專利名稱：一種油菜DNA分子Bnoleosin1基因和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學領域和農學領域，更具體地涉及一種油菜DNA分子 Bnoleosinl基因，同時還涉及一種油菜DNA分子Bnoleosinl基因在提高油料作物種子含油 量中的應用。
背景技術：
脂類是植物種子貯藏能量最有效的形式，許多植物種子以貯存的脂類為隨后的生 命活動及活躍的代謝過程提供能量。植物種子的這種貯脂顆粒常被稱為油體(Oilbodies)。 一般認為，油體內部為液態(tài)基質，主要成分是三酰甘油酯(TriacylglycerolsTAG)，被一層 磷脂和蛋白質鑲嵌而成的半單位膜所覆蓋。磷脂層的疏水?；c內部的三酰甘油酯相互作 用，而親水頭部基團則面向細胞液。組成半單位膜的蛋白質主要是油體相關蛋白，目前已發(fā) 現(xiàn)三種這類蛋白(Oleosin, Ealeosin和Steroleosin)。其中，Oleosin發(fā)現(xiàn)最早，含量最 豐富。Oleosin—般覆蓋于油體表面，屬于堿性、疏水、嵌入蛋白。不同植物種子中Oleosin 的分子量范圍在15 26kDa之間。甘藍型油菜種子Oleosin占種子總蛋白的8%。Oleosin的結構和功能一般認為，Oleosin包括三個結構分區(qū)兩性(兼具親水性和親脂性)N末端區(qū)， 中心疏水區(qū)，兩性C末端區(qū)。Oleosin似圖釘一樣分布在油體上，其中心疏水區(qū)部分釘入油 體，N、C末端區(qū)則覆蓋在油體表面。Oleosin蛋白的中心疏水區(qū)相當保守，由約70個氨基酸 組成，是目前已知蛋白質中存在的最長的疏水區(qū)域。N和C末端區(qū)物種間變化較大，分別由 50-70、55-98個氨基酸組成。作為油體最主要的相關蛋白，從油體的發(fā)生到分解消失過程中Oleosin起著重要 的生物學作用。關于油體的個體發(fā)生，比較流行的是“出芽”說，其基本過程為TAG先在內 質網(wǎng)膜內合成，Oleosin —旦形成就流向累積有TAG的內質網(wǎng)膜內，隨后TAG-Oleosin “芽” 逐漸長大，形成油體。缺少Oleosin，油體將不可能形成。當植株需要動員貯藏在油體內的 脂類時，Oleosin可能作為脂酶與油體結合的識別信號，也可能是脂酶的活化劑，促進油體 分解。當油體表面磷脂層的水化作用不足以阻止油體相互接合或融合時，Oleosin產生的 空間障礙和相斥電荷起到了穩(wěn)定油體的作用。其生理意義在于能阻止油體在種子干化過程 中相互結合，能保持油體成為相對獨立、可流動的顆粒。用胰蛋白酶處理分離的油體可以破 壞其穩(wěn)定性，如果不用胰蛋白酶處理，僅用磷酸磷脂酶處理，則不能影響油體的完整性，充 分說明Oleosin對穩(wěn)定油體有十分重要的作用。模式植物擬南芥上的研究表明，如果抑制掉油體蛋白基因Oleosinl的表達，會 導致種子中的油體無法維持穩(wěn)定而互相融合到一起，形成異常的大油體；當恢復Oleosinl 的表達后油體大小又回復正常，這直接證明了油體大小受到Oleosinl基因的調控。在申 請人對甘藍型油菜的研究中發(fā)現(xiàn)，一些低含油量油菜品種種子中也出現(xiàn)異常大油體，而且 Oleosin蛋白和Oleosinl基因表達水平都明顯低于高油品種，這說明Bnoleosinl基因與含 油量高度相關。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種油菜DNA分子Bnoleosinl基因，該基因調控種子 油體的大小，過量表達該基因可以提高種子含油量。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種油菜DNA分子Bnoleosinl基因在提高油 料作物種子含油量中的應用。