專利名稱：戊糖發(fā)酵性發(fā)酵細(xì)菌屬性狀轉(zhuǎn)化微生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有編碼選自木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、轉(zhuǎn)醛酶和轉(zhuǎn)酮酶中至少一種酶的外源基因的重組DNA，以及含有該重組DNA片段的性狀轉(zhuǎn)化微生物，該性狀轉(zhuǎn)化微生物能夠用于由含有木糖的原料高效地生產(chǎn)乙醇。
背景技術(shù)：
以纖維素類生物質(zhì)為原料生產(chǎn)乙醇的場(chǎng)合，首先，要用由生物質(zhì)分解至單糖的糖化液作為發(fā)酵原料。纖維素類生物質(zhì)的分解、糖化中，采用使用纖維素酶的酶法或使用硫酸等的酸糖化法等，但由于生物質(zhì)中還有纖維素以外的半纖維素含量高的物質(zhì)，所以該糖化液中除葡萄糖外，還會(huì)含有來(lái)源于半纖維素的木糖。乙醇生產(chǎn)中所用的主要微生物有酵母屬的酵母和發(fā)酵單胞菌屬或發(fā)酵細(xì)菌屬的細(xì)菌。通常，這些微生物由葡萄糖等糖高效地生產(chǎn)乙醇，但不能由木糖生產(chǎn)乙醇。因此，為了提高以生物質(zhì)為原料的乙醇的生產(chǎn)收率，有必要將與木糖代謝有關(guān)的酶導(dǎo)入乙醇生產(chǎn)所用的微生物中，構(gòu)建能夠以木糖為底物生產(chǎn)乙醇的性狀轉(zhuǎn)化微生物。
已知發(fā)酵單胞菌屬和發(fā)酵細(xì)菌屬的細(xì)菌其發(fā)酵速度比酵母屬的酵母快，例如，美國(guó)專利N0.5,712,133號(hào)的說(shuō)明書(shū)中，公開(kāi)了通過(guò)將戊糖發(fā)酵性性狀轉(zhuǎn)化至發(fā)酵單胞菌屬的細(xì)菌，構(gòu)建了能夠由木糖高效地生產(chǎn)乙醇的性狀轉(zhuǎn)化微生物。但是，發(fā)酵單胞菌屬的細(xì)菌與發(fā)酵細(xì)菌屬的細(xì)菌相比，能夠發(fā)酵的糖種類少，為了對(duì)含有麥芽糖和半乳糖或甘露糖等的原料高效地進(jìn)行發(fā)酵，必須用更多的基因進(jìn)行性狀轉(zhuǎn)化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種性狀轉(zhuǎn)化微生物，其針對(duì)不能利用戊糖的發(fā)酵細(xì)菌屬的微生物，用重組DNA的方法，導(dǎo)入戊糖代謝系酶，從而具有由戊糖生產(chǎn)乙醇的能力。
本發(fā)明者著眼于具有木糖分解能力的微生物，進(jìn)行各種篩選，能得到與木糖的代謝有關(guān)的木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、轉(zhuǎn)醛酶和轉(zhuǎn)酮酶的基因。但由于發(fā)酵細(xì)菌屬細(xì)菌的宿主-載體系統(tǒng)尚未建立，所以對(duì)載體的構(gòu)建、性狀轉(zhuǎn)化方法、編碼木糖代謝關(guān)聯(lián)酶的基因的克隆等進(jìn)行了反復(fù)努力的研究，結(jié)果，這回發(fā)現(xiàn)，采用發(fā)酵性糖種類范圍廣的發(fā)酵細(xì)菌屬細(xì)菌作為宿主時(shí)，容易適合于含各種糖的發(fā)酵原料，從而完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明提供一種性狀轉(zhuǎn)化微生物，其具有導(dǎo)入編碼選自木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、轉(zhuǎn)醛酶和轉(zhuǎn)酮酶中至少一種酶的外源基因的發(fā)酵細(xì)菌屬的戊糖發(fā)酵性，也就是說(shuō)，具有以戊糖、特別是木糖為底物生產(chǎn)乙醇的能力。
本發(fā)明還提供將來(lái)源于木糖代謝系酶生產(chǎn)性菌株的、含有編碼選自木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、轉(zhuǎn)醛酶和轉(zhuǎn)酮酶中至少一種酶的基因的DNA片段與載體結(jié)合而構(gòu)成的重組DNA。


圖1是由木糖生物合成乙醇的途徑的圖。
圖2是含有大腸桿菌來(lái)源的木糖異構(gòu)酶基因和木酮糖激酶基因的重組質(zhì)粒的限制酶酶切位點(diǎn)圖。
圖3是含有大腸桿菌來(lái)源的轉(zhuǎn)醛酶基因和轉(zhuǎn)酮酶基因的重組質(zhì)粒的限制酶酶切位點(diǎn)圖。
圖4是含有4種木糖發(fā)酵性基因的重組質(zhì)粒的限制酶酶切位點(diǎn)圖。
圖5是表示用重組棕櫚發(fā)酵細(xì)菌株由木糖生產(chǎn)乙醇的結(jié)果的圖。
圖6是表示用重組棕櫚發(fā)酵細(xì)菌株由木糖批式發(fā)醇生產(chǎn)乙醇的性能的圖。
以下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)明。
本發(fā)明中，用具有木糖分解能力的微生物作為DNA供體，然后，分離、純化編碼選自木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、轉(zhuǎn)醛酶和轉(zhuǎn)酮酶中至少一種酶的DNA后，用各種方法切斷，制備編碼該酶的DNA片段。將此片段與適當(dāng)?shù)妮d體DNA片段通過(guò)例如DNA連接酶等使其結(jié)合，形成含有選自木糖異構(gòu)酶基因、木酮糖激酶基因、轉(zhuǎn)醛酶基因和轉(zhuǎn)酮酶基因中至少一種基因的重組DNA。
