本發(fā)明落于生物學(xué)重要的功能化共聚物的合成領(lǐng)域。更具體來(lái)說(shuō)，它涉及核酸、特別是非常長(zhǎng)的核酸的合成所需的核苷酸，涉及含有這些核苷酸的試劑盒，并涉及它們用于生產(chǎn)合成的核酸序列或基因的用途。
背景技術(shù)：
：到目前為止，存在兩種主要類別的體外核酸合成：化學(xué)合成和酶法合成。最常用的體外核酸化學(xué)合成方法是由adams等(1983,j.amer.chem.soc.105:661)和froehler等(1983,tetrahedronlett.24:3171)描述的利用亞磷酰胺的聚合方法。在這種方法中，待添加的每種核苷酸在5’-oh基團(tuán)上受到保護(hù)，以便防止同一類型的幾個(gè)核苷酸的不受控制的聚合。一般來(lái)說(shuō)，5’-oh基團(tuán)的保護(hù)使用三苯甲基來(lái)進(jìn)行。為了防止由使用強(qiáng)有力試劑造成的任何降解，也可以對(duì)所述核苷酸攜帶的堿基進(jìn)行保護(hù)。一般來(lái)說(shuō)，所使用的保護(hù)包括異丁?；?reddy等，1997，nucleosides&nucleotides16:1589)。在每次摻入新的核苷酸后，所述鏈的最后一個(gè)核苷酸的5’-oh基團(tuán)經(jīng)歷去保護(hù)反應(yīng)，目的是使它可用于隨后的聚合步驟。構(gòu)成所述核酸的核苷酸所攜帶的含氮堿基本身只在完整的聚合完成之后被去保護(hù)。歸因于所涉及的試劑的本質(zhì)，這些化學(xué)合成方法被證明使用起來(lái)是昂貴和危險(xiǎn)的。此外，它們對(duì)于長(zhǎng)核酸片段(大于約100個(gè)核苷酸的片段)的合成來(lái)說(shuō)是低效的。為了開(kāi)發(fā)核酸合成方法，特別是為了以高得率生產(chǎn)非常長(zhǎng)的片段，并且也為了開(kāi)發(fā)與現(xiàn)有的遺傳元件例如dna質(zhì)粒相容的方法，開(kāi)發(fā)了即使在不存在模板鏈的情況下也能利用酶催化劑進(jìn)行核苷酸之間的偶聯(lián)反應(yīng)的合成技術(shù)。在這些酶合成方法中的某些方法中，直接向天然核苷酸添加能夠進(jìn)行聚合的酶(deng等，1983,meth.enzymol.100:96)。從被稱為引物的初始核酸片段開(kāi)始，添加聚合酶以及同一種類型的核苷酸。然后開(kāi)始聚合反應(yīng)，并通過(guò)重復(fù)這些產(chǎn)生磷酸二酯鍵的步驟順序地生長(zhǎng)核酸，直至通過(guò)物理或化學(xué)方法停止所述聚合。天然核苷酸(也就是說(shuō)未修飾和未受保護(hù)的核苷酸)的使用引起不受控制的聚合，產(chǎn)生核酸分子的非常不均勻的混合物。這是因?yàn)樵诘谝淮翁砑雍螅瑹o(wú)法阻止同一類型的幾個(gè)核苷酸的添加。在實(shí)際中，這種合成方法被證明不可用于合成具有所需序列的核酸片段。使用受保護(hù)的核苷酸有可能在一定程度上解決這種不受控制的聚合現(xiàn)象。所述受保護(hù)的核苷酸可以通過(guò)在所需磷酸二酯鍵之后完全或部分阻止磷酸二酯鍵的產(chǎn)生來(lái)停止所述合成。核苷酸是用于核酸合成的“單體”。它們的化學(xué)性質(zhì)以及它們反應(yīng)或不反應(yīng)的能力保證了所需的合成正確發(fā)生。重要的是能夠?qū)⑺龊塑账嵋运桧樞蛞粋€(gè)接一個(gè)地聚合，以便能夠合成包含所需序列的核酸片段。這種聚合等同于以必須嚴(yán)格堅(jiān)持的順序一個(gè)接一個(gè)地添加核苷酸。特別需要小心的是包含相同含氮堿基并在同時(shí)引入的幾個(gè)核苷酸不成串反應(yīng)，導(dǎo)致寡聚鏈的不受控制的生長(zhǎng)并且作為結(jié)果導(dǎo)致錯(cuò)誤核酸序列的產(chǎn)生。存在與天然核苷酸相比包含某些結(jié)構(gòu)修飾的修飾核苷酸，當(dāng)它們被用于核酸合成時(shí)所述結(jié)構(gòu)修飾為它們提供了某些優(yōu)點(diǎn)。它們通常通過(guò)細(xì)胞中天然存在的核苷酸的化學(xué)或酶修飾來(lái)獲得。一些修飾的核苷酸被稱為是受保護(hù)的，因?yàn)樗鼈儼柚勾Ａ舻幕瘜W(xué)功能在其他反應(yīng)期間被修飾的化學(xué)基團(tuán)。所述保護(hù)性基團(tuán)可以位于所述核苷酸分子的各種不同位點(diǎn)處。一種特定類型的受保護(hù)的核苷酸具有終止聚合反應(yīng)的功能。這些“鏈終止”核苷酸的作用在于防止引入到反應(yīng)介質(zhì)中的核苷酸的過(guò)量且不想要的聚合。當(dāng)終止核苷酸被摻入到核酸分子中時(shí)，它阻礙另一個(gè)核苷酸的后續(xù)聚合。因此，在延伸步驟期間可以向每個(gè)核酸分子添加單個(gè)核苷酸。即使構(gòu)成所述待合成核酸片段的各種不同核苷酸被順序引入，也必需使用“終止”核苷酸以便防止不想要的重復(fù)現(xiàn)象?！敖K止”核苷酸的使用保證了核酸合成方法的可靠性和可重復(fù)性，不論所述方法是化學(xué)法還是酶法。它們可能對(duì)給定方法的合成性能水平具有極大影響。用于核酸化學(xué)合成的受保護(hù)的核苷酸在5’-oh位置中包含通過(guò)共價(jià)鍵合到dmt(4,4’-二甲氧基三苯甲基)基團(tuán)而提供的保護(hù)，并在3’-oh位置中包含充當(dāng)核苷酸彼此之間的聚合反應(yīng)的催化劑的亞磷酰胺基團(tuán)。這些包含dmt和亞磷酰胺基團(tuán)的核苷酸被稱為受保護(hù)的亞磷酰胺核苷酸。針對(duì)不受控制的聚合的保護(hù)由保護(hù)5’-oh的dmt基團(tuán)提供。在核酸化學(xué)合成期間，發(fā)生被稱為去三苯甲基化的第一個(gè)去保護(hù)階段，以便除去dmt基團(tuán)并獲得可用于與待插入的核苷酸反應(yīng)的5’-oh基團(tuán)。特別重要的是獲得可能的最高效的去保護(hù)反應(yīng)，以便在所有情況下允許添加下一個(gè)核苷酸。在核酸的化學(xué)合成期間專一地使用受保護(hù)的亞磷酰胺核苷酸。它們的“終止”功能事實(shí)上由鍵合到5’-oh的dmt基團(tuán)提供。由于化學(xué)合成以3’至5’反應(yīng)進(jìn)行，因此保護(hù)5’-oh的dmt基團(tuán)的存在使得可以阻止任何過(guò)度的聚合直至下一個(gè)去保護(hù)步驟。因此，受保護(hù)的亞磷酰胺核苷酸不適合于酶合成方法。還已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一些用于“第二代”測(cè)序方法的“終止”核苷酸。