本發(fā)明屬于水產(chǎn)遺傳分類(lèi)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，對(duì)光倒刺鲃不同群體進(jìn)行分類(lèi)的試劑盒。

背景技術(shù)：

光倒刺鲃（Spinibarbus hollandi）屬鯉形目，鯉科，鲃亞科，倒刺鲃屬。具有個(gè)體大、生長(zhǎng)快、食性廣、耐低氧、抗病力強(qiáng)、易養(yǎng)殖等優(yōu)點(diǎn)。分布于長(zhǎng)江、錢(qián)塘江、閩江、九龍江、珠江、元江、臺(tái)灣島及海南島等諸水系。不同流域的光倒刺鲃長(zhǎng)相相似，通過(guò)形態(tài)學(xué)分辨不同流域的光倒刺鲃?shì)^為費(fèi)力且不準(zhǔn)確。此試劑盒使用分子標(biāo)記的的方法，快速簡(jiǎn)便的對(duì)不同的光倒刺鲃群體進(jìn)行分類(lèi)。

串聯(lián)重復(fù)序列（SSR）是一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，也稱(chēng)為微衛(wèi)星序列，是一類(lèi)由幾個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列。通過(guò)電泳可充分顯示不同長(zhǎng)度重復(fù)序列片段的多態(tài)性。SSR標(biāo)記具有以下優(yōu)點(diǎn)：1.數(shù)量豐富，覆蓋整個(gè)基因組，多態(tài)性高；2.具有多等位基因的特性，提供的遺傳信息量高；3.以孟德?tīng)柗绞竭z傳，呈共顯性。在光倒刺鲃的種群分類(lèi)中引入該方法，并將多條長(zhǎng)度不一的SSR產(chǎn)物相組合，以最快最簡(jiǎn)潔的方法對(duì)光倒刺鲃的群體進(jìn)行鑒定分類(lèi)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于解決上述問(wèn)題，提供一種快速對(duì)光倒刺鲃不同群體進(jìn)行分類(lèi)的試劑盒，有效降低試驗(yàn)的工作量，提高準(zhǔn)確度。

本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)上述目的：

一種快速對(duì)光倒刺鲃不同群體進(jìn)行分類(lèi)的試劑盒，所述的試劑盒包括taq酶預(yù)混液、蒸餾水、引物，所述的引物包括試劑1、試劑2和試劑3，試劑1、試劑2和試劑3為含有4種SSR引物的混合試劑，試劑1包括產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為109bp、150bp、202bp、273bp的SSR的引物，引物序列分別為CCTGTGAAATGATTCCATGC，CTTTGACGTAAAACCCCCAA；CGAGAGCATCTTCACTGCTG，TGGTTTAAAATAGACGCGGG；TCCTGTCCTGAAAAGTGCAT，GGTGTCTGTTGAGGCACTGA；AGTTGGGATGTGGCAGTAGG，TGAGTGCTT GTGTGTGAGCA；試劑2包括產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為104bp、141bp、213bp、278bp的SSR引物，引物序列分別為ATCCGCTTCATCTCCAACAT，GGTGCAGTGAGAGTGTTTGC；CGGGGCAGAACTAAGACAAA，TTTGCAATGTGCAATGTGTTT；TGACGTGGCCAAGTATGGTA，GTTCGAGTCTCGGTACTGGC；AATTCTTCTCCAAGGGCTCC，TCGGTTAGACCAGAGAAAGCA；試劑3包括產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為114bp、154bp、204bp、248bp的SSR引物，引物序列分別為AACGTGTGTCTCTGGCACTG，ATGCGCAGTTTGTCCTGTAA；GCATTGTTGCTCTGCATGAT，CCTCCTCTTGTGTGTGGGAT；TTTTAGCAACCCCAAAATGC，CGCAGAGTCTCTCTCAACCC；CAGAAGTCTCTGTGTGGCATTT，TAAAAGTGTGAGGCCAGCAA。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化方案，引物序列三個(gè)均為5’→3’,正向引物在前，反向引物在后。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化方案，試劑1、試劑2和試劑3的濃度均為100μM/L，需要稀釋十倍用于實(shí)驗(yàn)或者-20℃條件下保存。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化方案，試劑1、試劑2和試劑3中的引物試劑所需的退火溫度為51-62℃。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化方案，所述的taq酶預(yù)混液購(gòu)自諾唯贊公司。