對(duì)本發(fā)明中使用的含有該基因的DNA供體微生物無(wú)特別的限制，只要具有分解木糖的能力都可以使用，特別適用的是屬于埃希氏菌屬、黃單胞菌屬、克雷伯氏菌屬、紅細(xì)菌屬、黃桿菌屬、醋桿菌屬、葡糖桿菌屬、根瘤菌屬、土壤桿菌屬(abrobacterium)、沙門(mén)氏菌屬和假單胞菌屬的微生物。其中優(yōu)選大腸桿菌。其它的埃希氏菌屬微生物或上述以外的微生物中，具有分解木糖能力的微生物，以及因啟動(dòng)子部位或核糖體結(jié)合部位的異常而沒(méi)有分解木糖的能力，但在其DNA上編碼木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、轉(zhuǎn)醛酶或轉(zhuǎn)酮酶結(jié)構(gòu)基因的微生物，也可以作為含有該基因的DNA供體使用。進(jìn)一步通過(guò)基因重組等，導(dǎo)入了木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、轉(zhuǎn)醛酶或轉(zhuǎn)酮酶結(jié)構(gòu)基因的性狀轉(zhuǎn)化微生物等也可以作為含有該基因的DNA供體微生物使用。也可以將由不同微生物得到的多種含有該基因的DNA片段與1個(gè)載體結(jié)合。
含有選自木糖異構(gòu)酶基因、木酮糖激酶基因、轉(zhuǎn)醛酶基因和轉(zhuǎn)酮酶基因中至少一種基因的重組DNA，通過(guò)導(dǎo)入作為宿主的屬于發(fā)酵細(xì)菌屬的微生物，可以構(gòu)建成具有生產(chǎn)木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、轉(zhuǎn)醛酶和/或轉(zhuǎn)酮酶能力的性狀轉(zhuǎn)化微生物。導(dǎo)入的重組DNA的全部或一部分可以整合到發(fā)酵細(xì)菌屬宿主細(xì)胞的基因組中，或者也可以存在于性狀轉(zhuǎn)化所用的載體上。
DNA從上述供體微生物的分離、純化可以用其本身已知的方法進(jìn)行，例如齊藤·三浦等的方法(Biochem.Biophys.Acta.Vol.72，619-629，1963)及其改進(jìn)的方法，還可通過(guò)使用市售的DNA提取試劑盒等的方法等進(jìn)行。以下，對(duì)按照齊藤·三浦等的方法進(jìn)行的方法進(jìn)一步進(jìn)行具體說(shuō)明。
首先，將供體微生物接種于含有0.5％甘氨酸的酵母-淀粉培養(yǎng)基(組成酵母提取物0.2％，可溶性淀粉1.0％，pH7.3)等合適的液體培養(yǎng)基中，4-60℃下，優(yōu)選30℃下，攪拌培養(yǎng)8-48小時(shí)，優(yōu)選攪拌培養(yǎng)過(guò)夜。培養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)固-液分離操作，例如在0-50℃，優(yōu)選4℃、轉(zhuǎn)速為3000-15000rpm，優(yōu)選10000rpm的條件下進(jìn)行離心分離，收集菌體。
然后將收集的微生物懸浮于VS緩沖液(0.15M NaCl，0.1M EDTA，pH8.0)中，加入溶菌酶后，在4-45℃，優(yōu)選37℃，放置0.5-4小時(shí)，優(yōu)選放置1小時(shí)，得到原生質(zhì)體液。在該液體中加入TSS緩沖液(0.1MTris，0.1M NaCl，1％SDS，pH9.0)和5M NaCl，使原生質(zhì)體溶解。接著，加入TE溶液(10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)-飽和酚，使其平穩(wěn)、充分地懸浮。將所得的懸浮液在0-50℃，優(yōu)選4℃，轉(zhuǎn)速為3000-15000rpm，優(yōu)選12000rpm下離心分離，得到的上層(水相)懸浮于氯仿中。進(jìn)一步將其在0-50℃，優(yōu)選4℃、轉(zhuǎn)速為3000-15000rpm，優(yōu)選12000rpm下進(jìn)行離心分離，得到的上層(水相)再次用酚及氯仿進(jìn)行懸浮處理。
隨后加入冷的乙醇，回收生成的白色混濁的粗染色體DNA，將該DNA溶解于SSC緩沖液(0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉)中，對(duì)SSC緩沖液透析過(guò)夜。將核糖核酸酶按終濃度為1-50μg/ml，優(yōu)選10μg/ml的量加入該透析內(nèi)液中，在4-45℃，優(yōu)選37℃，放置0.5-16小時(shí)，優(yōu)選放置2小時(shí)。再加入終濃度為0.1-10μg/ml，優(yōu)選1μg/ml的蛋白酶，在4-45℃，優(yōu)選在37℃，放置15分鐘-8小時(shí)，優(yōu)選放置30分鐘。然后與上述同樣，將其用酚及氯仿處理、對(duì)SSC緩沖液透析，得到純化的供體微生物的染色體DNA溶液。
用限制酶等分解上述所得的供體微生物的DNA，用蔗糖密度梯度法除去1kbp以下的DNA片段，可以將得到的物質(zhì)用作供體DNA片段。此時(shí)所用的限制酶無(wú)特別的限定，可以使用切斷DNA的AccII(別名FnuDII)等各種酶類。此外，除了上述的酶法以外，也可以用超聲波處理或物理剪斷力等將DNA切斷。在這種情況下，如果用Klenow(クレノ一)片段、DNA聚合酶、綠豆(マングビ一ン)核酸酶等酶處理供體DNA片段的末端，則后面與載體DNA的結(jié)合效率提高，因而優(yōu)選。還有，對(duì)于以供體微生物的DNA或其片段作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，也可以直接或通過(guò)進(jìn)行上述處理，作為供體DNA片段使用。