然而，除了完全不適合于核酸合成之外，用于所述測(cè)序的的終止核苷酸具有某些完全不可接受的限制。主要的限制是它們被延伸酶類利用的能力。這是因?yàn)殒I合到用于所述測(cè)序的終止核苷酸的熒光標(biāo)記物具有相當(dāng)大的尺寸。然而，延伸酶類在其活性位點(diǎn)中具有極小量的空間，因此幾乎沒(méi)有機(jī)會(huì)能夠接受擁有龐大熒光基團(tuán)例如包含共軛芳香環(huán)的基團(tuán)的終止核苷酸以便聚合它們。現(xiàn)代dna測(cè)序技術(shù)是基于模板鏈、即被測(cè)序鏈與經(jīng)歷延伸的鏈之間的互補(bǔ)相互作用。一般來(lái)說(shuō)，用于測(cè)序的修飾的核苷酸必須具有與其互補(bǔ)核苷酸配對(duì)的完整性質(zhì)。所述修飾的核苷酸應(yīng)該保留這些對(duì)于它們的用途來(lái)說(shuō)必不可少的相互作用性質(zhì)。然而，構(gòu)成所述用于測(cè)序的修飾核苷酸的含氮堿基是天然含氮堿基例如腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧啶的類似物，因此不具有相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)：某些原子被其他原子代替，并且一些基團(tuán)被添加或缺失。這些非天然含氮堿基可能具有許多缺點(diǎn)，例如不被活生物體識(shí)別。一旦摻入后，將終止核苷酸去保護(hù)以便允許添加下一個(gè)核苷酸。所述去保護(hù)步驟包括可以刪除負(fù)責(zé)終止功能的基團(tuán)的物理或化學(xué)手段。與所述修飾的核苷酸相關(guān)的其他官能團(tuán)在類似的去保護(hù)步驟期間被刪除。因此，在各種不同的測(cè)序方法中，幾個(gè)去保護(hù)步驟通常是必需的，以便能夠移動(dòng)到下一個(gè)核苷酸的確定。這些各種不同的去保護(hù)步驟積累并放大了強(qiáng)有力試劑或極端物理?xiàng)l件的使用，它們促進(jìn)反應(yīng)介質(zhì)中存在的各種物質(zhì)的降解，特別是核酸的降解。此外，大量去保護(hù)步驟相當(dāng)大地降低了方法的快速性及其性能水平。在用于測(cè)序的修飾核苷酸的使用期間遇到的另一個(gè)主要問(wèn)題是在去保護(hù)步驟之后出現(xiàn)傷痕。充當(dāng)官能團(tuán)與核苷酸之間的聯(lián)系的各種不同化學(xué)結(jié)構(gòu)在所述去保護(hù)步驟期間能夠斷裂。然而，這種斷裂不能分開(kāi)所有的化學(xué)鍵合結(jié)構(gòu)。因此，盡管經(jīng)歷各種不同的去保護(hù)步驟，但這些結(jié)構(gòu)的或大或小的部分保持附連于所述核苷酸。這些殘留物對(duì)測(cè)序過(guò)程和總的來(lái)說(shuō)所述核酸的任何用途或修飾具有非常有害的影響。不論保留何種核苷酸結(jié)構(gòu)，現(xiàn)有的修飾核苷酸不能滿足酶合成方法的期望。它們被延伸酶類的不佳的使用，各種不同官能團(tuán)的定位，修飾的含氮堿基的系統(tǒng)性使用，保留與互補(bǔ)核苷酸的相互作用的限制，大量的去保護(hù)步驟和殘留傷痕的存在，都阻止了將這些核苷酸用于核酸的酶法合成。因此，到目前為止，尚未提出與核酸的酶法合成相容、特別是用于非常長(zhǎng)的核酸片段的酶法合成的受保護(hù)的核苷酸的令人滿意的技術(shù)解決方案。發(fā)明概述本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供適合于核酸的酶法合成的修飾的核苷酸。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用各種不同官能團(tuán)修飾的天然核苷酸，以便可以使它們與它們?cè)诤怂岷铣蛇^(guò)程中的用途相容。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供修飾的核苷酸，其可以合成非常長(zhǎng)的核酸，也就是說(shuō)至少幾百個(gè)或幾千個(gè)核苷酸的核酸，并且更具體來(lái)說(shuō)按照在同一申請(qǐng)人尚未公布的專利申請(qǐng)fr14-53455中所描述的方法。發(fā)明描述為此，本發(fā)明提供了旨在用于核酸例如長(zhǎng)鏈核酸的酶法合成的修飾的核苷酸，其包含“天然”含氮堿基或天然含氮堿基類似物、核糖或脫氧核糖碳水化合物和至少一個(gè)磷酸酯基團(tuán)，其特征在于它包含至少一個(gè)被稱為修飾物基團(tuán)的r或r’基團(tuán)，所述基團(tuán)：-由所述天然含氮堿基或類似物攜帶，-和/或由所述核糖或脫氧核糖分子的3’位置中的氧攜帶，使其能夠在核酸合成期間阻斷所述核苷酸的聚合(所述修飾物基團(tuán)此時(shí)是保護(hù)基團(tuán))和/或能夠使所述核苷酸與不同于另一個(gè)核苷酸的另一個(gè)分子例如蛋白質(zhì)相互作用，r包含至少一個(gè)功能性末端基團(tuán)(其也可以被稱為效應(yīng)基團(tuán))。更具體來(lái)說(shuō)，在有利情況下，所述修飾物基團(tuán)不是大的基團(tuán)例如包含共軛芳香環(huán)的基團(tuán)，以便特別是允許接近酶的反應(yīng)位點(diǎn)。本發(fā)明的核苷酸可以是單磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯，所述磷酸酯基團(tuán)是游離的，也就是說(shuō)未修飾的。本發(fā)明的核苷酸采取下列式(i)、(iii)和(iv)之一的形式：其中：(pp)po表示單、二或三磷酸酯基團(tuán)，(oh)描述了核糖或脫氧核糖分子的可能性，t是氫或選自下列的可切割原子團(tuán)：-nh2；-n3；-(c＝o)h；-cnh2n+1，其中n在1至30之間，優(yōu)選在1至12之間；-三甲基甲硅烷基；-磷酸酯；-so3；-(c＝o)ocnh2n+1，其中n在1至30之間，優(yōu)選在1至12之間；-(c＝o)scnh2n+1，其中n在1至30之間，優(yōu)選在1至12之間；-硝基苯；-苯甲基；-鹵代苯甲基；-酰胺；-碳酸酯；-苯甲?；?；-過(guò)氧基；-腈；-硫醇；-酰亞胺；-氨基甲酸酯；-氰酸酯；-炔；-苯基；-鹵代苯基；-吡啶甲基；任選地存在的m是共價(jià)鍵合到q和z的基團(tuán)，m選自烷基、烯基、炔基、芳基、烷芳基、雜芳基、酰基、烷氧基、烷基氨基、烷氧基氨基、酰胺基、烷基酰亞胺基、烯基酰亞胺基、芳基酰亞胺基、氟代烷基、烷基磷酸酯、烷基硫基、硫代?；?、烷基磺?；?、芳基磺酰基、烷基亞磺?