專(zhuān)利名稱(chēng)：纖維寡糖發(fā)酵性發(fā)酵細(xì)菌屬性狀轉(zhuǎn)化微生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有β-葡萄糖苷酶外源基因的重組DNA以及含有該重組DNA的性狀轉(zhuǎn)化微生物，該性狀轉(zhuǎn)化微生物可用于由含有纖維寡糖的原料高效地生產(chǎn)乙醇。
背景技術(shù)：
乙醇生產(chǎn)中所用的主要微生物有酵母屬的酵母、發(fā)酵單胞菌屬或發(fā)酵細(xì)菌屬的細(xì)菌。通常，這些微生物由葡萄糖等單糖高效地生產(chǎn)乙醇，但不能由寡糖或多糖生產(chǎn)乙醇。因此，以纖維素類(lèi)生物質(zhì)為原料生產(chǎn)乙醇的場(chǎng)合，首先，必須將纖維素分解為用微生物可發(fā)酵的單糖。纖維素的分解、糖化中，通常采用使用纖維素酶的酶法，或使用硫酸等的酸糖化法等，但現(xiàn)狀是用這些方法也很難將纖維素完全分解為單糖，或者為了提高分解率而過(guò)量地進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，糖的回收率降低，結(jié)果，存在乙醇的生產(chǎn)效率變差等問(wèn)題。
因此，為了提高以生物質(zhì)為原料的乙醇生產(chǎn)的收率，有必要將β-葡萄糖苷酶基因?qū)胍掖忌a(chǎn)所用的微生物中，構(gòu)建能夠以纖維素的部分分解物即纖維寡糖為底物，生產(chǎn)乙醇的性狀轉(zhuǎn)化微生物。
已知發(fā)酵單胞菌屬和發(fā)酵細(xì)菌屬的細(xì)菌的發(fā)酵速度比酵母菌屬的酵母快，有關(guān)以發(fā)酵單胞菌屬的細(xì)菌作為宿主細(xì)胞的性狀轉(zhuǎn)化微生物的構(gòu)建，已進(jìn)行過(guò)各種嘗試。例如，美國(guó)專(zhuān)利NO.5,712,133號(hào)的說(shuō)明書(shū)中，公開(kāi)了將戊糖發(fā)酵性性狀轉(zhuǎn)化至發(fā)酵單胞菌屬的細(xì)菌中。但是，即使按該美國(guó)專(zhuān)利所述的方法將β-葡萄糖苷酶基因?qū)氚l(fā)酵單胞菌屬的細(xì)菌中，也不能使β-葡萄糖苷酶分泌到細(xì)胞外，而且，由于纖維寡糖不能透過(guò)發(fā)酵單胞菌屬的細(xì)胞壁，因此，不能由纖維寡糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。另外，WO98/45451中，公開(kāi)了通過(guò)將克雷伯氏菌屬細(xì)菌的纖維二糖整合系基因性狀轉(zhuǎn)化至發(fā)酵單胞菌屬，從而可以由細(xì)胞內(nèi)的纖維二糖生產(chǎn)乙醇，但乙醇的生產(chǎn)效率不高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種性狀轉(zhuǎn)化微生物，其針對(duì)不能利用纖維寡糖的發(fā)酵細(xì)菌屬微生物，用重組DNA的方法，導(dǎo)入β-葡萄糖苷酶，從而具有由纖維寡糖生產(chǎn)乙醇的能力。
本發(fā)明者著眼于β-葡萄糖苷酶生產(chǎn)性微生物，進(jìn)行各種篩選，可以獲得表現(xiàn)出廣泛的纖維寡糖分解特性的酶。但是，由于發(fā)酵細(xì)菌屬細(xì)菌的宿主-載體系統(tǒng)未建立，所以對(duì)載體的構(gòu)建、性狀轉(zhuǎn)化的方法、纖維寡糖代謝關(guān)聯(lián)酶的基因的克隆等方面進(jìn)行了反復(fù)努力研究，結(jié)果，這回發(fā)現(xiàn)，以發(fā)酵細(xì)菌屬作為宿主細(xì)胞時(shí)，性狀轉(zhuǎn)化的β-葡萄糖苷酶可以分泌到細(xì)胞外，由此可排除因底物進(jìn)入而限速的影響，由含有纖維寡糖的發(fā)酵原料能夠高效地生產(chǎn)乙醇，從而完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明提供具有導(dǎo)入了β-葡萄糖苷酶外源基因的發(fā)酵單胞菌屬的纖維寡糖發(fā)酵性，也就是具有以纖維寡糖為底物生產(chǎn)乙醇的能力的性狀轉(zhuǎn)化微生物。