另一方面，作為載體DNA片段無(wú)特別的限定，但可以優(yōu)選使用革蘭氏陰性細(xì)菌間的廣泛宿主域性質(zhì)粒來(lái)源的pRK290、pMFY40或pMFY31經(jīng)限制酶酶切處理后的物質(zhì)等。也可適當(dāng)選擇使用上述以外的載體，例如，已知的革蘭氏陰性細(xì)菌的廣泛宿主域性質(zhì)粒。對(duì)所用的限制性酶，也不限于生成粘末端的酶，可以使用將DNA切斷的各種酶類，還可以用與上述切斷供體微生物的DNA同樣的方法，將載體DNA切斷。
在與上述的供體DNA片段結(jié)合反應(yīng)之前，可以將所得的載體DNA片段用堿性磷酸酶進(jìn)行處理。由此提高該片段與供體DNA片段的結(jié)合效率。而且，通過(guò)PCR擴(kuò)增制備供體DNA片段的場(chǎng)合，使用在擴(kuò)增片段的兩末端預(yù)先賦予EcoR I等限制酶位點(diǎn)的引物，使用該限制酶切斷的DNA片段和用同樣的限制酶切斷的載體片段，則可以提高結(jié)合效率。對(duì)于供體DNA片段與載體DNA片段的結(jié)合反應(yīng)，可以用已知的使用DNA連接酶的方法等常規(guī)方法進(jìn)行，例如，可以將供體DNA片段與載體DNA片段退火后，在生物體外，通過(guò)適當(dāng)?shù)腄NA連接酶的作用，制成重組DNA?；蛘?，必要時(shí)，也可以在退火后導(dǎo)入宿主微生物中，利用生物體內(nèi)的DNA修復(fù)能力，形成重組DNA。
作為插入含有供體DNA片段和載體DNA片段的重組DNA的宿主微生物，只要具有乙醇發(fā)酵能力、而且能使重組DNA穩(wěn)定地保持，可以是任何一種微生物，本發(fā)明中，優(yōu)選使用屬于發(fā)酵細(xì)菌屬的微生物，一般使用棕櫚發(fā)酵細(xì)菌。將重組DNA導(dǎo)入宿主微生物的方法沒(méi)有特別的限制，用棕櫚發(fā)酵細(xì)菌等的場(chǎng)合，適合用電穿孔等利用電刺激的方法導(dǎo)入重組DNA。此外，對(duì)于棕櫚發(fā)酵細(xì)菌以外的其他乙醇生產(chǎn)性微生物，例如運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌及酵母、其他的宿主，也可以用同樣的方法導(dǎo)入重組DNA。
作為這樣所得的性狀轉(zhuǎn)化微生物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，例如，在宿主微生物為發(fā)酵細(xì)菌的場(chǎng)合，經(jīng)常用RM培養(yǎng)基等。用發(fā)酵細(xì)菌以外的枯草桿菌和酵母等作為宿主微生物的場(chǎng)合，可以用與所用的宿主微生物相對(duì)應(yīng)的各種培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度等培養(yǎng)條件也可以根據(jù)宿主微生物的性質(zhì)適當(dāng)設(shè)定。另外，如果所用的載體DNA片段是編碼各種抗生素抗性基因的片段時(shí)，通過(guò)在培養(yǎng)基中添加適量的相應(yīng)的抗生素，能夠使重組DNA更穩(wěn)定地保持。還有，如果所用的載體DNA編碼宿主微生物的營(yíng)養(yǎng)缺陷性互補(bǔ)基因時(shí)，使用不含有該營(yíng)養(yǎng)素的培養(yǎng)基，同樣能夠使重組DNA的穩(wěn)定性提高。
根據(jù)本發(fā)明，用重組DNA的方法，能夠提供可以賦予發(fā)酵細(xì)菌屬微生物木糖發(fā)酵性的重組DNA，以及含有該重組DNA片段的性狀轉(zhuǎn)化微生物。通過(guò)使用該性狀轉(zhuǎn)化微生物，可以以含有木糖的糖液為原料，高效地生產(chǎn)乙醇。
以含有木糖的糖液為原料生產(chǎn)乙醇可按下述方法進(jìn)行用上述的戊糖發(fā)酵性性狀轉(zhuǎn)化微生物使含木糖的糖化原料發(fā)酵，從所得的發(fā)酵液回收乙醇。例如，可以使用將上述性狀轉(zhuǎn)化微生物固定化的固定化載體，按照其本身已知的乙醇發(fā)酵法進(jìn)行。
上述的性狀轉(zhuǎn)化微生物在固定化載體上的固定化可按其本身已知的方法進(jìn)行，例如包埋法、物理吸附法、共價(jià)結(jié)合法等。
作為載體，中空狀、凹凸?fàn)睢⒍嗫踪|(zhì)狀等形狀的單位體積的表面積大的物質(zhì)，或者吸水后膨脹的物質(zhì)中，持有流動(dòng)性、具有不容易從反應(yīng)系統(tǒng)流出的粒徑及比重的物質(zhì)適用；作為載體的形狀，例如板狀體，纖維狀體，圓筒等特殊形狀體、海綿狀體、粒，塊狀體、立方狀體等任何一種都可以使用，其中優(yōu)選容易確保流動(dòng)性和充分的表面積的微小粒狀體。作為載體的材料，可以使用以往用作微生物和酶等的載體材料的各種有機(jī)、無(wú)機(jī)材料，例如，粒狀活性炭、破碎活性炭、木炭、沸石、云母、砂粒等無(wú)機(jī)材料；光硬化性樹(shù)脂、聚氨基甲酸乙酯、聚乙烯醇、聚乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚丙烯、瓊脂、海藻酸、角叉聚糖(カラギ ナン)、纖維素、葡聚糖、瓊脂糖、離子交換樹(shù)脂等樹(shù)脂材料；硅膠等多孔質(zhì)陶瓷；無(wú)煙煤；樹(shù)脂材料中摻入活性炭等物質(zhì)等，這些材料可以單獨(dú)使用或2種以上組合使用。