；⑼榛@、烷基锍、烷基甲硅烷基、烷基羰基、烷基carbanyl、烷基氨甲?；蛲榛u基氨基，z是可切割基團(tuán)，選自–o-、-s-、＝sh-、＝s＝、≡s-、-sih2-、＝sih-、＝si＝、≡si-、-se-、＝seh-、≡se-、＝se＝、-seh2-、-ph-、＝p-、＝ph＝、≡p＝、≡ph-、-ph3-、-ash-、＝as-、＝ash＝、≡as＝、≡ash-、-ash3-、胺、酯、甲硅烷基、烷基、苯甲基、硝基苯甲基、酰胺、碳酸酯、苯甲?；?、過(guò)氧基、腈、硫醇、酰亞胺、氨基甲酸酯、氰酸酯、羥胺、亞砜、磺酸酯、硫代亞磺酸酯、硫酯、酰基鹵、次碘酸基(hypoiodyl)、炔、鹵代苯基、鹵代苯甲基、吡啶甲基、二醇或二硫化物，或者當(dāng)m是–硝基苯甲基-、–硝基甲苯基-、–硝基二甲苯基-、–硝基萘基-或–硝基苯基-時(shí)，選自-ch2或–nh-，q是r或r’基團(tuán)的末端官能團(tuán)或效應(yīng)基團(tuán)，q選自生物素、蛋白質(zhì)、序列確定的多核苷酸、碳水化合物、抗原、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、糖苷例如地高辛、含硫特別是帶有硫醇官能團(tuán)的原子團(tuán)例如谷胱甘肽或雙配位基配體例如鄰苯二酚，r和r’可能獨(dú)立或同時(shí)存在，并且當(dāng)r和r’同時(shí)存在時(shí)：z基團(tuán)也許相同或不同，m基團(tuán)也許相同或不同，q基團(tuán)也許相同或不同，“堿基”表示選自腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤或尿嘧啶的“天然”含氮堿基或天然含氮堿基類似物，例外的是當(dāng)r’存在并且q包含生物素時(shí)不表示胸腺嘧啶。優(yōu)選地，t在其不是氫時(shí)，以及r和r’，構(gòu)成了提供核酸合成過(guò)程的延伸步驟的鏈終止的基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)“可切割原子團(tuán)或基團(tuán)”打算意味著共價(jià)鍵合到核糖分子的3’或2’位置中或脫氧核糖分子的3’位置中的氧或鍵合到含氮堿基的原子的原子團(tuán)或基團(tuán)，所述鍵可以通過(guò)化學(xué)或光化學(xué)方法打斷。有利情況下，本發(fā)明的核苷酸分子的可切割原子團(tuán)或基團(tuán)t和z的所有鍵的斷裂完全并且同時(shí)進(jìn)行，也就是說(shuō)在同一個(gè)“去保護(hù)”步驟期間進(jìn)行，特別是通過(guò)施加同一種條件或通過(guò)同一種試劑的組合作用。修飾物基團(tuán)的這種刪除優(yōu)選是完全的，以便導(dǎo)致產(chǎn)生不含任何修飾物基團(tuán)的核苷酸，也就是說(shuō)與天然核苷酸一致(除了含氮堿基的結(jié)構(gòu)之外)。正如前面指明的，r和r’基團(tuán)是在有利情況下提供核酸合成過(guò)程的延伸步驟的鏈終止的基團(tuán)。這些r和r’基團(tuán)可以具有利用置于r和r’的游離末端處的官能團(tuán)q而附連到不同于核酸的另一個(gè)分子例如支持物上的分子的性質(zhì)。這是因?yàn)樵诤怂岷铣蛇^(guò)程中，例如在上面提到的fr14-53455所描述的過(guò)程中，某些步驟假定所使用的修飾的核苷酸可以與固相支持物相互作用。這些固相支持物在其表面處包含與本發(fā)明的核苷酸的修飾物基團(tuán)相容的分子、蛋白質(zhì)或化學(xué)官能團(tuán)。修飾的核苷酸的這種功能對(duì)于核酸合成過(guò)程正確發(fā)生來(lái)說(shuō)是必不可少的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述修飾的核苷酸包含允許它們例如通過(guò)與存在于固相支持物表面處的分子形成解離常數(shù)非常低、特別是低于10-6mol/l的合并復(fù)合物而變得與固相支持物合并以便純化的基團(tuán)。在去保護(hù)步驟后，提供這種合并功能的基團(tuán)能夠被破壞，由此消除核苷酸與固相支持物之間的相互作用。在這種情況下，本發(fā)明的核苷酸具有雙重優(yōu)點(diǎn)，即在同一個(gè)核苷酸上存在允許純化的基團(tuán)和與其他修飾物基團(tuán)同時(shí)地破壞所述基團(tuán)的能力。優(yōu)選地，修飾物基團(tuán)r由所述含氮堿基攜帶并形成下述結(jié)構(gòu)(v)之一：在所述結(jié)構(gòu)中：“糖”表示所述核苷酸分子的含氮堿基與核糖或脫氧核糖分子之間的連接(bond)，z1和z2是相同或不同的可切割z基團(tuán)。z、m和q基團(tuán)具有前面描述的意義。在本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方式中，所述核苷酸被含氮堿基的通常參與watson-crick配對(duì)機(jī)制的原子、也就是說(shuō)由通常參與互補(bǔ)核苷酸配對(duì)的胺官能團(tuán)的氮原子所攜帶的基團(tuán)修飾。各種不同修飾物基團(tuán)與構(gòu)成含氮堿基的原子的附連，總是利用可切割類型的z基團(tuán)通過(guò)共價(jià)類型的鍵來(lái)進(jìn)行。在腺嘌呤類型的含氮堿基的情況下，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式包括將所述修飾物基團(tuán)鍵合到伯胺基團(tuán)6-nh2(結(jié)構(gòu)va)。在胸腺嘧啶類型的含氮堿基的情況下，本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式包括將所述修飾物基團(tuán)鍵合到仲胺基團(tuán)3-nh(結(jié)構(gòu)vt)。在胞嘧啶類型的含氮堿基的情況下，本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式包括將所述修飾物基團(tuán)鍵合到伯胺基團(tuán)4-nh2(結(jié)構(gòu)vc)。在尿嘧啶類型的含氮堿基的情況下，本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式包括將所述修飾物基團(tuán)鍵合到仲胺基團(tuán)3-nh(結(jié)構(gòu)vu)。在鳥(niǎo)嘌呤類型的含氮堿基的情況下，本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式包括利用可切割基團(tuán)將所述修飾物基團(tuán)鍵合到兩個(gè)胺基之一或同時(shí)鍵合到兩個(gè)胺基，一個(gè)是仲胺基1-nh，另一個(gè)是伯胺基2-nh2(結(jié)構(gòu)vg)。