甘藍(lán)型油菜skip基因家族及其重組載體和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及甘藍(lán)型油菜SKIP (BnSKIP)基因家族，還涉及 含有BnSKIP基因家族的重組載體和BnSKIP基因家族的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 干旱對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有極其嚴(yán)重的影響，是造成全世界作物減產(chǎn)最主要的自然逆境因 素，其危害相當(dāng)于其它自然災(zāi)害之和。我國(guó)是一個(gè)水資源貧乏的國(guó)家，人均水資源占有量不 及世界人均水平的1/4,是全球13個(gè)人均水資源最貧乏的國(guó)家之一。近60年來(lái)，我國(guó)年均 受旱面積2157萬(wàn)公頃，成災(zāi)面積956萬(wàn)公頃，占總氣象災(zāi)害受災(zāi)面積的55%。尤其是2000 年以來(lái)，因旱成災(zāi)面積大幅度增加，全國(guó)年均因旱糧食損失達(dá)到3728萬(wàn)噸，占糧食總產(chǎn)的 7. 7%，嚴(yán)重威脅著我國(guó)的糧食安全。
[0003] 油菜（Brassica napus)是世界上主要的油料作物之一。目前，我國(guó)常年種植面積 約733萬(wàn)公頃，總產(chǎn)1200萬(wàn)噸，播種面積和總產(chǎn)量均居世界首位。作為我國(guó)傳統(tǒng)的食用油， 2009年菜籽油已占國(guó)產(chǎn)油料作物產(chǎn)油的57 %以上，成為國(guó)產(chǎn)食用植物油的第一大來(lái)源。近 年，隨著人民生活水平的提高，人們對(duì)植物油的需求與日俱增，但由于油菜比價(jià)效益降低， 種植面積迅速下降，導(dǎo)致國(guó)內(nèi)食用植物油自給率低于40%，成為我國(guó)大宗農(nóng)產(chǎn)品中對(duì)國(guó)際 市場(chǎng)依存度最大最嚴(yán)峻的作物。長(zhǎng)江流域是我國(guó)油菜主產(chǎn)區(qū)，雖然降雨充沛，但全年降水不 均，季節(jié)性干旱頻繁發(fā)生，長(zhǎng)江中游油菜主產(chǎn)區(qū)常常受到秋冬旱危害，而長(zhǎng)江上游產(chǎn)區(qū)則主 要受春旱的危害。例如2011年，長(zhǎng)江中下游地區(qū)遭受50年一遇的罕見(jiàn)高溫干旱災(zāi)害，導(dǎo) 致油菜單產(chǎn)和總產(chǎn)量均顯著下降。干旱已成為限制我國(guó)油菜生產(chǎn)和發(fā)展的重要障礙因素之 一。發(fā)生旱災(zāi)時(shí)，油菜出苗不齊、栽后出葉緩慢、綠葉面積減小、生長(zhǎng)緩慢、植株矮小，嚴(yán)重影 響產(chǎn)量，區(qū)域總產(chǎn)減少可達(dá)25% -32%。嚴(yán)重干旱還會(huì)影響營(yíng)養(yǎng)元素的正常吸收，加重油菜 缺硼的發(fā)生程度和范圍，導(dǎo)致油菜花而不實(shí)。因此，系統(tǒng)研宄油菜耐旱的生理、遺傳和分子 機(jī)理，挖掘油菜自身的基因潛力，利用基因工程技術(shù)提高油菜的抗旱能力，培育抗旱油菜新 品種，對(duì)保障我國(guó)食用油供給安全，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有深遠(yuǎn)的理論意義與應(yīng)用價(jià) 值。