上述的固定化載體通常是充填在生物反應(yīng)器內(nèi)使用。發(fā)酵所用的生物反應(yīng)器因其形式不同，有完全混合槽型、充填層型、膜型、流動(dòng)層型、橫型等反應(yīng)器。使用這樣的生物反應(yīng)器可以進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵，不需要進(jìn)行微生物等的投入、回收的步驟，所以優(yōu)選。
上述乙醇發(fā)酵時(shí)，可以將微生物的各種營(yíng)養(yǎng)源按照需要配合在糖液中，例如，作為氮源，可以使用酵母提取物、玉米漿、胨、肉提取物、鰹魚(yú)提取物等。
以下，通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行具體地說(shuō)明，但本發(fā)明不只限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例實(shí)施例1含有大腸桿菌來(lái)源的木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶基因的重組質(zhì)粒DNA的制備棕櫚發(fā)酵細(xì)菌不具有木糖發(fā)酵性。其原因是將木糖轉(zhuǎn)換為木酮糖的木糖異構(gòu)酶、催化木酮糖的磷酸化反應(yīng)的木酮糖激酶、還有成為經(jīng)過(guò)戊糖磷酸途徑將轉(zhuǎn)換的木酮糖磷酸高效地引導(dǎo)至生物合成乙醇用的關(guān)鍵酶，即醛糖還原酶和轉(zhuǎn)酮酶的缺失，或其活性微弱。因而，通過(guò)將這些酶的基因?qū)氩⑹蛊浔磉_(dá)，可以賦予由木糖生產(chǎn)乙醇的能力(圖1)。
為此，用PCR由大腸桿菌的基因組DNA克隆這些酶的基因。此外，為了使導(dǎo)入的4種酶的基因在棕櫚發(fā)酵細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，利用已報(bào)道在與棕櫚發(fā)酵細(xì)菌近緣的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)的調(diào)控甘油醛-3-磷酸脫氫酶表達(dá)的啟動(dòng)子基因(GAP啟動(dòng)子)。
大腸桿菌來(lái)源的木糖異構(gòu)酶基因和木酮糖激酶基因通過(guò)PCR進(jìn)行克隆。也就是說(shuō)，在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌來(lái)源的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動(dòng)子基因的下游，串聯(lián)地連接大腸桿菌來(lái)源的木糖異構(gòu)酶基因和木酮糖激酶基因；同時(shí)，為了制備在該DNA片段的兩末端賦予用于克隆的EcoRI限制性酶切位點(diǎn)的DNA片段，根據(jù)已知的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌來(lái)源的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因序列(J.Bacterol.Vol.169(12)，5653-5662，1987)和已知的大腸桿菌來(lái)源的木糖異構(gòu)酶基因和木酮糖激酶基因的堿基序列(Appl.Environ.Microbiol.，Vol.47(1)，15-21，1984)，設(shè)計(jì)了以下4種PCR引物ZGX15′-CGGAATTCGTTCGATCAACAACCCGAATCCTATCG-3′ZGX25′-TACTGGAATAAATGGTCTTCGTTATGCAAGCCTATTTTGACCAGCCTCGAT-3′ZGX35′-ATCGACTGGTCAAAATAGGCTTGCATAACGAAGACCATTTATTCCAGTA-3′EX45′-CGGAATTCATGCATAGTTGCCAAAAGTTGCTGTCA-3′作為一次PCR，由運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌菌體制備的基因組DNA用作模板，用ZGX1和ZGX3引物，擴(kuò)增包含啟動(dòng)子和木糖異構(gòu)酶基因的N末端部位的約300bp的DNA片段。另一方面，以大腸桿菌基因組DNA為模板，用ZGX2和EX4引物，擴(kuò)增包含啟動(dòng)子基因的一部分和木糖異構(gòu)酶基因及木酮糖激酶基因的約3.0kbp的DNA片段。
然后，將含啟動(dòng)子基因的DNA片段和含木糖異構(gòu)酶基因及木酮糖激酶基因的DNA片段混合，94℃下加熱20分鐘后，在37℃保溫15分鐘，使其形成異源雙鏈體，然后在TaqDNA聚合酶存在下，72℃下反應(yīng)3分鐘。將引物ZGX1和引物EX4加入該反應(yīng)液中，進(jìn)行二次PCR，擴(kuò)增按GAP啟動(dòng)子基因、木糖異構(gòu)酶基因、木酮糖激酶基因的順序連接的約3.3kbp的DNA片段。將該DNA片段的兩末端進(jìn)行平端化反應(yīng)后，與大腸桿菌用載體-質(zhì)粒DNA、pUC118的HincII限制酶酶切片段混合，利用T4連接酶使其連接，制備重組質(zhì)粒DNA。用該制備的重組質(zhì)粒，按常規(guī)方法將大腸桿菌JM109性狀轉(zhuǎn)化后，將性狀轉(zhuǎn)化株涂布在含有50μg/ml的氨芐青霉素、0.1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷、20μg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷的LB平板培養(yǎng)基(1％Bacto胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，1.5％瓊脂)上，形成菌落。由形成白色菌落的性狀轉(zhuǎn)化株提取的重組質(zhì)粒為pUC118-xylAB(圖2)。