在兩個(gè)胺基1-nh和2-nh2被同時(shí)用于攜帶所述修飾物基團(tuán)的特定情況下，可能在各個(gè)不同的分開(kāi)的子基團(tuán)之間出現(xiàn)優(yōu)選由6個(gè)原子構(gòu)成的環(huán)。這個(gè)環(huán)任選地引起所述修飾物基團(tuán)的結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。在所述修飾物基團(tuán)由含氮堿基攜帶的這些實(shí)施方式中，所述核苷酸的3’oh和/或2’oh位點(diǎn)是自由的，促進(jìn)了它們?cè)诤怂岷铣善陂g用作延伸酶類的底物?？赡艽嬖诜肿娱g氫鍵。事實(shí)上，由所述含氮堿基攜帶的修飾物基團(tuán)r可以形成下列結(jié)構(gòu)(vi)之一：其中：“糖”表示所述核苷酸分子的含氮堿基與核糖或脫氧核糖分子之間的連接，x1和x2也許相同或不同，表示由m攜帶并能夠與所述修飾的核苷酸的含氮堿基形成分子內(nèi)氫鍵(這些氫鍵類似于在互補(bǔ)核苷酸之間的常規(guī)配對(duì)期間觀察到的分子間氫鍵)的氮、氧或硫原子。這種構(gòu)型加強(qiáng)了修飾的核苷酸的穩(wěn)定性。它也影響修飾物基團(tuán)的緊實(shí)度，并允許它們被通常依賴于模板鏈的存在的延伸酶類利用。在腺嘌呤類型的含氮堿基的情況下，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式包括將所述修飾物基團(tuán)鍵合到伯胺基團(tuán)6-nh2(結(jié)構(gòu)via)。存在的x1基團(tuán)促進(jìn)與嘌呤環(huán)的1位氮原子產(chǎn)生分子內(nèi)氫鍵。因此，模擬了互補(bǔ)的胸腺嘧啶的存在。在胸腺嘧啶類型的含氮堿基的情況下，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式包括將所述修飾物基團(tuán)鍵合到仲胺基團(tuán)3-nh(結(jié)構(gòu)vit)。存在的x1基團(tuán)促進(jìn)與嘧啶環(huán)的4位中的氧原子產(chǎn)生分子內(nèi)氫鍵。因此，模擬了互補(bǔ)的腺嘌呤的存在。在胞嘧啶類型的含氮堿基的情況下，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式包括將所述修飾物基團(tuán)鍵合到伯胺基團(tuán)4-nh2(結(jié)構(gòu)vic)。存在的x1和x2基團(tuán)促進(jìn)與嘧啶環(huán)的3位中的氮原子和2位中的氧原子產(chǎn)生分子內(nèi)氫鍵。因此，模擬了互補(bǔ)的鳥(niǎo)嘌呤的存在。在鳥(niǎo)嘌呤類型的含氮堿基的情況下，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式包括利用可切割的z1和z2基團(tuán)將所述修飾物基團(tuán)鍵合到兩個(gè)胺基，第一個(gè)是仲胺基1-nh，第二個(gè)是伯胺基2-nh2(結(jié)構(gòu)vig)。存在的x1基團(tuán)促進(jìn)與嘌呤環(huán)的6位中的氧原子產(chǎn)生分子內(nèi)氫鍵。因此，模擬了互補(bǔ)的胞嘧啶的存在。在尿嘧啶類型的含氮堿基的情況下，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式包括將所述修飾物基團(tuán)鍵合到仲胺基團(tuán)3-nh(結(jié)構(gòu)viu)。存在的x1基團(tuán)促進(jìn)與嘧啶環(huán)的4位中的氧產(chǎn)生氫鍵。因此，模擬了互補(bǔ)的腺嘌呤的存在。本發(fā)明的修飾的核苷酸的使命不必定是與由任何模板鏈所攜帶的可能的互補(bǔ)核苷酸配對(duì)。在使用作為本發(fā)明的主題的修飾的核苷酸產(chǎn)生核酸期間，所述核苷酸不必定打算通過(guò)與可能的模板鏈的互補(bǔ)相互作用而摻入。作為本發(fā)明的主題的修飾的核苷酸具有允許它們?cè)谔囟ú襟E期間失去它們的修飾物基團(tuán)的特性。在失去它們的所有修飾物基團(tuán)后，本發(fā)明的核苷酸由此被轉(zhuǎn)化，然后恢復(fù)它們與模板鏈所攜帶的互補(bǔ)核苷酸配對(duì)的能力。根據(jù)一個(gè)特定實(shí)施方式，本發(fā)明的核苷酸隨后可以在即使不存在互補(bǔ)鏈的情況下，用作通常依賴于與正經(jīng)歷合成的鏈互補(bǔ)的模板核酸鏈的存在的聚合酶的底物。r或r’基團(tuán)的功能性末端原子團(tuán)q優(yōu)選地能夠在核酸合成期間利用附連到固相支持物表面的核酸之外的分子例如蛋白質(zhì)，允許所述核苷酸附連到所述支持物，并且更優(yōu)選地，能夠根據(jù)下述相互作用對(duì)中的一者或另一者，與核酸之外的分子相互作用：抗原/抗體，激素/受體，生物素/(鏈)親和素，神經(jīng)遞質(zhì)/受體，聚合酶/啟動(dòng)子，地高辛/抗地高辛抗體，碳水化合物/凝集素，含硫原子團(tuán)/金屬例如金，谷胱甘肽/谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶，或雙配位基配體/金屬氧化物。所述金屬氧化物可以是例如tio2、zro2、ceo2、fe3o4、ga2o3、in2o3、cr2o3、al2o3、zno、cuo、cu2o3、mn3o4、mn2o3、v2o3、moo2。所述雙配位基配體可以是鄰苯二酚、異羥肟酸或羥基羧酸。所述t原子團(tuán)被稱為“阻斷物”，因?yàn)樗Ｗo(hù)碳水化合物的3’羥基或2’羥基以防任何其他核苷酸的添加。優(yōu)選地，在核酸合成期間，t和z或z1、z2是通過(guò)利用波長(zhǎng)在10-3至10-11米之間的電磁輻射輻照所述核苷酸、特別是通過(guò)暴露于紫外輻射而可切割的。本發(fā)明的有利實(shí)施方式涉及下述核苷酸：-一種核苷酸，其中x1和x2是–nh，t是–nh2，z是–ch2，m是甲基硝基苯甲基-，并且q是–生物素，-一種核苷酸，其中x1和x2是–nh，t是–nh2，z、z1和z2各自是–o-，m是–硝基萘基-，并且q是–生物素，-一種僅帶有r’基團(tuán)的式(i)的核苷酸，其中：z是–(c＝o)-，m是–c8h16-，并且q是–nh-生物素基，-一種具有特定結(jié)構(gòu)(v)的核苷酸，其中z,z1和z2各自是–(coo)-，m是–叔丁基硝基苯甲基-，并且q是–nh-生物素基。