此外，本發(fā)明還提供將來(lái)源于β-葡萄糖苷酶生產(chǎn)性菌株的、編碼β-葡萄糖苷酶的DNA片段與載體結(jié)合而構(gòu)成的重組DNA。


圖1是載體質(zhì)粒的限制酶酶切位點(diǎn)圖。
圖2是含有β-葡萄糖苷酶基因的重組質(zhì)粒的限制酶酶切位點(diǎn)圖。
圖3是表示利用重組棕櫚發(fā)酵細(xì)菌由纖維二糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的性能的圖。
圖4是表示利用重組棕櫚發(fā)酵細(xì)菌由纖維二糖批式發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的性能的圖。
以下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
本發(fā)明中，將具有β-葡萄糖苷酶生產(chǎn)能力的微生物用作DNA供體，由該供體分離、純化編碼β-葡萄糖苷酶的DNA后，用各種方法切斷，制備含有β-葡萄糖苷酶基因的DNA片段。使該含有β-葡萄糖苷酶基因的DNA片段與載體DNA片段，通過(guò)例如DNA連接酶等結(jié)合，形成含有β-葡萄糖苷酶基因的重組DNA。
對(duì)本發(fā)明中所用的含有β-葡萄糖苷酶基因的DNA供體微生物無(wú)特別的限制，只要具有分解纖維素、部分分解纖維素或纖維寡糖的能力，都可以使用，但特別適用的是屬于瘤胃球菌屬的微生物，其中優(yōu)選白色瘤胃球菌。其它的瘤胃球菌屬微生物或瘤胃球菌屬以外的微生物中，具有β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生能力的微生物，以及因啟動(dòng)子部位或核糖體結(jié)合部位的異常等而沒(méi)有β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生能力，但在其DNA上編碼β-葡萄糖苷酶結(jié)構(gòu)基因的微生物也可以用作含有β-葡萄糖苷酶基因的DNA供體。進(jìn)一步，通過(guò)基因重組等導(dǎo)入了β-葡萄糖苷酶結(jié)構(gòu)基因的性狀轉(zhuǎn)化微生物等也可以作為含有β-葡萄糖苷酶基因的DNA供體微生物使用。
含有β-葡萄糖苷酶基因的重組DNA，通過(guò)導(dǎo)入作為宿主的屬于發(fā)酵細(xì)菌屬的微生物，可以構(gòu)建具有產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶能力的性狀轉(zhuǎn)化微生物。導(dǎo)入的重組DNA的全部或一部分可以整合到發(fā)酵細(xì)菌屬的宿主細(xì)胞的基因組中，也可以存在于性狀轉(zhuǎn)化所用的載體上。
DNA從上述供體微生物的分離、純化可以用其自身已知的方法進(jìn)行，例如齊藤·三浦等的方法(Biochem.Biophys.Acta.Vol.72，619-629，1963)及其改進(jìn)的方法，還可用使用市售的DNA提取試劑盒的方法等進(jìn)行。以下，對(duì)按照齊藤·三浦等的方法進(jìn)行的方法進(jìn)一步具體地說(shuō)明。
首先，將供體微生物接種于含有0.5％甘氨酸的酵母-淀粉培養(yǎng)基(組成酵母提取物0.2％，可溶性淀粉1.0％，pH7.3)等合適的液體培養(yǎng)基中，在4-60℃，優(yōu)選30℃下，攪拌培養(yǎng)8-48小時(shí)，優(yōu)選攪拌培養(yǎng)過(guò)夜。培養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)固-液分離操作，例如在0-50℃，優(yōu)選4℃、轉(zhuǎn)速為3000-15000rpm，優(yōu)選10000rpm的條件下進(jìn)行離心分離，從而收集菌體。
