養(yǎng)基平板上；于28°C倒置培養(yǎng)l-2d。挑選克隆鑒定陽性菌落。通過菌落PCR鑒定農(nóng)桿菌，使用前面所用的引物，能擴(kuò)增出SLR2097長度的片斷，表明構(gòu)建的雙元表達(dá)載體已轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌GV3101。 GV3101的菌落都能擴(kuò)增出與載體一致的375bp的條帶(如圖5所示)，說明所構(gòu)建的載體已轉(zhuǎn)入到GV3101中。3.擬南芥真空滲透轉(zhuǎn)化法
擬南芥培養(yǎng)至莖高3-10cm時(shí)，去其頂生花序，刺激腋生花序的生長。繼續(xù)生長4-6天后，即可用于轉(zhuǎn)化。將陽性農(nóng)桿菌按千分之一接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中(含終濃度為5(Vg/ml的利福平和終濃度為50pg/ml的卡那霉素)；28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)48hr;然后將菌液倒入1L LB中，繼續(xù)培養(yǎng)至006()()為1.2-1.8 (約需48hr) 4000rpm室溫離心15min，收集菌體后，重懸于lL轉(zhuǎn)化液(2.2g MS; 5%sucrose; lxB5 Vitamins; 10mg/L的6-BA; SilwetL-77;用0.4MNaOH調(diào)pH至5.8)中將剪枝后4-6天的植株倒置于含轉(zhuǎn)化緩沖液的玻璃瓶中，抽真空，維持0.05Mpa壓力5min。取出種植盆，側(cè)放24hr。然后將種植盆直立，按常規(guī)的方法培育植株至結(jié)實(shí)，收獲成熟種子(Tl代)。
4.抗性植株的篩選及純系的獲得收取轉(zhuǎn)化后擬南芥T1代種子，播在含有潮霉素(30pg/ml)的1/2MS平板上篩選抗性的幼苗(如圖6所示)，轉(zhuǎn)入蛭石中，收獲T2代種子。再按株系播種于含潮霉素的平板，篩選具有3:1抗性分離比的株系，移栽抗性植株，收獲T3代種子，把T3代種子播于含潮霉素的平板上，沒有抗性分離的株系就是純系。在相同生長條件下轉(zhuǎn)基因純系植株和對(duì)照植株生長過程中，轉(zhuǎn)基因植株生長明顯比對(duì)照植株生長速度快(如圖7所示)。
實(shí)施例六油菜的轉(zhuǎn)化及篩選
1.植物材料的準(zhǔn)備自然條件下生長正常的甘藍(lán)型油菜品系寧油16號(hào)，待其生長至花期。當(dāng)油菜植株開始開花后2-3天對(duì)擬浸染的油菜植株進(jìn)行初步篩選。理想的擬浸染油菜植株應(yīng)該具有大量正在發(fā)育中花序，其花序上含有大量未開放的花蕾，和少量已經(jīng)開放的油菜花朵和授粉的角果。在進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化前需要人工去除已經(jīng)授粉的角果和花序頂端已經(jīng)開放的花朵，最終用于浸染的植株
應(yīng)該只具有未開的花蕾。植物材料的準(zhǔn)備必須在浸花前8-12小時(shí)內(nèi)完成，在浸花過程中如遇開放的花朵，需剪去后再進(jìn)行浸花實(shí)驗(yàn)。
2. 攜帶重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備
在進(jìn)行浸花實(shí)驗(yàn)前2-3天，在5mL含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中小量培養(yǎng)轉(zhuǎn)化雙元表達(dá)載體pCAMBIA1300-CaMV35S-SLR2097的農(nóng)桿菌LBA4404, 28°C 220 rpm，然后將5ml菌液接種到500mlLB培養(yǎng)基中，28°C 220rpm培養(yǎng)兩天。浸花前在菌液中加入3%的蔗糖、0.1%的Silwet L-77、 2ng/1的6-BA和8mg/1的乙酰丁香酮。
3. 浸花步驟
(1) 浸花前，檢査油菜花絮是否有盛開花朵，確認(rèn)符合浸花植物材料后，將油菜的整個(gè)花序部分浸泡在農(nóng)桿菌混合溶液中150s左右，同時(shí)輕輕晃動(dòng)花絮，使其充分蘸取菌液。浸泡過后，待花蕾上的農(nóng)桿菌菌液不再滴落，菌液又未干涸的時(shí)候，及時(shí)將完成浸花的花絮套入羊皮紙袋遮陰，袋口用回形針扎緊，持續(xù)套袋生長24h，以保持花蕾具有較高的濕度，不會(huì)因陽光暴曬而致使農(nóng)桿菌失去活性。
(2) 間隔48h重復(fù)步驟(1)，浸好的花絮依然套袋生長24h。
(4) 三次浸花結(jié)束后，去掉套在花絮上的羊皮紙袋，剪去新生出的側(cè)枝花絮以及經(jīng)過浸花的花絮其頂端新萌發(fā)的花蕾。
(5) 定期剪除新生的側(cè)枝花絮及新生花蕾，正常的澆灌培養(yǎng)植株，因?yàn)檗D(zhuǎn)化緩沖液中的蔗糖會(huì)導(dǎo)致害蟲滋生，因此還需要定期噴灑農(nóng)藥殺蟲，直到種子
成熟時(shí)收獲干種子(Tl代)。
4.抗性植株的篩選及純系的獲得
收取轉(zhuǎn)化后油菜T1代種子,用含有100mg/l潮霉素的水溶液浸泡24-36h，播種到土壤中，收獲T2代種子。再按株系用潮霉素水溶液浸泡種子播種到土壤，篩選具有3:1抗性分離比的株系，收獲T3代種子，同樣用潮霉素水溶液浸泡T3代種子播種，沒有抗性分離的株系就是純系，在相同條件下生長的轉(zhuǎn)基因植株比對(duì)照植株生長速度快，并且花期也提前一周左右(如圖8所示)。實(shí)施例七油菜種子的萌發(fā)試驗(yàn)
選取四株轉(zhuǎn)基因株系(H12、 H18、 H21、 H23) T3代種子和對(duì)照植株的進(jìn)行了萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下