本發(fā)明還涉及如上所描述的核苷酸的用途，其用于基因、合成的核酸序列、dna、rna或核酸聚合物的生產(chǎn)過(guò)程中，特別是按照酶法合成方法。一種有利的用途是用于將所述核苷酸并入到先前固定化在固相支持物上的多核苷酸鏈中，更特別是當(dāng)所述多核苷酸鏈通過(guò)其5’末端附連并且所述核苷酸的并入通過(guò)所述多核苷酸鏈的3’末端進(jìn)行時(shí)。然而，本發(fā)明的核苷酸處于游離形式，如果需要的話與平衡離子組合。盡管它們具有附連到固相支持物的能力，但這些核苷酸在并入到多核苷酸鏈中時(shí)從任何支持物上脫離。因此它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)不連接到任何固相支持物。所述修飾的核苷酸的游離本性對(duì)于它們?cè)谏形垂嫉膶＠暾?qǐng)fr14-53455中所描述的方法中的使用來(lái)說(shuō)是特別重要的，因?yàn)樗龊塑账岜惶砑拥奖旧肀还潭ɑ暮怂崞?。這些片段被釋放，然后憑借剛剛并入的核苷酸的效應(yīng)基團(tuán)，隨后通過(guò)相反末端附連到第二固相支持物。因此，附連到固相支持物的是所需序列的完整核酸鏈或多核苷酸，而不是用于構(gòu)建所述多核苷酸的本發(fā)明的核苷酸。本發(fā)明還涉及一種試劑盒，其包含至少一種本發(fā)明的修飾的核苷酸，更具體來(lái)說(shuō)，所述試劑盒可以包含各種不同的修飾的核苷酸、延伸酶以及能夠附連至少一種所述核苷酸的固相支持物。附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明將結(jié)合附圖并利用下面的說(shuō)明性實(shí)施例進(jìn)行更詳細(xì)描述，在所述附圖中：圖1示出了作為本發(fā)明的主題的修飾的核苷酸的各種不同的通用結(jié)構(gòu)；圖2呈現(xiàn)了式(v)的修飾的核苷酸的特定結(jié)構(gòu)；圖3呈現(xiàn)了天然含氮堿基腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤的結(jié)構(gòu)式；圖4示出了能夠發(fā)生分子內(nèi)氫鍵類型的相互作用的式(vi)的修飾物基團(tuán)的實(shí)例；圖5圖示描述了化合物nh2-dttp-nitrob-biot的合成；圖6圖示描述了化合物nh2-dgtp-nitron-biot的合成；圖7圖示描述了化合物fa-biot-dntp的合成；圖8圖示描述了化合物datp-nitrob-biot的合成；圖9圖示描述了化合物dctp-nitrob-biot的合成；圖10示出了聚合的化合物nh2-dt-nitrob-biot的去保護(hù)的實(shí)例；圖11示出了聚合的化合物nh2-dg-nitrob-biot的去保護(hù)的實(shí)例；圖12示出了聚合的化合物fa-biot-dntp的去保護(hù)的實(shí)例；圖13示出了聚合的化合物da-nitrob-biot的通過(guò)光切割的去保護(hù)的實(shí)例；圖14示出了聚合的化合物dc-nitrob-biot的通過(guò)化學(xué)切割的去保護(hù)的實(shí)例；圖15呈現(xiàn)了符合本發(fā)明的修飾的核苷酸的實(shí)例，所述q基團(tuán)是鄰苯二酚；圖16圖示描述了化合物fa-cat-dntp的合成。實(shí)施例修飾的(受保護(hù)的)核苷酸的合成–說(shuō)明性實(shí)施例1至6實(shí)施例1–化合物nh2-dttp-nitrob-biot的合成(圖5)步驟a1：向溶解在吡啶中的5g2’-脫氧胸苷添加2.2mlet3n(三乙胺)和175mgdmap(4-二甲基氨基吡啶)，然后添加5.25gdmtcl(4,4’-二甲氧基三苯甲基氯化物)，在室溫下過(guò)夜。然后向混合物添加2.4mlet3n和1.27mlmscl(甲磺酰氯)。在室溫下溫浴2h后，將混合物過(guò)濾并用乙酸乙酯洗滌。將濾液濃縮并溶解在75ml乙醇中，向其添加1mnaoh。在回流1.5h后，將混合物冷卻到室溫并添加1mhcl。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)掉乙醇并將殘留物用ch2cl2萃取。在硅膠柱純化后，獲得產(chǎn)物dttp-a1。步驟a2：在0℃下，向2.237mmol產(chǎn)物dttp-a1、2.1g三苯基膦和1.3gn-羥基苯鄰二甲酰亞胺在50ml四氫呋喃中的溶液添加1.75mln,n’-二異丙基偶氮二甲酸酯。在室溫下重新加熱過(guò)夜后，將反應(yīng)產(chǎn)物用0.3ml水處理，并在真空下蒸發(fā)掉溶劑。大多數(shù)雜質(zhì)通過(guò)層析消除，由此給出產(chǎn)物dtt-a2。步驟a3：在室溫下向1當(dāng)量化合物dtt-a2添加dmf中的10當(dāng)量lih。將混合物反應(yīng)30min。通過(guò)添加3-氨基-4-(溴甲基)-5-硝基苯基生物素繼續(xù)進(jìn)行反應(yīng)，然后將混合物攪拌幾小時(shí)。獲得產(chǎn)物dtt-a3。步驟a4：將化合物dttp-a3重懸浮在甲醇中并用濃鹽酸水溶液處理。將溶液冷卻至-20℃過(guò)夜，得到產(chǎn)物dttp-a4。步驟a5：向溶解在2ml吡啶和1.7ml二噁烷中的425mg5’-oh核苷類似物dttp-a4添加130mg2-氯-4h-1,2,3-苯并二氧磷-4-酮在1.3ml二噁烷中的溶液。將所述混合物在室溫下留置20min。添加dmf中的1.4mmol三丁基焦磷酸銨和3.2mmol三丁基胺的混合物。20min后，添加180mg碘和0.28ml水在14ml吡啶中的溶液。30min后，通過(guò)添加5％na2so3水溶液停止反應(yīng)。在真空下蒸發(fā)掉溶劑。添加25ml水和20mlch3cn。將混合物過(guò)濾并通過(guò)反相hplc純化，給出三磷酸酯化合物，在所討論的情況下是dttp-a5。步驟a6：在-5℃下，向無(wú)水ch3cl2中的3.725mmol化合物dttp-a5添加0.385ml冷甲基肼。10min后，形成1,2-二氫-4-羥基-2-甲基-1-氧酞嗪的沉淀物。將混合物在室溫下攪拌1h。通過(guò)過(guò)濾除去所述沉淀物并用ch2cl2洗滌。然后將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮并通過(guò)層析純化，給出產(chǎn)物nh2-dttp-nitrob-biot。實(shí)施例2–化合物nh2-dgtp-nitron-biot的合成(圖6)步驟b1：向1.845mmol2’-脫氧鳥(niǎo)苷和326mg咪唑在無(wú)水dmf中的攪拌的溶液添加2.4mmol叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物。