[0004] 同為十字花科的模式植物擬南芥功能基因組學(xué)的研宄成果，為推動(dòng)甘藍(lán)型油菜重 要性狀的分子機(jī)理研宄和比較基因組學(xué)研宄提供了重要參考。通過(guò)對(duì)擬南芥鹽敏感突變體 Atskip的研宄發(fā)現(xiàn)AtSKIP基因在植株適應(yīng)干旱、鹽害和其他非生物脅迫中具有重要作用。 作為細(xì)胞周期信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)因子，AtSKIP可參與擬南芥根和葉片細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的生長(zhǎng)和 發(fā)育。AtSKIP能與剪接復(fù)合體中的剪接因子富含絲氨酸和精氨酸蛋白45(Ser/Arg-rich protein45, SR45)互作，并能通過(guò)調(diào)節(jié)時(shí)間節(jié)律相關(guān)基因PSEUDORESPONSE RE⑶LAT0R 7 (PRR7)和PRR9等的可變剪接方式實(shí)現(xiàn)對(duì)植物生物鐘的精確調(diào)控。但是，目前甘藍(lán)型油菜 SKIP基因的成員數(shù)、蛋白特征、進(jìn)化關(guān)系、表達(dá)的組織特異性、與抗旱性的關(guān)系和在基因工 程中的應(yīng)用等都未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供甘藍(lán)型油菜SKIP (BnSKIP)基因家族。
[0006] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE)技術(shù)，克隆了甘藍(lán)型油菜 SKIP基因家族成員的全長(zhǎng)cDNA和對(duì)應(yīng)的基因組序列，并進(jìn)行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析和 功能比較基因組學(xué)研宄。結(jié)果顯示：
[0007] 所述甘藍(lán)型油菜SKIP基因家族包括以下2個(gè)成員：BnSKIP-l基因和BnSKIP-2基 因；所述BnSKIP-1基因如SEQ ID No. 12所示，其全長(zhǎng)cDNA序列如SEQ ID No. 14所示；所 述BnSKIP-2基因如SEQ ID No. 13所示，其全長(zhǎng)cDNA序列如SEQ ID No. 15所示。
[0008] 甘藍(lán)型油菜SKIP基因家族2個(gè)成員間具有較高的同源性，基因組序列一致率為 92. 6%，編碼區(qū)序列一致性為97. 1%，編碼蛋白水平的一致性為98. 4%。甘藍(lán)型油菜SKIP 基因家族成員BnSKIP-1和BnSKIP-2與擬南芥SKIP(AtSKIP)基因間基因組序列一致率為 76. 7%和75. 8%，編碼區(qū)序列一致率為83. 1 %和82. 9%，編碼蛋白水平的一致率為86. 0% 和86. 7%，其中在SNW/SKIP結(jié)構(gòu)域的一致性達(dá)到94. 6%和95. 2%。核酸水平的序列比對(duì)、 系統(tǒng)發(fā)生聚類(lèi)、特征性變異堿基、特征性變異氨基酸等方面都表明，甘藍(lán)型油菜SKIP基因 家族2個(gè)成員都是AtSKIP基因的垂直同源基因，具有相似的結(jié)構(gòu)特征。
[0009] 定量RT-PCR檢測(cè)表明，甘藍(lán)型油菜SKIP基因家族2個(gè)成員總體表達(dá)是相似的，也 與擬南芥SKIP大體相似。BnSKIP基因家族及成員BnSKIP-1在5?種子中的表達(dá)量最高， 其次是花，接著是1?種子、蕾、葉、30D種子、4?種子、根、莢果皮、下胚軸、莖，在子葉中表 達(dá)量最低。成員BnSKIP-2在5?種子中的表達(dá)量最高，其次是花，但其表達(dá)量均比BnSKIP 基因家族及成員BnSKIP-1稍低，而在下胚軸和子葉中的表達(dá)量卻比BnSKIP基因家族及成 員BnSKIP-1稍高，具體表達(dá)量高低依次為下胚軸、1?種子、30D種子、子葉、葉、4?種子、 蕾、根、莢果皮、莖。
[0010] 甘藍(lán)型油菜SKIP基因家族總體及分成員逆境響應(yīng)和激素誘導(dǎo)表達(dá)模式分析表 明31^1(1?基因家族的總體表達(dá)受？￡6(10%)、甘露醇（5〇1^)、高溫、似(：1(25〇1111)和脫落 酸（0.1 mM ABA)處理誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，成員間對(duì)不同處理的響應(yīng)不完全一致。水楊酸（5mM SA) 處理對(duì)BnSKIP-2無(wú)誘導(dǎo)作用，但使BnSKIP-1顯著上調(diào)5倍左右。這些結(jié)果均表明BnSKIP 基因家族受多種逆境脅迫誘導(dǎo)，在甘藍(lán)型油菜抗旱分子機(jī)制中具有重要作用。