用雙層濾紙培養(yǎng)，先在潔凈的直徑為9cm的培養(yǎng)皿內(nèi)底放濾紙一張，選取四株轉(zhuǎn)基因株系(H12、 H18、 H21、 H23) T3代種子和對(duì)照植株飽滿種子IOO粒擺放到濾紙上，再在種子上面蓋一張濾紙，然后每皿滴加2ml水使上層濾紙濕潤，傾斜時(shí)皿底無溶液。將培養(yǎng)皿室溫條件下暗培養(yǎng)，間隔24h統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢和發(fā)芽率，共計(jì)72h，重復(fù)三次。如果胚根出現(xiàn)就記作萌發(fā)，在萌發(fā)24h和48h時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系的萌發(fā)率顯著高于對(duì)照植株。在24h、 48h和72h，所有轉(zhuǎn)基因株系比對(duì)照植株明顯提前。如圖9所示，為24h時(shí)每個(gè)培養(yǎng)皿中種子的萌發(fā)率。48h時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系與對(duì)照植株都已經(jīng)萌發(fā)，但轉(zhuǎn)基因株系的胚根明顯比對(duì)照植株長，如圖10所示。72h時(shí)轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照植株胚根長度有顯著差異，如圖11所示。SEQUENCE LISTING<110>江蘇大學(xué)
<120>藍(lán)細(xì)菌血紅蛋白基因及其在促進(jìn)微生物及植物生長中的應(yīng)用
<130>
<160> 1
<170> Patentln version 3.3
<210> 1<211〉 375<212> DNA
<213> Synechocystis PCC6803<400> 1
atgtcaactt tgtatgaaaa attaggtgga accaccgctg tcgatctagc tgtggacaaa 60ttttacgagc gggtgttgca ggatgaccgc atcaaacatt ttttcgccga cgtggatatg 120gctaaacaac gggcccacca aaaagccttt ttaacctatg cctttggcgg tacggataaa 180tatgatggtc gctatatgcg ggaagcccac aaagagttgg tggaaaacca tggtttgaac 240ggtgaacact tcgacgcagt ggcggaggat ttgctggcaa ccttgaagga aatgggtgtt 300cccgaagatt taattgcaga agtggccgcc gtggccgggg ctccagccca taaacgggac 360gtgcttaatc agtga 375
1權(quán)利要求
1、一種表達(dá)載體，其含有SEQ.ID.No.1所示的藍(lán)細(xì)菌血紅蛋白基因SLR2097。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，是pET-30a-SLR2097。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，是酵母表達(dá)載體pYES2-SLR2097。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，是植物雙元表達(dá)載體pCAMBIAl 300-CaMV35S-SLR2097 。
5、 SEQ. ID. No.l所示的藍(lán)細(xì)菌血紅蛋白基因SLR2097在促進(jìn)微生物和植物生長中的應(yīng)用。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所說的藍(lán)細(xì)菌血紅蛋白基因SLR2097在促進(jìn)微生物生長中的應(yīng)用，其特征在于，是先構(gòu)建含藍(lán)細(xì)菌血紅蛋白基因SLR2097的表達(dá)載體，然后將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入微生物中培養(yǎng)表達(dá)。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5所說的藍(lán)細(xì)菌血紅蛋白基因SLR2097在促進(jìn)植物生長中的應(yīng)用，其特征在于，是先構(gòu)建含藍(lán)細(xì)菌血紅蛋白基因SLR2097的表達(dá)載體，然后通過該表達(dá)載體將SLR2097導(dǎo)入目標(biāo)植物中，獲得轉(zhuǎn)基因植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域。具體涉及一種促進(jìn)微生物和植物生長的基因以及含有該基因具有加速生長的轉(zhuǎn)化體及其進(jìn)一步涉及培育生長周期短的轉(zhuǎn)基因油菜。所說的促進(jìn)微生物和植物生長的基因具有SEQ.ID.No.1所示核苷酸序列。通過構(gòu)建該基因的表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入微生物或植物中，能有效促進(jìn)微生物和植物的生長。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101671691SQ200910232918
公開日2010年3月17日 申請(qǐng)日期2009年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月9日
發(fā)明者孔凡明, 寧德剛, 張志燕, 朱福各, 娟 李, 政 王, 譚小力 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)