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術措施一種油菜DNA分子Bnoleosinl基因的制備方法，其步驟是油菜油體蛋白基因Bnoleosinl的獲得1)在高低含油量油菜組合及其F2代群體測序的分析結果中獲得該基因EST序列， 在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索已發(fā)表的擬南芥Oleosinl基因序列(AT4g25140)，并以此編碼區(qū)序列 BLASTNCBI EST數(shù)據(jù)庫，尋找與之同源的油菜Oleosin基因的EST序列，并設計基因編碼序 列的兩側引物(正向引物[5，-ATGGCGGATACTGCTAGAACC-3，]；反向引物[5，-GCGTGATTTA TGTAGTAGTGGT-3’ ])。2)以油菜品系中雙9號cDNA第一鏈為模板進行RT-PCR擴增，將擴增得到的片段 進行測序，獲得Bnoleosinl基因序列，一種DNA分子，其堿基序列如SEQ ID NO :1所示的核 苷酸序列。通過上述方法獲得了油菜油體蛋白基因Bnoleosinl，采用一種提高油菜 Bnoleosinl表達活性的轉基因擬南芥，其特征在于轉基因植物表現(xiàn)為Bnoleosinl基因表 達豐度增強。在本發(fā)明中為了達到上述目的采用以下技術措施提供了一種PCR8/GW/T0P0質粒(Invetrogen公司購買)，可以與表達載體質粒重 組構建基因表達質粒的實驗方法。提供了 一種質粒表達載體PearIeygate 100 (Invetrogen公司購買)，它含有35S啟 動子和翻譯控制件。提供了一種可在植物中表達的宿主菌(根癌農桿菌)，本發(fā)明優(yōu)選的是農桿菌 GV3101 (Invetrogen 公司購買)。本發(fā)明提供了一種能夠過量表達Bnoleosinl的轉基因擬南芥的方法，其特征在 于擬南芥中Bnoleosinl表達量增加。該方法包括下列步驟1)將克隆得到的油菜油體蛋白基因Bnoleosinl與PCR8/GW/T0P0質粒連接， 命名為topo-Bnoleosinl,利用PCR8/GW/T0P0質粒與質粒表達載體PearleygatelOO 可以體外重組的特性將油菜油體蛋白基因Bnoleosinl轉移至表達載體，命名為 Pearleygate100-BnoIeosinl ；2)將步驟1)中制備的載體PearleygatelOO-Bnoleosinl轉入根癌農桿菌 GV3101，再導入擬南芥植株中；3)篩選陽性植株。種植擬南芥TO代所收獲的種子，待10天左右噴灑除草劑(草甘膦)用于篩選陽 性植株，葉片DNA提取后進行PCR鑒定。本發(fā)明中所用的術語“轉基因植物”是指含有導入的基因并能夠穩(wěn)定地增強或抑制所導入的基因表達并產生具有特定的生物學性狀的植物?？寺”景l(fā)明中所述的油菜油體蛋白基因Bnoleosinl的方法是本領域中所常采用 的方法(《分子克隆實驗指南》第三版，J.薩姆布魯克、D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯，科學出 版社)。提取植物葉片DNA是常用的分子生物學技術，提取RNA的方法也有多種成熟的技 術，試劑盒(RNeasy Plant Mini Kit，Qiagen)可從商業(yè)途徑獲得，而構建cDNA文庫也是常 用的分子生物學技術。構建本發(fā)明中所述的載體和將載體轉染入植株也是本領域中所常采 用的方法。其中所涉及的質粒(入門載體PCR8/GW/T0P0，質粒表達載體PearleygatelOO)， 轉染用媒體(如根癌農桿菌GV3101和表面活性劑Silwet-77)可從商業(yè)途徑獲得。本發(fā)明是國內首次公開油菜油體蛋白基因Bnoleosinl序列。本發(fā)明實驗結果表 明轉基因擬南芥Bnoleosinl表達量與受體對照(非轉基因植株)相比均有很大程度的提 高。轉基因純合株系生長于21-23°C培養(yǎng)箱中，收獲種子后測其含油量的變化。結果顯示， 轉基因株系的種子含油量比野生型明顯提高，最高提高了 6個百分點。