實(shí)施例2含有大腸桿菌來(lái)源的轉(zhuǎn)醛酶和轉(zhuǎn)酮酶基因的重組質(zhì)粒DNA的制備大腸桿菌的基因組DNA上，轉(zhuǎn)醛酶基因和轉(zhuǎn)酮酶基因不構(gòu)成操縱子，位于相互離開(kāi)的位置。因此，將轉(zhuǎn)醛酶和轉(zhuǎn)酮酶分別克隆后，使其按照在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌來(lái)源的GAP啟動(dòng)子的調(diào)控下的狀態(tài)連接。為此，根據(jù)已知的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌來(lái)源的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因序列和已知的大腸桿菌來(lái)源的轉(zhuǎn)醛酶基因(Nucleic Acids Res.，Vol.20，3305-3308，1992)，設(shè)計(jì)了以下4種PCR引物ZGT15′-CGCGGATCCGTTCGATCAACAACCCGAATCCTATC-3′ZGT25′-CTTAATAAGTTAGGAGAATAAACATGACGGACAAATTGACCTCCCTTCGT-3′ZGT35′-ACGAAGGGAGGTCAATTTGTCCGTCATGTTTATTCTCCTAACTTATTAAG-3′ETA45′-CATTTTGACTACCAGATCTAGATTACAGCAGATCGCCGATCATTTTTTCC-3′作為一次PCR，由運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌菌體制備的基因組DNA用作模板，用ZGT1和ZGT3引物，擴(kuò)增包含啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)醛酶基因的N末端部位、該啟動(dòng)子基因的上游末端附加有BamHI限制酶酶切位點(diǎn)的約300bp的DNA片段。另一方面，以大腸桿菌基因組DNA為模板，用引物ZGT2和ETA4，擴(kuò)增包含啟動(dòng)子基因的一部分和轉(zhuǎn)醛酶基因、該轉(zhuǎn)醛酶基因的C末端附加有XbaI限制酶酶切位點(diǎn)的約1.2kbp的DNA片段。
然后，將含啟動(dòng)子基因的DNA片段和含轉(zhuǎn)醛酶基因的DNA片段混合，94℃下加熱20分鐘后，在37℃保溫15分鐘，使其形成異源雙鏈體，然后在TaqDNA聚合酶存在下，72℃下反應(yīng)3分鐘。將引物ZGT1和引物ETA4加入該反應(yīng)液中，進(jìn)行二次PCR，擴(kuò)增按GAP啟動(dòng)子基因和轉(zhuǎn)醛酶基因的順序連接的約1.3kbp的DNA片段。將該DNA片段的兩末端進(jìn)行平端化反應(yīng)后，與大腸桿菌用載體-質(zhì)粒DNA、pUC118的HincII限制性酶酶切片段混合，利用T4連接酶使其連接，制備重組質(zhì)粒DNA。
用該制備的重組質(zhì)粒按常規(guī)方法將大腸桿菌JM109(ATCC 53323)性狀轉(zhuǎn)化后，將性狀轉(zhuǎn)化株涂布在含有50μg/ml的氨芐青霉素、0.1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷、20μg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷的LB平板培養(yǎng)基(1％Bacto胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，1.5％瓊脂)上，形成菌落。由形成白色菌落的性狀轉(zhuǎn)化株提取的重組質(zhì)粒為pUC118-tal。隨后，進(jìn)行轉(zhuǎn)酮酶基因的PCR擴(kuò)增。根據(jù)已知的轉(zhuǎn)酮酶基因的堿基序列(J.Bacteriol.，Vol.174，1707-1708，1992)，合成以下2種引物ETK15′-CGGAATTCTCGAGCTCCAGTTACTCAATACGTAACAATAA-3′ETK25′-CGGCATGCCTCGAGGCAAACGGACATTATCAAGGTAATAAAAAAGGTCGC-3′作為一次PCR，由大腸桿菌的菌體制備的基因組DNA作為模板，用引物ETK1和ETK2，擴(kuò)增在轉(zhuǎn)酮酶基因的N末端上游賦予XbaI限制酶酶切位點(diǎn)，以及在其C末端下游賦予SphI限制酶酶切位點(diǎn)的約2.1kbp的DNA片段。將該DNA片段的兩末端進(jìn)行平端化反應(yīng)后，與大腸桿菌用載體-質(zhì)粒DNA、pUC118的HincII限制性酶酶切片段混合，利用T4連接酶使其連接，制備重組質(zhì)粒DNA。