然后將收集的微生物懸浮于VS緩沖液(0.15M NaCl，0.1M EDTA，pH8.0)中，加入溶菌酶后，在4-45℃，優(yōu)選37℃，放置0.5-4小時(shí)，優(yōu)選放置1小時(shí)，得到原生質(zhì)體液。在該液體中加入TSS緩沖液(0.1MTris，0.1M NaCl，1％SDS，pH9.0)和5M NaCl，使原生質(zhì)體溶解。接著，加入TE溶液(10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)-飽和酚，使其平穩(wěn)地充分懸浮。將所得的懸浮液在0-50℃，優(yōu)選4℃，轉(zhuǎn)速為3000-15000rpm，優(yōu)選12000rpm下離心分離，得到的上層(水相)懸浮于氯仿中。進(jìn)一步將其在0-50℃，優(yōu)選4℃、轉(zhuǎn)速為3000-15000rpm，優(yōu)選12000rpm下進(jìn)行離心分離，得到的上層(水相)再次用酚及氯仿進(jìn)行懸浮處理。
隨后，加入冷的乙醇，回收生成的白色混濁的粗染色體DNA，將該DNA溶解于SSC緩沖液(0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉)中，對(duì)SSC緩沖液透析過(guò)夜。將核糖核酸酶按終濃度為1-50μg/ml，優(yōu)選10μg/ml的量加入該透析內(nèi)液中，在4-45℃，優(yōu)選37℃，放置0.5-16小時(shí)，優(yōu)選放置2小時(shí)。再加入終濃度為0.1-10μg/ml，優(yōu)選1μg/ml的蛋白酶，在4-45℃，優(yōu)選37℃，放置15分鐘-8小時(shí)，優(yōu)選放置30分鐘。將其與上述同樣地用酚及氯仿處理、對(duì)SSC緩沖液透析，得到純化的供體微生物的染色體DNA液。
用限制酶等分解上述所得的供體微生物的DNA，用蔗糖密度梯度法除去1kbp以下的DNA片段，可以將得到的物質(zhì)用作供體DNA片段。此時(shí)所用的限制酶無(wú)特別的限定，可以使用切斷DNA的EcoRI等各種酶類(lèi)。此外，除了上述的酶法以外，也可以用超聲波處理或物理剪斷力等將DNA切斷。在這種情況下，如果用Klenow(クレノ一)片段、DNA聚合酶、綠豆(マンダビ一ン)核酸酶等酶處理供體DNA片段的末端，則后面與載體DNA的結(jié)合效率提高，因而優(yōu)選。還有，對(duì)于以供體微生物的DNA或其片段作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，也可以直接，或進(jìn)行上述的處理后，作為供體DNA片段使用。
另一方面，作為載體DNA片段，無(wú)特別的限定，但可以?xún)?yōu)選使用革蘭氏陰性細(xì)菌間的廣泛宿主域性質(zhì)粒來(lái)源的pRK290、pMFY40或pMFY31經(jīng)限制酶酶切處理后的物質(zhì)等。也可以適當(dāng)選擇使用上述以外的載體，例如，已知的革蘭氏陰性細(xì)菌的廣泛宿主域性質(zhì)粒。對(duì)所用的限制酶，也不限于生成粘末端的酶，可以使用將DNA切斷的各種酶類(lèi)，還可以用與上述切斷供體微生物的DNA同樣的方法，將載體DNA切斷。
在與上述供體DNA片段結(jié)合反應(yīng)之前，可以將所得的載體DNA片段用堿性磷酸酶進(jìn)行處理。由此提高該片段與供體DNA片段的結(jié)合效率。而且，通過(guò)PCR擴(kuò)增制備供體DNA片段的場(chǎng)合，使用在擴(kuò)增片段的兩末端預(yù)先給予SalI等限制酶位點(diǎn)的引物，使用由該限制酶切斷的DNA片段和用同樣的限制酶切斷的載體片段，則可以提高結(jié)合效率。對(duì)于供體DNA片段與載體DNA片段的結(jié)合反應(yīng)，可以用已知的使用DNA連接酶的方法等常規(guī)方法進(jìn)行，例如，將供體DNA片段與載體DNA片段退火后，在生物體外，通過(guò)適當(dāng)?shù)腄NA連接酶的作用，可以制成重組DNA。另外，必要時(shí)，也可以在退火后導(dǎo)入宿主微生物，利用生物體內(nèi)的DNA修復(fù)能力，形成重組DNA。