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下優(yōu)點和效果前人研究報道，油體蛋白基因Oleosinl的主要功能是調控種子中油體的大小，如 果抑制Oleosinl基因的表達會導致異常大油體的產生，但目前還沒有研究報道該基因的 表達與含油量是否相關。本發(fā)明上述結果表明，利用油體蛋白基因的過量表達可以提高含 油種子的油含量，這是該基因的一個新的功能。因此本發(fā)明提出可利用油體蛋白的過量表 達或者增強油體蛋白基因的功能來增強油料作物種子含油量以便用于油料作物高含油量 品種的選育。實現(xiàn)上述觀點的方法是通過轉基因方法，利用強啟動子大量表達油體蛋白基 因及其轉錄因子，以便提高油體蛋白的表達量或增強某些油體蛋白的功能。


圖1為Bnoleosinl基因在高低含油量油菜品種中的RT-PCR表達圖2為高低含油量油菜品種中0LE0SIN蛋白的SDS-PAGE分析L，蛋白質 Marker ;1，B. napus 6F313 ；2, B. napus zy036 ；3, B. napus 53165 ；4, B.napus 93275；5,B.napus 51070圖3為高低含油量油菜品種成熟種子胚的超微結構比較(A)B. napus 6F313 ； (B)B. napus zy036 ； (C)B. napus53165 ； (D)B. napus 93275 ； (E) and(F)B. napus 51070.黑箭指示正常的油體，箭頭指示蛋白體；白箭指示異常大油體。 標尺 Bars = 2 μ m.圖4為一種植物表達載體示意圖，根據(jù)圖示的方法構建得到過量表達Bnoleosinl 基因的載體，該載體分別帶有Kan和Bar兩個篩選標記。圖5為一種除草劑篩選過后的轉基因植株，轉基因陽性植株因為帶有抗除草劑標 記基因，在除草劑篩選過后能夠存活下來。圖6為一種轉Bnoleosinl基因擬南芥Tl代的PCR鑒定結果，1，3，4，6，8，9，11，12，
13，15樣為轉基因植株，WT為對照野生植株。圖7為一種轉基因擬南芥與對照含油量的比較，1，8，9，11，12，13，15樣為轉基因 植株，WT為對照野生植株。其中轉基因植株9，11，12，13，15含油量明顯高于對照材料。
具體實施例方式通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，或 Draper 等人(Blackwell 科學出版社，1988) 所述的條件，或按照所用試劑制造廠商所建議的條件。一種油菜DNA分子Bnoleosinl基因的制備方法，其步驟是油菜Bnoleosinl基因在擬南芥中的轉化，篩選和分析BnoleosinlcDNA 編碼區(qū)序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索已發(fā)表的擬南芥Oleosinl基因序列，BLAST到油菜EST 序列并拼接出油菜Bnoleosinl編碼區(qū)全長。設計基因編碼序列的兩側引物(正向引物 [5，-ATGGCGGATACTGCTAGAACC-3‘]；反向引物[5，-GCGTGATTTATGTAGTAGTGGT-3‘])，用來 從油菜中擴增Oleosinl的對應序列。1、提取油菜 mRNA。RNA 的提取(TRIZ0L TM Kit 提取 RNA)液氮研磨IOOmg材料A.加 ImlTRIZOL,室溫(20-25°C，下同)放置 5min。B.加入200ul氯仿，劇烈振蕩30s，室溫放置2min。C. 12000g，15min，4 °C，取上清至新管中，加入500u 1異丙醇，混勻后室溫放置 15min。D. 12000g，15min，4°C，去上清，加入 Iml 70% (V/V)乙醇。E. 7500g, 7min, 4°C，去上清，空氣干燥。F. DEPC-H2O 溶解。2、cDNA第一鏈的反轉錄采用 RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas)，操作參照所用試劑盒說明進行。