[0011] 本發(fā)明的目的之二在于提供含有甘藍(lán)型油菜SKIP基因家族或BnSKIP基因家族截 短片段的重組表達(dá)載體。
[0012] 為實(shí)現(xiàn)上述目的利用本發(fā)明的BnSKIP基因家族中的任一種或多種基因或基因截 短片段，可以構(gòu)建BnSKIP基因重組表達(dá)載體，用于SKIP基因的超量表達(dá)、反義抑制、RNA干 擾和CRISP/CAS9基因編輯等。優(yōu)選的，所述重組表達(dá)載體含有SEQ ID No. 14所示第1~ 2168位和SEQ ID No. 15所示第1-2214位的核苷酸序列。更優(yōu)選的，所述重組表達(dá)載體是在 PCAMBIA2301M1B載體的35S啟動(dòng)子和N0S終止子之間連入SEQ ID No. 14所示第1~2168 位和SEQ ID No. 15所示第1-2214位的核苷酸序列；所述PCAMBIA2301M1B載體由以下方法 制備：用EcoRI和Hindlll限制性?xún)?nèi)切酶切下pBI121載體的⑶S表達(dá)盒，連入pCAMBIA2301 的 EcoRI 和 Hindlll 之間，得 pCAMBIA230G ;然后用 SEQ ID N0. 24 和 SEQ ID N0. 25 所述序 列擴(kuò)增PFGC5941載體的BASTA表達(dá)盒，經(jīng)Hindlll酶后正向連入pCAMBIA230G的Hindlll 酶位點(diǎn)處，PCAMBIA2301M1B載體。
[0013] 本發(fā)明的目的之三在于提供含有上述重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。
[0014] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌中。
[0015] 本發(fā)明的目的之四在于提供甘藍(lán)型油菜SKIP基因家族在植物抗旱分子育種中的 應(yīng)用。
[0016] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明選取BnSKIP基因家族1個(gè)正義超量表達(dá)片段 81151(1?-1(核苷酸序列與5￡〇10吣.14的1-2168&口和一致，與5￡〇10吣.15的1-221你口高 度相似），將其插入PCAMBIA2301M1B載體的35S啟動(dòng)子和N0S終止子之間，構(gòu)建了BnSKIP-1 基因的正義超量表達(dá)載體pC2301MlB-BnSKIP-l，培養(yǎng)OX-BnSKIP-1工程菌株，并通過(guò)根癌 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的下胚軸侵染法轉(zhuǎn)入甘藍(lán)型油菜典型黑籽品種中油821，得到了10株外源基因 超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，轉(zhuǎn)基因植株在干旱脅迫條件下的抗性顯著 提高，是通過(guò)基因工程手段改良油菜抗逆性的重要基因資源。
[0017] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了SKIP基因在甘藍(lán)型油菜中的成員數(shù)、各成 員的全長(zhǎng)cDNA序列和基因組序列、進(jìn)化關(guān)系、表達(dá)的器官組織特異性和誘導(dǎo)特性等，并采 用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在甘藍(lán)型油菜中正義超量表達(dá)BnSKIP基因家族的一個(gè)成員，轉(zhuǎn)基因植株抗 旱顯著提高