作為插入含有供體DNA片段和載體DNA片段的重組DNA的宿主微生物，只要具有乙醇發(fā)酵能力而且能使重組DNA穩(wěn)定地保持，則可以使用任何一種微生物，本發(fā)明中，適用的微生物是屬于發(fā)酵細(xì)菌屬的微生物，一般可使用棕櫚發(fā)酵細(xì)菌。將重組DNA導(dǎo)入宿主微生物的方法沒(méi)有特別的限制，棕櫚發(fā)酵細(xì)菌等的場(chǎng)合，適合用電穿孔等利用電刺激的方法導(dǎo)入重組DNA。此外，對(duì)于棕櫚發(fā)酵細(xì)菌以外的其他乙醇生產(chǎn)性微生物，例如運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌及酵母、其他的宿主，也可以用同樣的方法導(dǎo)入重組DNA。
作為這樣所得的性狀轉(zhuǎn)化微生物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，例如，在宿主微生物為發(fā)酵細(xì)菌的場(chǎng)合，經(jīng)常使用RM培養(yǎng)基等。用發(fā)酵細(xì)菌以外的枯草桿菌和酵母等作為宿主微生物的場(chǎng)合，可以用與所用的宿主微生物相對(duì)應(yīng)的各種培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度等培養(yǎng)條件也可以根據(jù)宿主微生物的性質(zhì)適當(dāng)設(shè)定。另外，如果所用的載體DNA片段是編碼各種抗生素抗性基因的片段時(shí)，通過(guò)在培養(yǎng)基中添加適量的相應(yīng)的抗生素，能夠使重組DNA更穩(wěn)定地保持。還有，如果所用的載體DNA編碼宿主微生物營(yíng)養(yǎng)缺陷性的互補(bǔ)基因，通過(guò)使用不含有該營(yíng)養(yǎng)素的培養(yǎng)基，同樣能夠使重組DNA的穩(wěn)定性提高。
根據(jù)本發(fā)明，用重組DNA的方法，提供能夠賦予發(fā)酵細(xì)菌屬的微生物纖維二糖發(fā)酵性的重組DNA，以及含有該重組DNA片段的性狀轉(zhuǎn)化微生物。通過(guò)使用該性狀轉(zhuǎn)化微生物，可以以含有纖維二糖的糖液為原料，高效地生產(chǎn)乙醇。
以含有纖維二糖的糖液為原料生產(chǎn)乙醇可按下述方法進(jìn)行用上述纖維寡糖發(fā)酵性性狀轉(zhuǎn)化微生物使含纖維二糖的糖化原料發(fā)酵，從所得的發(fā)酵液回收乙醇。例如，可以使用將上述性狀轉(zhuǎn)化微生物固定化的固定化載體，按照其自身已知的乙醇發(fā)酵法進(jìn)行。
上述性狀轉(zhuǎn)化微生物在固定化載體上的固定化可按其自身已知的方法進(jìn)行，例如包埋法、物理吸附法、共價(jià)結(jié)合法等。
作為載體，中空狀、凹凸?fàn)睢⒍嗫踪|(zhì)狀等形狀的單位體積的表面積大的物質(zhì)或者吸水后膨脹的物質(zhì)中，持有流動(dòng)性、具有不容易從反應(yīng)系統(tǒng)流出的粒徑及比重的物質(zhì)適用；作為載體的形狀，例如板狀體、纖維狀體、圓筒等特殊形狀體，海綿狀體，粒、塊狀體，立方狀體等任何一種都可以，其中，優(yōu)選容易確保流動(dòng)性和充分的表面積的微小粒狀體。作為載體的材料，可以使用以往作為微生物和酶等的載體材料使用的各種有機(jī)·無(wú)機(jī)材料，例如粒狀活性炭、破碎活性炭、木炭、沸石、云母、砂粒等無(wú)機(jī)材料；光硬化性樹(shù)脂、聚氨基甲酸乙酯、聚乙烯醇、聚乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚丙烯、瓊脂、海藻酸、角叉聚糖(カラギ一ナン)、纖維素、葡聚糖、瓊脂糖、離子交換樹(shù)脂等樹(shù)脂材料；硅膠等多孔質(zhì)陶瓷；無(wú)煙煤；樹(shù)脂材料中摻入活性炭等的物質(zhì)等，這些材料可以單獨(dú)使用或2種以上組合使用。