3、以cDNA為模板進行PCR擴增，得到了基因序列如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序 列。一種油菜DNA分子Bnoleosinl基因，該基因與油菜種子中油體的大小以及油菜含 油量有高度的相關性。申請人對三個含油量在49%以上的高油油菜和兩個含油量在34% 以下的低油油菜品種進行研究發(fā)現(xiàn)(表1)，三個高油油菜中Bnoleosinl基因的表達水平 (圖1)和油體蛋白水平(圖2)都明顯高于兩個低油油菜品種。而且在這兩個低油油菜品 種中，形成了一些異常的大油體(圖3)。這些研究結果不僅說明油菜Bnoleosinl基因具有 與其他物種報道的該基因的功能，即維持油體形態(tài)調控油體大小，而且該油菜Bnoleosinl 基因還與種子的含油量高度相關，我們將該基因轉化擬南芥的實驗結果也證明了這點。表1、不同油菜品種總含油量和總蛋白含量分析油菜品種 總含油量 總蛋白含量 B. napus lines Lipid (%) Protein (%)
下
4中油菜DNA分子Bnoleosinl基因在提高油料作物種子含油量中的應用過程如
IBnoleosinl表達載體的構建及擬南芥的轉化
將PCR擴增得到的基因序列與TOPO入門載體(invitrogen公司)連接后， 轉化到感受態(tài)細胞DH5 α (invitrogen公司)中，壯觀酶素篩選，載體引物(T7引 物)與基因引物(基因上游引物)擴增鑒定正向插入克隆，質粒經小量制備后與 PearleygatelOO (invitrogen公司)進行重組，并轉化到感受態(tài)細胞DH5 α中，卡那霉素篩 選，其插入片段經載體引物(35S啟動字序列引物)與基因引物(基因下游引物)PCR鑒定， 示意圖見圖4。擬南芥的轉化過程試劑配制滲透培養(yǎng)基(IL):l/2xMurashige-Skoog ；5% (W/V)蔗糖；0. 5 克MES ；用 KOH調至 pH5. 7 ；再加10微升lmg/ml的6-BA母液；200微升Silwet L-77轉化步驟(1)制備好已轉化了相應質粒的農桿菌(GV3101)菌液10ml，在轉化前一天晚上， 轉入大瓶培養(yǎng)過夜，第二天取出使用時農桿菌液在600nm的吸光值0. D600應當在1. 2到 1.6之間。(2)室溫 5OOOrpm 離心 分鐘。(3)棄上清，將農桿菌(GV3101)沉淀懸浮于相應體積的滲透培養(yǎng)基里，使0. D600
在0.8左右。(4)將整個植株直接浸泡至農桿菌(GV3101)懸浮液中30s。(5)避光培養(yǎng)過夜，然后正常培養(yǎng)至結子。2、轉基因擬南芥的篩選和驗證轉化子的篩選將春化過的擬南芥種子種于澆過飽和PNS營養(yǎng)液的人工土中，并用保鮮膜罩上。 兩天后光照，三天后揭膜。人工培養(yǎng)室條件相對濕度80%，恒溫20-24°C，光照強度80-200umol/M2/S，光照 周期為8h黑暗、16h光照培養(yǎng)。一周左右，噴除草劑(草甘膦)篩選陽性植株(圖5)。PCR 鑒定(1)用于PCR的轉化植株總DNA的提取A. 70% (V/V)乙醇擦洗葉片，稱取大約IOOmgB.加入 600ul 抽提緩沖液(0. 2M Tris-Cl, 0. 25NaCl,25mM EDTA，0. 5% (ff/V) SDS,PH 7. 5)，室溫快速研磨。C. 1. 5ml Ependorff 管中渦旋混勻 5_10s。D. 12000rpm，25min，室溫。取上清，加等體積異丙醇，-20攝氏度沉淀過夜。E. 12000rpm, 15min，室溫。加入 70% (V/V)乙醇 200ul 泡洗 DNA 沉淀。F. 12000rpm，15min，室溫。去乙醇。倒置于紙巾上，待乙醇揮發(fā)干凈。G..加無菌水IOOul溶解粗提DNA沉淀。用分光光度計測定或電泳估測其濃度。H.以總DNA為模板，進行PCR。