將所述反應(yīng)在室溫下攪拌溫育20h。在真空下除去溶劑并將殘留物通過(guò)層析進(jìn)行純化，給出產(chǎn)物dgtp-b1。步驟b2：在0℃下，向2.237mmol產(chǎn)物dgtp-b1、2.1g三苯基膦和1.3gn-羥基苯鄰二甲酰亞胺在50ml四氫呋喃中的溶液添加1.75mln,n’-二異丙基偶氮二甲酸酯。在室溫下重新加熱過(guò)夜后，將反應(yīng)產(chǎn)物用0.3ml水處理，并在真空下蒸發(fā)掉溶劑。通過(guò)層析除去大部分雜質(zhì)，然后給出產(chǎn)物dgtp-b2。步驟b3：使用10ml吡啶和真空下蒸發(fā)將3.785mmol化合物dgtp-b2干燥幾次。將殘留物溶解在12.5mlch2cl2中。添加9mmol二異丙基乙基胺和7.57mmol6-氨基-4,5-雙(碘氧基)-3-硝基萘-1-基-5-生物素。當(dāng)反應(yīng)完成時(shí)，將混合物在100mlch2cl2中稀釋，并將有機(jī)相用50ml碳酸氫鈉和50ml水洗滌。然后將它在硫酸鈉上干燥。在真空下蒸發(fā)掉溶劑并將產(chǎn)物通過(guò)層析進(jìn)行純化，給出dgtp-b3。步驟b4：將3.75mmol化合物dgtp-b3溶解在20mlthf中，并用thf中的1mtbaf(四正丁基氟化銨)處理。反應(yīng)在攪拌約2h后完成。將混合物用ch2cl2萃取并通過(guò)層析進(jìn)行純化，給出dgtp-b4。步驟b5：與實(shí)施例1的步驟a5類似地對(duì)425mg5’-oh核苷類似物進(jìn)行處理。將最終的混合物過(guò)濾并通過(guò)反相hplc進(jìn)行純化，以給出三磷酸酯化合物，在所討論的情況下是dgtp-b5。步驟b6：在-5℃下，向無(wú)水ch2cl2中的3.725mmol化合物dgtp-b5添加0.385ml冷甲基肼。在10min后，形成1,2-二氫-4-羥基-2-甲基-1-氧酞嗪的沉淀物。將混合物在室溫下攪拌1h。通過(guò)過(guò)濾除去所述沉淀物并用ch2cl2洗滌。然后將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮并通過(guò)層析進(jìn)行純化，給出產(chǎn)物nh2-dgtp-nitron-biot。實(shí)施例3–化合物fa-biot-dntp的合成(圖7)步驟c1：將100μl1mω1-生物素壬酸的dmf溶液與100μl1m羰基二咪唑的dmf溶液混合。咪唑離子的形成在室溫下在30s內(nèi)發(fā)生。然后向混合物添加100μl50mm脫氧核糖核苷酸5’-三磷酸酯的水溶液。產(chǎn)物在室溫下在12h內(nèi)形成。然后將它用丙酮沉淀并溶解在水中，以便最終通過(guò)層析進(jìn)行純化，給出產(chǎn)物fa-biot-dntp。實(shí)施例4–化合物datp-nitrob-biot的合成(圖8)步驟d1：向溶解在吡啶中的5g2’-脫氧腺苷添加2.2mlet3n和175mgdmap，然后添加5.25gdmtcl，在室溫下過(guò)夜。然后向混合物添加2.4mlet3n和1.27mlmscl。在室溫下溫育2h后，將混合物過(guò)濾并用乙酸乙酯洗滌。將濾液濃縮并溶解在75ml乙醇中，向其添加1mnaoh。在回流1.5h后，將混合物冷卻至室溫并添加1mhcl。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)掉乙醇并將殘留物用ch2cl2萃取。在硅膠柱純化后，獲得產(chǎn)物datp-d1。步驟d2：向1.845mmoldatp-d1和326mg咪唑在無(wú)水dmf中的攪拌的溶液添加2.4mmol叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物。將反應(yīng)在室溫下攪拌溫育20h。通過(guò)施加真空除去溶劑并將殘留物通過(guò)層析進(jìn)行純化，給出產(chǎn)物datp-d2。步驟d3：將化合物datp-d2重懸浮在甲醇中并用濃鹽酸水溶液處理。將溶液冷卻至-20℃過(guò)夜，得到產(chǎn)物datp-d3。步驟d4：與實(shí)施例1的步驟a5類似地對(duì)425mg5’-oh核苷類似物進(jìn)行處理。將最終的混合物過(guò)濾并通過(guò)反相hplc進(jìn)行純化，給出三磷酸酯化合物，在所討論的情況下是datp-d4。步驟d5：將200μlph8.0的0.1mnahco3中的3.1μmol化合物datp-d4與200μl二甲基甲酰胺中的3.4μmol2,2-叔丁基-1-(2-硝基-4-生物素)苯基)己基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯混合。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行過(guò)夜，給出datp-d5(olejnik等，pnas,1995,vol92,7590-7594)。步驟d6：將3.75mmol混合物datp-d5溶解在20mlthf中，并用1mtbaf(四正丁基氟化銨)的thf溶液處理。反應(yīng)在攪拌約2h后完成。將混合物用ch2cl2萃取并通過(guò)層析進(jìn)行純化，給出datp-nitrob-biot。實(shí)施例5–化合物dctp-nitrob-biot的合成(圖9)步驟e1：向溶解在吡啶中的5g2’-脫氧胞苷添加2.2mlet3n和175mgdmap，然后添加5.25gdmtcl，在室溫下過(guò)夜。然后向混合物添加2.4mlet3n和1.27mlmscl。在室溫下溫育2h后，將混合物過(guò)濾并用乙酸乙酯洗滌。將濾液濃縮并溶解在75ml乙醇中，向其添加1mnaoh。在回流1.5h后，將混合物冷卻至室溫并添加1mhcl。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)掉乙醇并將殘留物用ch2cl2萃取。在硅膠柱純化后，獲得產(chǎn)物dctp-e1。步驟e2：向1.845mmoldctp-e1和326mg咪唑在無(wú)水dmf中的攪拌的溶液添加2.4mmol叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物。將反應(yīng)在室溫下攪拌溫育20h。通過(guò)施加真空除去溶劑并將殘留物通過(guò)層析進(jìn)行純化，給出產(chǎn)物dctp-e2。步驟e3：將化合物dctp-e2溶解在無(wú)水乙醇中并冷卻至0℃。逐滴添加2,2-叔丁基-1-(2-硝基-4-生物素)苯基)丙基苯基碳酸酯在無(wú)水乙醇中的等摩爾溶液。