需要使用試劑1、試劑2和試劑3這三支引物試劑分別對(duì)待測(cè)個(gè)體進(jìn)行PCR。

使用該試劑盒進(jìn)行PCR時(shí)體系為50μl，25μl Taq預(yù)混液，13μl蒸餾水，10μl引物試劑，2μl的DNA，容器為200μl EP管。

對(duì)樣品進(jìn)行短暫離心。放入PCR儀。

PCR反應(yīng)程序設(shè)置：94℃預(yù)變性2min，94℃變性20s，51℃復(fù)性20s，72℃延伸25s，最終延伸4min，第二步到第四步進(jìn)行27次循環(huán)。

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯凝膠酰胺電泳，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%-12%濃度的聚丙烯凝膠酰胺，1×TBE作為緩沖液。

電泳后，使用掃描儀對(duì)凝膠圖進(jìn)行掃描或者拍照，使用PHOTOSHOP的標(biāo)尺或者尺子對(duì)每一條水平線上的PCR產(chǎn)物的條帶進(jìn)行比對(duì)和記錄，在同一水平線上，有條帶的記為1無(wú)條帶的記為0。

最后使用SPSS或者NTsys 2.0對(duì)上述的記錄進(jìn)行聚類(lèi)分析，得出結(jié)果。

由以上步驟可以看出，該試劑盒極大的減少了操作過(guò)程中的工作量，操作簡(jiǎn)便，將數(shù)種產(chǎn)物長(zhǎng)度不同的SSR進(jìn)行混合，極大的減少了操作過(guò)程中的工作量，PCR反應(yīng)最快50分鐘即可完成，電泳1個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，因此，該方法最快可在2個(gè)小時(shí)內(nèi)對(duì)光倒刺鲃不同群體進(jìn)行鑒定分類(lèi)。

上述的Taq酶預(yù)混液購(gòu)自諾唯贊生物公司。

本發(fā)明的有益效果是：

1、使用該試劑盒進(jìn)行分類(lèi)操作簡(jiǎn)便，將數(shù)種產(chǎn)物長(zhǎng)度不同的SSR進(jìn)行混合，極大的減少了操作過(guò)程中的工作量，更為準(zhǔn)確，使用SSR分子標(biāo)記，分類(lèi)快速，最快可在2小時(shí)內(nèi)分類(lèi)一批個(gè)體。

附圖說(shuō)明

圖1是對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯凝膠酰胺電泳圖；

圖2是構(gòu)建0,1矩陣示意圖，B1表示所有SSR共跑出來(lái)的條帶總數(shù)；C1表示的是材料數(shù)，D2缺失數(shù)值；

圖3是聚類(lèi)分析圖；

圖4是引物詳細(xì)信息圖（序列，長(zhǎng)度，退火溫度，引物名稱(chēng)等）。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明：