上述固定化載體通常是充填在生物反應(yīng)器內(nèi)使用。發(fā)酵所用的生物反應(yīng)器因其形式不同，有完全混合槽型、充填層型、膜型、流動(dòng)層型、橫型等反應(yīng)器。如果使用這樣的生物反應(yīng)器，則可以進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵，不需要進(jìn)行微生物等的投入、回收步驟，所以?xún)?yōu)選。
上述乙醇發(fā)酵時(shí)，可以將微生物的各種營(yíng)養(yǎng)源按照需要配合在糖液中，例如，作為氮源，可以使用酵母提取物、玉米漿、胨、肉提取物、鰹魚(yú)提取物等。
以下，通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行具體地說(shuō)明，但本發(fā)明不只限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例實(shí)施例1棕櫚發(fā)酵細(xì)菌的基因?qū)敕椒〒?jù)報(bào)道，一般大腸桿菌和假單胞菌等革蘭氏陰性細(xì)菌中存在具有自主傳遞性的多種抗藥性質(zhì)粒DNA。已知這些質(zhì)粒在大腸桿菌和假單胞菌之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移。已有過(guò)將這些廣泛宿主域性的多種抗藥性質(zhì)粒、以及殘留與這些廣泛宿主域性的多種抗藥性質(zhì)粒的傳遞性和自主復(fù)制有關(guān)的基因區(qū)域的質(zhì)粒作為廣泛宿主域性的載體質(zhì)粒進(jìn)行利用的例子(BIO/TECHNOLOGY，November，784-791，1983)。至目前為止，有關(guān)棕櫚發(fā)酵細(xì)菌的載體質(zhì)粒及其基因?qū)敕椒ㄉ形撮_(kāi)發(fā)。因此，從革蘭氏陰性細(xì)菌間的廣泛宿主域性質(zhì)粒中，選擇含有Tc抗性標(biāo)記的pRK290以及pMFY40以及含有Cm抗性標(biāo)記的pMFY31這3種作為將基因?qū)胱貦鞍l(fā)酵細(xì)菌的載體質(zhì)粒(Agric.Biol.Chem.，Vol.49(9)，2719-2724，1985)(圖1)。由于將基因?qū)胱貦鞍l(fā)酵細(xì)菌的方法是未知的，所以采用一般的基因?qū)敕ㄖ械碾姶┛追ā?br> 將棕櫚發(fā)酵細(xì)菌(ATCC 51623)用RM培養(yǎng)基(2.0％葡萄糖，1.0％Bacto-酵母提取物，0.2％KH2PO4，pH6.0)靜置培養(yǎng)過(guò)夜，取5ml該預(yù)培養(yǎng)液接種于50ml的T培養(yǎng)基(2.0％葡萄糖，1.0％Bacto-酵母提取物，1.0％KH2PO4，0.2％(NH4)2SO4，0.05％MgSO4·7H2O，pH6.0)，30℃下培養(yǎng)90分鐘。將培養(yǎng)液在4℃、300rpm下離心分離10分鐘，收集菌體，加入20ml冷卻的10％甘油，懸浮、洗凈。在4℃、3000rpm下再離心10分鐘，制成感受態(tài)細(xì)胞(コンピテントセル)。將200μl感受態(tài)細(xì)胞和10μl載體質(zhì)粒DNA溶液在冰上混合后，轉(zhuǎn)移至電穿孔裝置附帶的樣品池中，在電壓為200V，電容(キャピタンシ一)為250μFD，電阻為200Ω的條件下，施加電脈沖。將1mlT培養(yǎng)基立即加入樣品池中，30℃下靜置培養(yǎng)1小時(shí)后，在選擇培養(yǎng)基上形成菌落，該選擇培養(yǎng)基中添加了與所使用的廣泛宿主域性質(zhì)粒載體的抗藥性基因的表達(dá)相對(duì)應(yīng)的抗生素。采用上述開(kāi)發(fā)的基因?qū)敕椒?，棕櫚發(fā)酵細(xì)菌的質(zhì)粒pMFY40的性狀轉(zhuǎn)化效率約為1×106/μgDNA(表1)。