將混合物在室溫下攪拌過(guò)夜。將所述溶液過(guò)量，用水洗滌并用ch2cl2萃取，給出dctp-e3。步驟e4：將化合物dctp-e3重懸浮在甲醇中并用濃鹽酸水溶液處理。將溶液冷卻至-20℃過(guò)夜，得到產(chǎn)物dctp-e4。步驟e5：與實(shí)施例1的步驟a5類似地對(duì)425mg5’-oh核苷類似物進(jìn)行處理。將最終的混合物過(guò)濾并通過(guò)反相hplc進(jìn)行純化，給出三磷酸酯化合物，在所討論的情況下是dctp-e5。步驟e6：將3.75mmol混合物dctp-e5溶解在20mlthf中，并用1mtbaf(四正丁基氟化銨)的thf溶液處理。反應(yīng)在攪拌約2h后完成。將混合物用ch2cl2萃取并通過(guò)層析進(jìn)行純化，給出dctp-nitrob-biot。實(shí)施例6–化合物fa-cat-dntp的合成(圖16)步驟f1：將100μl1m修飾物鄰苯二酚酯的dmf溶液與110μldmf中的1m二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)和5μl100％4-(二甲基氨基)吡啶混合。將混合物在0℃下溫育5min。然后向混合物添加500μl50mm脫氧核糖核苷酸5’-三磷酸酯的dmf溶液。產(chǎn)物在室溫下在3h內(nèi)形成。然后將它用丙酮沉淀并溶解在水中，以便最終通過(guò)層析進(jìn)行純化，給出產(chǎn)物fa-cat-dntp。去保護(hù)在向核酸鏈添加核苷酸后，下面的實(shí)施例7至11說(shuō)明了對(duì)所述分子進(jìn)行去保護(hù)、也就是說(shuō)除去所述修飾物基團(tuán)的實(shí)施方式。實(shí)施例7–聚合的核苷酸nh2-dt-nitrob-biot的去保護(hù)(圖10)在下述過(guò)程期間同時(shí)進(jìn)行各種不同修飾物基團(tuán)的切割：將20mm化合物nh2-dt-nitrob-biot的水性溶液用包含350至700mmnano2和1mnaoac的ph5.5的溶液進(jìn)行處理。在室溫下暴露于波長(zhǎng)為365nm的uv光溫育1至2min后，通過(guò)添加1mph7.0的磷酸鹽緩沖液并停止照射來(lái)終止反應(yīng)。所述去保護(hù)反應(yīng)的產(chǎn)物是dt。實(shí)施例8–聚合的核苷酸nh2-dg-nitron-biot的去保護(hù)(圖11)在下述過(guò)程期間同時(shí)進(jìn)行各種不同修飾物基團(tuán)的切割：將20mm化合物nh2-dg-nitron-biot的水性溶液用包含350至700mmnano2和1mnaoac的ph5.5的溶液進(jìn)行處理。在室溫下暴露于波長(zhǎng)為365nm的uv光溫育1至2min后，通過(guò)添加1mph7.0的磷酸鹽緩沖液并停止照射來(lái)終止反應(yīng)。所述去保護(hù)反應(yīng)的產(chǎn)物是dg。實(shí)施例9–fa-biot-dn類型的聚合的核苷酸的去保護(hù)(圖12)由3’-oh末端攜帶的修飾物基團(tuán)的切割，通過(guò)用1至100mm的氨水溶液在室溫下對(duì)酯官能團(tuán)水解1h來(lái)進(jìn)行。得到的產(chǎn)物是dn類型的。實(shí)施例10–通過(guò)光切割進(jìn)行的聚合的核苷酸da-nitrob-biot的去保護(hù)(圖13)含氮堿基上攜帶的修飾物基團(tuán)的切割通過(guò)光切割來(lái)進(jìn)行。將化合物da-nitrob-biot在室溫下暴露于波長(zhǎng)為300至370nm的uv源。在30至300秒后停止uv源，給出產(chǎn)物da。實(shí)施例11–通過(guò)化學(xué)切割進(jìn)行的聚合的核苷酸dc-nitrob-biol的去保護(hù)(圖14)含氮堿基上攜帶的修飾物基團(tuán)的切割通過(guò)化學(xué)切割來(lái)進(jìn)行。將0.01mmol化合物dc-nitrob-biot溶解在0.1ml乙醇中。添加0.02mmol四氯鈀酸鈉ii溶解在乙醇中的溶液。將氫氣鼓泡通入混合物中并攪拌20min。得到的產(chǎn)物是dc。kobayashi等(science,2004,304,1305-1308)描述了類似的程序，其使用固定化的鈀，并且作為變化形式可以使用thf中的1ml/min的h2氣流。實(shí)施例12–將本發(fā)明的核苷酸用于核酸合成有利的是，作為本發(fā)明的主題的修飾的核苷酸可以按照在專利申請(qǐng)fr14-53455中描述的方法，用于在不存在模板鏈的情況下進(jìn)行核酸的酶法合成。被選擇用于執(zhí)行添加修飾核苷酸的步驟的酶是可商購(gòu)的末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶或tdt。用于引發(fā)所述合成的引物如下給出：5'-agccaagcggtcgcgatgat-3'seqn°1所使用的修飾的核苷酸是按照實(shí)施例1制備的nh2-dttp-nitrob-biot。它們可以向呈現(xiàn)的1號(hào)序列添加t。正如下面描述的，預(yù)期在每個(gè)延伸步驟期間僅向每個(gè)dna片段添加一個(gè)核苷酸。使用帶有具有下述序列的“捕獲”片段的玻璃板來(lái)捕獲序列1的引物：5′-gtccgcttggct-3′seqn°2，所述“捕獲”片段通過(guò)其3’末端附連到該玻璃板。該玻璃板構(gòu)成了體積為50μl的平行六面體反應(yīng)室的底面。捕獲使用添加有2pmol引物的緩沖溶液來(lái)進(jìn)行，所述緩沖溶液包含：20mmtris-hcl(ph＝7.5)，500mmlicl和1mmedta。所述捕獲步驟在室溫下在30min的過(guò)程內(nèi)進(jìn)行。在引物被捕獲后，通過(guò)三次添加和去除50μl下述緩沖溶液對(duì)板進(jìn)行清洗：20mmtris-hcl(ph＝7.5)，200mmlicl和1mmedta。合成始于向反應(yīng)室添加下述試劑：50utdt，1m二甲胂酸鉀，125mmtris-hcl，0.05％(v/v)tritonx-100，5mmcocl2，ph7.2。接下來(lái)添加100μmnh2-dttp-nitrob-biot核苷酸，它們是游離的并且在溶液中含有它們的平衡離子。最后加入2μm酶以便開(kāi)始添加反應(yīng)?？偡磻?yīng)體積為50μl。將混合物在37℃下溫育5min。在合成反應(yīng)完成后，將板用下述緩沖溶液清洗3次：20mmtris-hcl(ph＝7.5)，200mmlicl和1mmedta。