一種快速對(duì)光倒刺鲃不同群體進(jìn)行分類(lèi)的試劑盒，所述的試劑盒包括taq酶預(yù)混液、蒸餾水、引物，所述的引物包括試劑1、試劑2和試劑3，試劑1、試劑2和試劑3分別為含有4種SSR引物的混合試劑，試劑1包括產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為109bp、150bp、202bp、273bp的SSR的引物，引物序列分別為（引物序列三個(gè)均為5’→3’,正向引物在前，反向引物在后）CCTGTGAAATGATTCCATGC，CTTTGACGTAAAACCCCCAA；CGAGAGCATCTTCACTGCTG，TGGTTTAAAATAGACGCGGG；TCCTGTCCTGAAAAGTGCAT，GGTGTCTGTTGAGGCACTGA；AGTTGGGATGTGGCAGTAGG，TGAGTGCTT GTGTGTGAGCA；試劑2包括產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為104bp、 141bp、213bp、278bp的SSR引物，引物序列分別為ATCCGCTTCATCTCCAACAT，GGTGCAGTGAGAGTGTTTGC；CGGGGCAGAACTAAGACAAA，TTTGCAATGTGCAATGTGTTT；TGACGTGGCCAAGTATGGTA，GTTCGAGTCTCGGTACTGGC；AATTCTTCTCCAAGGGCTCC，TCGGTTAGACCAGAGAAAGCA；試劑3包括產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為114bp、154bp、204bp、248bp的SSR引物，引物序列分別為AACGTGTGTCTCTGGCACTG，ATGCGCAGTTTGTCCTGTAA；GCATTGTTGCTCTGCATGAT，CCTCCTCTTGTGTGTGGGAT；TTTTAGCAACCCCAAAATGC，CGCAGAGTCTCTCTCAACCC；CAGAAGTCTCTGTGTGGCATTT，TAAAAGTGTGAGGCCAGCAA。

試劑1、試劑2和試劑3中的引物試劑所需的退火溫度為51-62℃（圖4）。既保證引物與模板緊密結(jié)合也可保證引物的特異性，并且所有引物試劑可以在同一個(gè)PCR反應(yīng)程序內(nèi)進(jìn)行，降低工作量。所述的taq酶預(yù)混液購(gòu)自諾唯贊公司。

本發(fā)明采用10倍稀釋該試劑盒的引物試劑，進(jìn)行分類(lèi)實(shí)驗(yàn)。

本次采用北江，長(zhǎng)江以及北江與長(zhǎng)江雜交光倒刺鲃各4尾進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，1-4為北江光倒刺鲃，5-8為長(zhǎng)江光倒刺鲃，9-12為長(zhǎng)江與北江雜交光倒刺鲃，使用這三支引物試劑分別對(duì)這些個(gè)體進(jìn)行PCR。

實(shí)驗(yàn)PCR時(shí)體系為50μl，25μl Taq預(yù)混液，13μl蒸餾水，10μl的引物，2μl的DNA。

PCR反應(yīng)程序設(shè)置：94℃預(yù)變性2min，94℃變形20s，51℃復(fù)性20s，72℃延伸25s，最終延伸4min，第二步到第四步進(jìn)行27次循環(huán)。

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯凝膠酰胺電泳，使用12%濃度的聚丙烯凝酰胺。1×TBE作為緩沖液。并使用硝酸銀染色，拍照或掃描（圖1）。

1-9以及11-13泳道為北江群體，14-25泳道為長(zhǎng)江群體，27-38泳道為北江與長(zhǎng)江雜交群體，10泳道以及26泳道為PBR322marker。

1-4、14-17、27-30使用引物試劑1；5-8、18-21、31-34使用引物試劑2；9、11-13、22-25、35-38使用引物試劑3。

對(duì)每一個(gè)體PCR產(chǎn)物的條帶進(jìn)行記錄，在同一水平線上，有條帶的記為1無(wú)條帶的記為0，構(gòu)成0,1矩陣。

構(gòu)建NTsys表格B1表示所有SSR共跑出來(lái)的條帶總數(shù)；C1表示的是材料數(shù)，D2缺失數(shù)值（圖2）。

最后使用NTsys 2.0進(jìn)行聚類(lèi)分析，得出結(jié)果（圖3）。聚類(lèi)分析圖可知長(zhǎng)江群體聚為一支，北江群體聚為一支，雜交種群聚為一支。

由上步驟可以看出，將數(shù)種產(chǎn)物長(zhǎng)度不同的SSR進(jìn)行混合，極大的減少了操作過(guò)程中的工作量，PCR反應(yīng)最快50分鐘即可完成，電泳最快1個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，因此，該方法最快可在2個(gè)小時(shí)內(nèi)對(duì)光倒刺鲃不同群體進(jìn)行鑒定分類(lèi)。

最后所應(yīng)說(shuō)明的是：以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解：依然可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。