表1棕櫚發(fā)酵細(xì)菌的性狀轉(zhuǎn)化效率使用的質(zhì)粒 性狀轉(zhuǎn)化效率(個(gè)/μg)pRK2907.45×103pMFY401.01×106pMFY319.21×105實(shí)施例2含有β-葡萄糖苷酶基因的重組質(zhì)粒的制備以由白色瘤胃球菌菌體制備的基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增該菌來(lái)源的β-葡萄糖苷酶基因，將此擴(kuò)增的DNA片段插入載體質(zhì)粒中，制備重組質(zhì)粒。作為PCR中使用的β-葡萄糖苷酶基因擴(kuò)增用的引物，使用根據(jù)已知的該基因的堿基序列(Nucleic Acids Res。Vol.18，671，1990)設(shè)計(jì)的以下2種引物，該2種引物也含有位于β-葡萄糖苷酶基因上游區(qū)域的啟動(dòng)子區(qū)，其兩末端賦予作為限制酶切斷部位的SalI位點(diǎn)BGN引物5′-GCGGTCGACATCAAGGTGTGATGTTGATTATACC-3′BGC引物5′-CGCGTCGACTCATGTTTGACAGCTTATCATCGAT-3′用限制酶SalI切斷PCR所得含有啟動(dòng)子和β-葡萄糖苷酶基因的約3.2kpb的DNA片段，另一方面，用SalI切斷載體質(zhì)粒pMFY31后，與經(jīng)堿性磷酸酶處理的DNA片段混合，利用連接酶使其連接。取10μl含有該重組質(zhì)粒的連接酶反應(yīng)溶液與200μl實(shí)施例1所述的棕櫚發(fā)酵細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞混合，用電穿孔法進(jìn)行性狀轉(zhuǎn)化。性狀轉(zhuǎn)化株選擇在添加了用作藥劑的100μg/ml氨芐青霉素和20μg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷(X-glc)的T平板培養(yǎng)基上藍(lán)色的菌落。所得的性狀轉(zhuǎn)化株保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專(zhuān)利生物保藏中心，其保藏號(hào)為FERM P-19450(其在平成16年6月30日根據(jù)布達(dá)佩斯條約移交給國(guó)際保藏，保藏號(hào)為FERM BP-10047)。另外，插入β-葡萄糖苷酶基因的重組質(zhì)粒稱(chēng)為pMF31-βg(圖2)。
實(shí)施例3重組棕櫚發(fā)酵細(xì)菌株的纖維寡糖發(fā)酵性對(duì)實(shí)施例2中制備的重組棕櫚發(fā)酵細(xì)菌株內(nèi)的β-葡萄糖苷酶表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定域性進(jìn)行研究。
棕櫚發(fā)酵細(xì)菌/pMFY31-βg株、棕櫚發(fā)酵細(xì)菌/pMFY31株和大腸桿菌JM109/pMFY31-βg株分別培養(yǎng)后，由回收的菌體進(jìn)行細(xì)胞分級(jí)(Science，Vol.156(781)，1451-1455，1967)，測(cè)定下列各細(xì)胞級(jí)分的β-葡萄糖苷酶活性相當(dāng)于細(xì)胞外級(jí)分的培養(yǎng)液上清液、相當(dāng)于細(xì)胞表層級(jí)分的菌體詵凈液、高滲液的洗液、相當(dāng)于胞質(zhì)級(jí)分的滲透壓沖擊(shock)液、細(xì)胞膜級(jí)分、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)級(jí)分(J.Bacteriol.，Vol.161(1)，432-434，1985)。
棕櫚發(fā)酵細(xì)菌/pMFY31-βg株的β-葡萄糖苷酶活性與大腸桿菌JM109/pMFY31-βg株的程度相同。而且，對(duì)于表達(dá)的β-葡萄糖苷酶，棕櫚發(fā)酵細(xì)菌/pMFY31-βg中，活性定域在洗菌液中為29.5％、滲透壓沖擊液中為17.1％、無(wú)細(xì)胞提取液中為29.5％，表現(xiàn)出比大腸桿菌高的分泌性(表2)。也就是說(shuō)，在表達(dá)的全部活性中，約50％透過(guò)細(xì)胞膜分泌。