用該制備的重組質(zhì)粒按常規(guī)方法將大腸桿菌JM109性狀轉(zhuǎn)化后，將性狀轉(zhuǎn)化株涂布在含有50μg/ml的氨芐青霉素、0.1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷、20μg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷的LB平板培養(yǎng)基(1％Bacto胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，1.5％瓊脂)上，形成菌落。由形成白色菌落的性狀轉(zhuǎn)化株提取的重組質(zhì)粒為pUC118-tkt。
然后，制備含有GAP啟動(dòng)子基因與轉(zhuǎn)醛酶基因和轉(zhuǎn)酮酶基因連接的DNA片段的重組質(zhì)粒。也就是說(shuō)，將重組質(zhì)粒pUC118-tal在其轉(zhuǎn)醛酶基因的C末端下游存在的XbaI限制酶切位點(diǎn)和SphI限制酶切位點(diǎn)切斷所得的DNA片段，和將重組質(zhì)粒pUC118-tkt由XbaI和SphI切斷而制備的含有轉(zhuǎn)酮酶基因的約2.1kbp的DNA片段混合，利用T4連接酶使其連接，制備重組質(zhì)粒DNA。用該制備的重組質(zhì)粒按常規(guī)方法將大腸桿菌JM109性狀轉(zhuǎn)化后，將性狀轉(zhuǎn)化株涂布在含有50μg/ml的氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基(1％Bacto胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，1.5％瓊脂)上，形成菌落。由形成菌落的性狀轉(zhuǎn)化株提取的重組質(zhì)粒中，確認(rèn)GAP啟動(dòng)子基因、轉(zhuǎn)醛酶基因、轉(zhuǎn)酮酶基因依次串聯(lián)連接，為pUC118-tal+tkt(圖3)。
實(shí)施例3含有木糖發(fā)酵性基因的重組質(zhì)粒DNA的制備為了將4種木糖代謝系酶基因?qū)胱貦鞍l(fā)酵細(xì)菌并使其表達(dá)，將這些基因插入廣泛宿主域性質(zhì)粒載體中，制備重組質(zhì)粒。
用EcoRI限制酶和BamHI限制酶切斷重組質(zhì)粒pUC118-xylAB，制備含有GAP啟動(dòng)子基因、木糖異構(gòu)酶基因和木酮糖激酶基因的約3.4kbp的DNA片段。另外，用BamHI限制酶和Xho I限制酶切斷重組質(zhì)粒pUC118-tal+tkt，制備含有GAP啟動(dòng)子基因、轉(zhuǎn)醛酶基因和轉(zhuǎn)酮酶基因的約3.3kbp的DNA片段。將此兩個(gè)DNA片段與用EcoRI限制酶和SalI限制酶切斷廣泛宿主域性載體-質(zhì)粒pMFY31(Agric.Biol.Chem.Vol.49(9)，2719-2724，1985)而制備的約11.6kbp的DNA片段混合，利用T4連接酶使其連接，制備重組質(zhì)粒DNA。用該制備的重組質(zhì)粒按常規(guī)方法將大腸桿菌JM109性狀轉(zhuǎn)化后，將性狀轉(zhuǎn)化株涂布在含有50μg/ml的氨芐青霉素、0.1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷、20μg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷的LB平板培養(yǎng)基(1％Bacto胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，1.5％瓊脂)上，形成菌落。確認(rèn)由形成菌落的性狀轉(zhuǎn)化株提取的重組質(zhì)粒中，GAP啟動(dòng)子、木糖異構(gòu)酶基因、木酮糖激酶基因、GAP啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)醛酶基因、轉(zhuǎn)酮酶基因依次連接，為pMFY31-xt(圖4)。
實(shí)施例4木糖發(fā)酵性棕櫚發(fā)酵細(xì)菌的制備將在大腸桿菌內(nèi)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMFY31-xt性狀轉(zhuǎn)化至棕櫚發(fā)酵細(xì)菌(ATCC 51623)。
將棕櫚發(fā)酵細(xì)菌在RM培養(yǎng)基(2.0％葡萄糖、1.0％Bacto-酵母提取物、0.2％KH2PO4、pH6.0)中靜置培養(yǎng)過(guò)夜，取5ml該預(yù)培養(yǎng)液接種于50ml的T培養(yǎng)基(2.0％葡萄糖、1.0％Bacto-酵母提取物、1.0％KH2PO4、0.2％(NH4)2SO4、0.05％MgSO4·7H2O，pH6.0)中，30℃下培養(yǎng)90分鐘。將培養(yǎng)液在4℃、300rpm下離心分離10分鐘，收集菌體，然后加入20ml冷卻的10％甘油，懸浮、洗凈。在4℃、3000rpm下，再離心10分鐘后，制成感受態(tài)細(xì)胞(コンピテントセル)。將200μl的感受態(tài)細(xì)胞和10μl的pMFY31-xtDNA溶液在冰上混合后，轉(zhuǎn)移至電穿孔裝置附帶的樣品池中，在電壓為200V，靜電容量為250μFD，電阻為200Ω的條件下，施加電脈沖。將1mlT培養(yǎng)基立即加入到樣品池中，30℃下靜置培養(yǎng)1小時(shí)后，使其在選擇培養(yǎng)基上形成菌落。