這具有確保除去過(guò)量引入的nh2-dttp-nitrob-biot核苷酸，保持反應(yīng)室和固相支持物不含任何未反應(yīng)的核苷酸的效果。在所述清洗結(jié)束時(shí)，向反應(yīng)室添加50μl20mmtris-hcl緩沖液(ph＝7.5)并將溫度提高到90℃。這具有確保脫下?lián)接行揎椀暮塑账醤h2-dttp-nitrob-biot的片段的效果。將這些片段收集并轉(zhuǎn)移到新的eppendorf管中。然后按照下述程序純化摻有受保護(hù)的核苷酸nh2-dttp-nitrob-biot的dna片段。向50μl上面的反應(yīng)混合物添加按照制造商的流程制備的包被有鏈親和素的商品化磁珠(thermoscientific)。在室溫下溫育1h后，利用適合的磁鐵收集所述磁珠。然后除去上清液。然后將珠子用清洗緩沖液清洗3次：tris緩沖液，ph7.2，含有0.1％tween-20。將附連有已摻入修飾的核苷酸nh2-dttp-nitrob-biot的dna片段的磁珠重懸浮在包含350至700mm的nano2和1mnaoac的ph5.5的溶液中。將所述混合物在室溫下，在暴露于uv(365nm)下溫育1至2min。通過(guò)添加1mph7.0的磷酸鹽緩沖液并停止照射來(lái)終止反應(yīng)。這一操作能夠?qū)na片段從它們的支持物(珠子)上脫離。利用適合的磁鐵收集所述磁珠?；厥丈锨逡翰⑼ㄟ^(guò)電泳凝膠和maldi-tofms譜儀進(jìn)行分析，以便驗(yàn)證在超過(guò)99％的情況下t堿基正確摻入到1號(hào)序列的3’末端處。隨后如有必要，按照相同的流程進(jìn)行新的延伸步驟。實(shí)施例13–將本發(fā)明的核苷酸用于核酸合成的其他實(shí)例有利的是，作為本發(fā)明的主題的修飾的核苷酸可以按照在專利申請(qǐng)fr14-53455中描述的方法，用于在不存在模板鏈的情況下進(jìn)行核酸的酶法合成。被選擇用于執(zhí)行添加修飾核苷酸的步驟的酶是可商購(gòu)的末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶或tdt。用于引發(fā)所述合成的引物如下給出：5′-agccaagcggtcgcgatgat-3′seqn°1所使用的修飾的核苷酸是按照實(shí)施例2制備的nh2-dgtp-nitrob-biot。它們可以向呈現(xiàn)的1號(hào)序列添加g。正如下面描述的，預(yù)期在每個(gè)延伸步驟期間僅向每個(gè)dna片段添加一個(gè)核苷酸。使用帶有具有下述序列的捕獲片段的玻璃板來(lái)捕獲序列1的引物：5′-gtccgcttggct-3′seqn°2，所述捕獲片段通過(guò)其3’末端附連到該玻璃板。該玻璃板構(gòu)成了體積為50μl的平行六面體反應(yīng)室的底面。捕獲使用添加有2pmol引物的緩沖溶液來(lái)進(jìn)行，所述緩沖溶液包含：20mmtris-hcl(ph＝7.5)，500mmlicl和1mmedta。所述捕獲步驟在室溫下在30min的過(guò)程內(nèi)進(jìn)行。在引物被捕獲后，通過(guò)三次添加和去除50μl下述緩沖溶液對(duì)板進(jìn)行清洗：20mmtris-hcl(ph＝7.5)，200mmlicl和1mmedta。合成始于向反應(yīng)室添加下述試劑：50utdt，1m二甲胂酸鉀，125mmtris-hcl，0.05％(v/v)tritonx-100，5mmcocl2，ph7.2。接下來(lái)添加100μm核苷酸nh2-dgtp-nitrob-biot，它們是游離的并且在溶液中含有它們的平衡離子。最后加入2μm酶以便開(kāi)始添加反應(yīng)?？偡磻?yīng)體積為50μl。將混合物在37℃下溫育5min。在合成反應(yīng)完成后，將板用下述緩沖溶液清洗3次：20mmtris-hcl(ph＝7.5)，200mmlicl和1mmedta。這具有確保除去過(guò)量引入的nh2-dgtp-nitrob-biot核苷酸，保持反應(yīng)室和固相支持物不含任何未反應(yīng)的核苷酸的效果。在所述清洗結(jié)束時(shí)，向反應(yīng)室添加50μl20mmtris-hcl緩沖液(ph＝7.5)并將溫度提高到90℃。這具有確保脫下?lián)接行揎椀暮塑账醤h2-dgtp-nitrob-biot的片段的效果。將這些片段收集并轉(zhuǎn)移到新的eppendorf管中。然后按照下述程序純化摻有受保護(hù)的核苷酸nh2-dgtp-nitrob-biot的dna片段。向50μl上面的反應(yīng)混合物添加按照制造商的流程制備的包被有鏈親和素的商品化磁珠(thermoscientific)。在室溫下溫育1h后，利用適合的磁鐵收集所述磁珠。然后除去上清液。然后將珠子用清洗緩沖液清洗3次：tris緩沖液，ph7.2，含有0.1％tween-20。將附連有已摻入修飾的核苷酸nh2-dgtp-nitrob-biot的dna片段的磁珠重懸浮在包含350至700mm的nano2和1mnaoac的ph5.5的溶液中。將所述混合物在室溫下，暴露于uv(365nm)溫育1至2min。通過(guò)添加1mph7.0的磷酸鹽緩沖液并停止照射來(lái)終止反應(yīng)。這一操作允許dna片段從它們的支持物(珠子)上“脫離”。利用適合的磁鐵收集所述磁珠。回收上清液并通過(guò)電泳凝膠和maldi-tofms譜儀進(jìn)行分析，以便驗(yàn)證在超過(guò)99％的情況下t堿基正確摻入到1號(hào)序列的3’末端處。如有必要，隨后按照相同的流程進(jìn)行新的延伸步驟。工業(yè)應(yīng)用作為本發(fā)明的主題的修飾的核苷酸，通過(guò)特別是允許非常長(zhǎng)的核酸的非常高品質(zhì)的合成，提高了核酸合成方法的性能水平。這些核苷酸能夠用于以或多或少較大的規(guī)模生產(chǎn)合成的核酸序列或基因。這些修飾的核苷酸特別打算用于在生物
技術(shù)領(lǐng)域：
或更普遍來(lái)說(shuō)廣泛的生物學(xué)領(lǐng)域中用于研究、開(kāi)發(fā)或工業(yè)化目的的核酸例如dna或rna的合成。序列表<110>dna斯克瑞普特公司<120>修飾的核苷酸<130>pn000534<140>pct/fr2015/052310<141>2015-09-01<150>fr1458194<151>2014-09-02<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>nucleicacid<400>1agccaagcggtcgcgatgat20<210>2<211>12<212>dna<213>nucleicacid<400>2gtccgcttggct12當(dāng)前第1頁(yè)12