將重組菌棕櫚發(fā)酵細(xì)菌/pMFY31-βg株接種于以2％葡萄糖、2％纖維二糖以及2％葡萄糖+纖維二糖為碳源的培養(yǎng)基中，測(cè)定菌體生長(zhǎng)及乙醇生成量的時(shí)間進(jìn)程。對(duì)于以纖維二糖為唯一碳源的培養(yǎng)基，其生長(zhǎng)速度比葡萄糖培養(yǎng)基的低，但在培養(yǎng)的第10天，消耗了2％的纖維二糖，產(chǎn)生理論收率的乙醇(圖3)。
表2β-葡萄糖苷酶在棕櫚發(fā)酵細(xì)菌內(nèi)的表達(dá)和細(xì)胞定域性棕櫚發(fā)酵細(xì)菌T109 棕櫚發(fā)酵細(xì)菌T109 大腸桿菌JM109(pMFY31)(pMFY31-βg) (pMFY31-βg)細(xì)胞級(jí)分活性 定域性 活性 定域性活性 定域性(U/ml)(％) (U/ml) (％) (U/ml) (％)培養(yǎng)液上清 ＜0.01-0.07 6.7 0.01 1.3菌體洗凈液 ＜0.01-0.31 29.5 0.06 7.6高滲洗凈液 ＜0.01-0.05 4.8 0.01 1.3滲透壓沖擊 ＜0.01-0.18 17.1 0.02 2.5細(xì)胞質(zhì)級(jí)分 ＜0.01-0.31 29.5 0.59 74.7膜級(jí)分 ＜0.01-0.13 12.4 0.10 12.7總活性1.05 0.791單位1分鐘內(nèi)，由1μmol對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷游離出對(duì)硝基苯酚所需的酶量實(shí)施例4將重組菌棕櫚發(fā)酵細(xì)菌FERM P-19450(FERM BP-10047)接種于以來(lái)源于生物質(zhì)部分糖化液的纖維二糖為唯一碳源的CB培養(yǎng)基(2.0％纖維二糖，1.0％酵母提取物，1.0％ KH2PO4，0.2％(NH4)2SO4，0.05％MgSO4·7H2O，pH6.0)，靜置培養(yǎng)5天，作為預(yù)培養(yǎng)液。正式培養(yǎng)用上述的CB培養(yǎng)基，將預(yù)培養(yǎng)液按10％的比例接種于正式培養(yǎng)用的CB培養(yǎng)基中，30℃下緩慢攪拌進(jìn)行培養(yǎng)。測(cè)定菌體生長(zhǎng)程度、纖維二糖濃度及乙醇濃度的時(shí)間進(jìn)程，經(jīng)過(guò)7天的培養(yǎng)，大體上將纖維二糖消耗完，產(chǎn)生理論收率的乙醇(圖4)。
實(shí)施例5在廢木材的硫酸糖化制備的糖液(10％葡萄糖，1％纖維二糖)中，分別按下述終濃度添加下述物質(zhì)酵母提取物1.0％，KH2PO41.0％，(NH4)2SO40.2％，MgSO4·7H2O 0.05％，用pH調(diào)整至6.0的培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵。重組棕櫚發(fā)酵細(xì)菌FERM P-19450(FERM BP-10047)用光硬化性樹(shù)脂ENTG-3800(關(guān)西ペイント公司生產(chǎn))包埋固定化。連續(xù)發(fā)酵中使用通風(fēng)管型生物反應(yīng)器(流動(dòng)層型)，將固定化載體按20％的充填率投入反應(yīng)器后，由反應(yīng)器的下部連續(xù)注入上述培養(yǎng)基。而且，一旦捕集到通過(guò)發(fā)酵而生成的二氧化碳后，從反應(yīng)器的下部再次供給，從而形成流動(dòng)床。在30℃、稀釋率D＝0.1h-1下進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵時(shí)，能夠以99％以上的糖消耗率以及95％以上的乙醇收率，穩(wěn)定進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵1個(gè)月以上。