在以木糖為唯一碳源、并含有100μg/ml的氨芐青霉素的T瓊脂平板培養(yǎng)基(2.0％木糖、1.0％Bacto-酵母提取物、1.0％KH2PO4、0.2％(NH4)2SO4、0.05％MgSO4·7H2O，1.5％瓊脂、pH6.0)上選擇木糖發(fā)酵性的性狀轉(zhuǎn)化體。確認(rèn)4種酶的基因在棕櫚發(fā)酵細(xì)菌性狀轉(zhuǎn)化株細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。得到的性狀轉(zhuǎn)化株已保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心，其保藏號(hào)為FERM P-19451(其在平成16年6月30日根據(jù)布達(dá)佩斯條約移交給國(guó)際保藏，保藏號(hào)為FERM BP-10048)。
將棕櫚發(fā)酵細(xì)菌[pMFY31-xt]用T培養(yǎng)基培養(yǎng)后，制備無(wú)細(xì)胞提取液，測(cè)定4種酶的活性(Mol.Gen.Genet.，Vol.234，201-210，1992，Methods Enzymol.，Vol.9，499-505，1966，J.Bacteriol.，Vol.100.1289-1295，1969)。另外，作為對(duì)照菌株，使用大腸桿菌與棕櫚發(fā)酵細(xì)菌[pMFY31]，同樣進(jìn)行活性測(cè)定、并進(jìn)行比較。木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、轉(zhuǎn)醛酶、轉(zhuǎn)酮酶在棕櫚發(fā)酵細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)，表現(xiàn)出的活性明顯高于大腸桿菌(表1)。
表1木糖發(fā)酵性基因在重組棕櫚發(fā)酵細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)酶活性(mU/mg蛋白)菌株木糖異構(gòu)酶木酮糖激酶轉(zhuǎn)醛酶轉(zhuǎn)酮酶棕櫚發(fā)酵細(xì)菌[pMFY31]0.08 0.070.13 0.11棕櫚發(fā)酵細(xì)菌[pMFY31-xt] 9.33 8.142.46 2.59大腸桿菌K12 3.23 2.781.85 1.391U的木糖異構(gòu)酶在30℃下，1分鐘內(nèi)生成1μmol木酮糖所需的酶量1U的木酮糖激酶在30℃下，1分鐘內(nèi)消耗1μmol木酮糖所需的酶量1U的轉(zhuǎn)醛酶在30℃下，1分鐘內(nèi)生成1μmol甘油醛-3-磷酸所需的酶量1U的轉(zhuǎn)酮酶在30℃下，1分鐘內(nèi)生成1μmol甘油醛-3-磷酸所需的酶量因?yàn)榭梢源_認(rèn)通過(guò)導(dǎo)入pMFY31-xt后4種酶的高表達(dá)，所以可以用重組株由木糖生產(chǎn)乙醇。對(duì)以木糖為唯-碳源的發(fā)酵性進(jìn)行了研究。在2％葡萄糖、2％木糖及2％葡萄糖+木糖為碳源的培養(yǎng)基上接種，測(cè)定菌體生長(zhǎng)及乙醇生成量的時(shí)間進(jìn)程(圖5)。對(duì)于以木糖為唯一碳源的培養(yǎng)基，與只有葡萄糖相比，生長(zhǎng)速度雖然低，但是，在培養(yǎng)的第5天，約消耗1％的木糖，產(chǎn)生約0.5％的乙醇，收率為90％以上。此外，對(duì)于葡萄糖+木糖培養(yǎng)基，在培養(yǎng)的第4天，木糖幾乎無(wú)殘留，成功地生產(chǎn)出接近理論收率的乙醇。在摻入葡萄糖的情況下，木糖發(fā)酵性顯著提高，通過(guò)生物反應(yīng)器的最適化，可以確定作為適合于實(shí)際應(yīng)用的發(fā)酵菌的地位。
實(shí)施例5將重組菌棕櫚發(fā)酵細(xì)菌FERM P-19451(FERM BP-10048)接種于以來(lái)源于生物質(zhì)部分糖化液的葡萄糖和木糖為碳源的GX培養(yǎng)基(2.0％葡萄糖、2.0％木糖、1.0％酵母提取物、1.0％KH2PO4、0.2％(NH4)2SO4、0.05％ MgSO4·7H2O，pH6.0)，靜置培養(yǎng)2天，用作預(yù)培養(yǎng)液。正式培養(yǎng)用上述的GX培養(yǎng)基，將預(yù)培養(yǎng)液按相對(duì)于正式培養(yǎng)用GX培養(yǎng)基10％的比例接種，30℃下緩慢攪拌進(jìn)行培養(yǎng)。測(cè)定菌體生長(zhǎng)程度、葡萄糖濃度、木糖濃度和乙醇濃度的時(shí)間進(jìn)程，經(jīng)過(guò)3天的培養(yǎng)，木糖基本上消耗完，產(chǎn)生接近于理論收率的乙醇(圖6)。
實(shí)施例6在廢木材的硫酸糖化制備的糖液(12％葡萄糖，3％木糖)中，分別添加下述終濃度的下述物質(zhì)酵母提取物1.0％，KH2PO41.0％，(NH4)2SO40.2％，MgSO4·7H2O 0.05％，用pH調(diào)整至6.0的培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵。重組棕櫚發(fā)酵細(xì)菌FERM P-19451(FERM BP-10048)用光硬化性樹(shù)脂ENTG-3800(關(guān)西ペイント公司生產(chǎn))進(jìn)行包埋固定化。連續(xù)發(fā)酵中使用通風(fēng)管型生物反應(yīng)器(流動(dòng)層型)，將固定化載體按20％的充填率投入反應(yīng)器后，從反應(yīng)器的下部連續(xù)注入上述培養(yǎng)基。而且，一旦捕集到通過(guò)發(fā)酵而生成的二氧化碳后，從反應(yīng)器的下部再次供給，從而形成流動(dòng)床。在30℃、稀釋率D＝0.1h-1下進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵時(shí)，能夠以99％以上的糖消耗率以及95％以上的乙醇收率，穩(wěn)定進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵1個(gè)月以上。