(2) PCR 程序PCR反應混合液的配比同質粒PCR鑒定，依據(jù)植物表達載體中目的基因及其上游 35S啟動子序列和基因下游引物[5’ -ACCACTACTACATAAATCACGC-3’ ]，反應的時間和溫度作 如下94"C 3min94°C 45s,59°C 45s72°C 2min 30s,30cycles72 °C 5min檢測結果顯示，大多數(shù)轉化植株均能夠擴增出預期大小的電泳條帶，而陰性對照 則沒有，表明轉基因擬南芥基因組中已經含有外源基因DNA片段，結果如圖6所示。3、擬南芥含油量檢測轉基因純合株系分別生長于21-23°C培養(yǎng)箱中，收獲種子后測其含油量的變化。結 果顯示，轉基因及野生型擬南芥種子含油量有了明顯的區(qū)別(圖7)。SEQUENCE LISTING<110>中國農業(yè)科學院油料作物研究所<120> 一種油菜DNA分子Bnoleosinl基因和應用<130> 一種油菜DNA分子Bnoleosinl基因和應用<160>1<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>543<212>DNA<213>Bnoleosinl<400>1
0103]atggcggatactgctagaacccatcacgacataaccagccgtgaccagtacccgatattg600104]ggccgagaccgagaccagtatccttacggacgatcagactaccagacgtcgggccaagac1200105]tactccaagactaggcagattgctaaagctgctaccgcagtcaccgccggagggtccctt1800106]cttgtcctctccagtctcacccttgtcggaacagtcattgctttgactgttgccactcct2400107]ctgcttgttatctttagcccaatcctcgtgccggctctcatcaccgtagcacttctcatc3000108]actggctttctctcctctggtgggtttggcattgcagctataaccgtcttctcctggatc3600109]tataagtacgcaacgggagagcacccacaggggtcagataagttggacagtgcaaggatg420


aagctgggaa ccaaagctca ggatattaaa gacagagctc aatactacgg acaggtggtg agcatgaccg tgaccgtacc cgtggaaccc atcacaccac
acagcaacat 480 cactactaca 540
taa54權利要求
一種油菜DNA分子Bnoleosin1，其序列為SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
2.權利要求1所述的一種基因Bnoleosinl在提高油料作物種子含油量中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種油菜DNA分子Bnoleosin1基因和應用，其步驟是A、油菜油體蛋白基因Bnoleosin1的獲得1)在高低含油量油菜組合及其F2代群體測序的分析結果中獲得該基因EST序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索已發(fā)表的擬南芥Oleosin1基因序列；2)以油菜cDNA第一鏈為模板進行RT-PCR擴增，將擴增得到的片段進行測序，獲得Bnoleosin1基因序列，一種DNA分子，其堿基序列如SEQ ID NO1所示。研究結果表明，該油體蛋白在擬南芥中過量表達可以提高擬南芥種子的含油量。鑒于上述結果，本發(fā)明提出所有利用轉基因過量表達Oleosin油體蛋白及其轉錄因子用于聚合育種可提高種子含油量的方法均可用于提高油料作物的含油量。
文檔編號C12N15/29GK101899447SQ200910062250
公開日2010年12月1日 申請日期2009年5月26日 優(yōu)先權日2009年5月26日
發(fā)明者劉貴華, 華瑋, 王新發(fā), 王漢中, 胡志勇 申請人:中國農業(yè)科學院油料作物研究所