實(shí)施例6將來(lái)源于舊紙的纖維素用纖維素酶進(jìn)行酶糖化，在制備的糖液(8％葡萄糖，2％纖維二糖)中，分別按下述終濃度添加下述物質(zhì)酵母提取物1.0％，KH2PO41.0％，(NH4)2SO40.2％，MgSO4·7H2O 0.05％，用pH調(diào)整至6.0的培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵。將中空?qǐng)A筒型(2mm×3mm)聚丙烯制成的載體投入菌體懸浮液中，使重組棕櫚發(fā)酵細(xì)菌FERM P-19450(FERM BP-10047)進(jìn)行吸附固定化。連續(xù)發(fā)酵中使用固定床生物反應(yīng)器(充填層型)，將固定化載體按80％的充填率投入反應(yīng)器后，從反應(yīng)器的下部連續(xù)供給上述培養(yǎng)基。在30℃、稀釋率D＝0.2h-1下進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵時(shí)，能夠以99％以上的糖消耗率以及95％以上的乙醇收率，穩(wěn)定進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵1個(gè)月以上。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵細(xì)菌屬的纖維寡糖發(fā)酵性性狀轉(zhuǎn)化微生物，其導(dǎo)入β-葡萄糖苷酶外源基因。
2.一種重組DNA，將來(lái)源于β-葡萄糖苷酶生產(chǎn)性菌株的編碼β-葡萄糖苷酶的DNA片段與載體結(jié)合而成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組DNA，其中β-葡萄糖苷酶生產(chǎn)性菌株為屬于瘤胃球菌屬的微生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的性狀轉(zhuǎn)化微生物，其中導(dǎo)入權(quán)利要求2或3所述的重組DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的性狀轉(zhuǎn)化微生物，其中導(dǎo)入的重組DNA的全部或一部分整合在發(fā)酵細(xì)菌屬宿主細(xì)胞的基因組中。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的性狀轉(zhuǎn)化微生物，其中導(dǎo)入的重組DNA的全部或一部分存在于載體中。
7.一種乙醇的生產(chǎn)方法，其特征在于，用權(quán)利要求1所述的纖維寡糖發(fā)酵性性狀轉(zhuǎn)化微生物使含有纖維二糖的糖化原料發(fā)酵，從所得的發(fā)酵液回收乙醇。
8.一種固定化載體，將權(quán)利要求1所述的纖維寡糖發(fā)酵性性狀轉(zhuǎn)化微生物固定化。
9.一種生物反應(yīng)器，配備權(quán)利要求8所述的固定化載體。
10.一種乙醇的生產(chǎn)方法，其特征在于，使用權(quán)利要求8所述的固定化載體，使含有纖維二糖的糖化原料連續(xù)發(fā)酵。
全文摘要
本發(fā)明提供一種性狀轉(zhuǎn)化微生物，其針對(duì)不能利用纖維寡糖的發(fā)酵細(xì)菌屬的微生物，用重組DNA的方法，將β－葡萄糖苷酶基因?qū)?，從而能夠由纖維寡糖生產(chǎn)乙醇。
文檔編號(hào)C12P7/10GK1580245SQ20041005567
公開(kāi)日2005年2月16日 申請(qǐng)日期2004年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月31日
發(fā)明者梁瀨英司, 岡本賢治, 高寺貴秀, 杉浦敦子 申請(qǐng)人:關(guān)西涂料株式會(huì)社