實(shí)施例7在稻秸的硫酸糖化制備的糖液(8％葡萄糖，3％木糖)中，分別添加下述終濃度的下述物質(zhì)酵母提取物1.0％，KH2PO41.0％，(NH4)2SO40.2％，MgSO4·7H2O 0.05％，用pH調(diào)整至6.0的培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵。將中空?qǐng)A筒型(2mm×3mm)聚丙烯制成的載體投入菌體懸浮液中，進(jìn)行重組棕櫚發(fā)酵細(xì)菌FERM P-19451(FERM BP-10048)的吸附固定化。連續(xù)發(fā)酵中使用固定床生物反應(yīng)器(充填層型)，將固定化載體按80％的充填率投入反應(yīng)器后，從反應(yīng)器的下部連續(xù)地供給上述培養(yǎng)基。在30℃、稀釋率D＝0.2h-1下進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵時(shí)，能夠以9 9％以上的糖消耗率以及95％以上的乙醇收率，穩(wěn)定進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵1個(gè)月以上。
實(shí)施例8實(shí)施例7的連續(xù)發(fā)酵裝置中，將2個(gè)固定床生物反應(yīng)器串聯(lián)連接，進(jìn)行與實(shí)施例3同樣的試驗(yàn)。結(jié)果，在釋釋率D＝0.2h-1的條件下，也能以99％以上的糖消耗率和95％以上的乙醇收率，穩(wěn)定地連續(xù)發(fā)酵1個(gè)月以上。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵細(xì)菌屬的戊糖發(fā)酵性性狀轉(zhuǎn)化微生物，其導(dǎo)入了編碼選自木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、轉(zhuǎn)醛酶、轉(zhuǎn)酮酶中至少1種酶的外源基因。
2.一種重組DNA，將來(lái)源于木糖代謝系酶生產(chǎn)性菌株的、含有編碼選自木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、轉(zhuǎn)醛酶、轉(zhuǎn)酮酶中至少1種酶的基因的DNA片段與載體結(jié)合而成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組DNA，其中的木糖代謝系酶生產(chǎn)性菌株是屬于埃希氏菌屬、黃單胞菌屬、克雷伯氏菌屬、紅細(xì)菌屬、黃桿菌屬、醋桿菌屬、葡糖桿菌屬、根瘤菌屬、土壤桿菌屬、沙門(mén)氏菌屬或假單胞菌屬的微生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組DNA，其中木糖代謝系酶生產(chǎn)性菌株是大腸桿菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的性狀轉(zhuǎn)化微生物，其導(dǎo)入了權(quán)利要求2-4中任何一項(xiàng)所述的重組DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的性狀轉(zhuǎn)化微生物，其中導(dǎo)入的重組DNA的全部或一部分整合到發(fā)酵細(xì)菌屬宿主細(xì)胞的基因組中。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的性狀轉(zhuǎn)化微生物，其中導(dǎo)入的重組DNA的全部或一部分存在于載體上。
8.一種乙醇的生產(chǎn)方法，其特征在于，用權(quán)利要求1所述的戊糖發(fā)酵性性狀轉(zhuǎn)化微生物使含木糖的糖化原料發(fā)酵，由所得的發(fā)酵液回收乙醇。
9.一種固定化載體，將權(quán)利要求1所述的戊糖發(fā)酵性性狀轉(zhuǎn)化微生物固定化。
10.一種生物反應(yīng)器，具備權(quán)利要求9所述的固定化載體。
11.一種乙醇的生產(chǎn)方法，其特征在于，使用權(quán)利要求9所述的固定化載體，使含有木糖的糖化原料連續(xù)地發(fā)酵。
全文摘要
本發(fā)明提供一種性狀轉(zhuǎn)化微生物，其針對(duì)不能利用戊糖的發(fā)酵細(xì)菌屬微生物，用重組DNA方法，導(dǎo)入戊糖代謝系酶，從而能夠由戊糖生產(chǎn)乙醇。
文檔編號(hào)C12N15/54GK1580244SQ200410055668
公開(kāi)日2005年2月16日 申請(qǐng)日期2004年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月31日
發(fā)明者梁瀨英司, 岡本賢治, 高寺貴秀, 杉浦敦子 申請(qǐng)人:關(guān)西涂料株式會(huì)社