專利名稱：葉酸免疫膠體金檢測試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用膠體金免疫層析技術(shù)檢測血液中葉酸水平的試紙條及其制備方法，屬 于醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域。賴^葉酸是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，生化特性相近的化合物統(tǒng)稱，是由喋啶、對氨基苯甲酸和1 個或多個谷氨酸結(jié)合而成。葉酸為機體細(xì)胞生長和繁殖所必須的物質(zhì)，能夠幫助蛋白質(zhì)代謝， 與維生素B12共同促進(jìn)紅細(xì)胞的生成和成熟，同時還是制造紅血球不可缺少的物質(zhì)。在體內(nèi) 葉酸以四氫葉酸的形式起作用，四氨葉酸在體內(nèi)參與嘌呤核酸和嘧啶核苷酸的合成和轉(zhuǎn)化； 在制造核酸(核糖核酸、脫氣核糖核酸)上扮演重要的角色；是人體在利用糖分和氨基酸吋 的必要物質(zhì)。葉酸對于孕婦尤其重要，能夠滿足新生兒的營養(yǎng)需求，減少新生兒的神經(jīng)管畸 形的發(fā)生，并促進(jìn)乳汁分泌。此外，人們還發(fā)現(xiàn)葉酸可引發(fā)癌細(xì)胞凋亡，同時通過影響癌細(xì) 胞的基因表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤作用。對嬰幼兒神經(jīng)細(xì)胞與腦細(xì)胞發(fā)育有促進(jìn)作用，還可作為精神 分裂癥病人的輔助治療，以及用于治療慢性萎縮性胃炎、抑制支氣管鱗狀轉(zhuǎn)化以及防治因高 同型半胱氨酸血癥引起的冠狀動脈硬化癥、心肌損傷與心肌梗塞等。攝取不足、吸收障礙、 需求量增加、利用障礙，如妊娠期、巨幼細(xì)胞貧血、肝硬化、各類急慢性白血病、慢性溶血 等原因均可引起血清葉酸減少。血清葉酸缺乏會導(dǎo)致巨幼紅細(xì)胞貧血；婦女孕前或妊娠早期 缺乏葉酸是神經(jīng)管畸形發(fā)生的重要病因之一；同時，葉酸與同型半胱氨酸代謝關(guān)系密切，葉 酸缺乏可使同型半胱氨酸向蛋氨酸轉(zhuǎn)化出現(xiàn)障礙，進(jìn)而導(dǎo)致同型半胱氨酸血癥，從而導(dǎo)致心 血管發(fā)病風(fēng)險，故檢測葉酸水平對預(yù)防心血管疾病的發(fā)生亦具有重要意義。葉酸檢測目前主要采用的技術(shù)方法有高效液相(HPLC)方法、熒光偏振免疫檢測(FPLA) 方法、酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA)、和化學(xué)發(fā)光法等。高效液相(HPLC)方法操作比較復(fù)雜， 試驗耗時比較長，且試驗數(shù)據(jù)變異比較大。熒光偏振免疫檢測(FPLA)方法檢測費時，須配 備專用全自動熒光分析儀器，設(shè)備昂貴，不宜普及。酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA)大部分操作為 手工操作，比較耗時，定量檢測需配備儀器，必須有專門的實驗室。化學(xué)發(fā)光法，檢測時間 在2h以上，且價格昂貴。以上方法均不適于在基層檢驗場所應(yīng)用。免疫膠體金層析技術(shù)操作 簡單、快速、敏感和特異性好，用于葉酸的快速檢測，有益于葉酸基層醫(yī)療機構(gòu)檢測的普及， 此項技術(shù)雖然是一種較為成熟的技術(shù)，但對不同的抗原抗體系統(tǒng)的應(yīng)用有差異，包括原料來 源，試劑配制，生產(chǎn)工藝等都不同，需進(jìn)行新的設(shè)計和試驗。目前國內(nèi)外均未查到有用于檢 測葉酸的免疫膠體金層析快速診斷試紙條，包括文獻(xiàn)報道和發(fā)明專利。發(fā)明內(nèi)容為克服現(xiàn)有葉酸檢測技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種檢測葉酸的試紙條。本發(fā)明根據(jù)膠體 金免疫層析技術(shù)特點和葉酸抗原抗體系統(tǒng)特點，設(shè)計新的原材料，試劑和工藝流程，應(yīng)用本 發(fā)明提供的試紙條檢測葉酸水平，具有簡單，快速，靈敏和特異性好等特點，15分鐘以內(nèi)出 結(jié)果，并且價格低，適用于基層檢測和臨床初篩。本發(fā)明所述試紙條是由底板上依次接合吸水墊、特定包被的硝酸纖維膜、涂覆膠體金標(biāo) 記特異抗體的玻璃纖維膠體金結(jié)合墊、樣品墊而組成的條形物；所述玻璃纖維膠體金結(jié)合墊 涂覆膠體金標(biāo)記特異抗體為葉酸單克隆抗體。檢測樣品經(jīng)過樣品墊和結(jié)合墊再經(jīng)層析作用在 NC膜上出現(xiàn)捕獲線和質(zhì)控線，用肉眼判斷結(jié)果。在NC膜上僅僅出現(xiàn)一條質(zhì)控線，結(jié)果為陽 性，在NC膜上同時出現(xiàn)捕獲線和質(zhì)控線，結(jié)果為陰性，不出現(xiàn)線條表示試紙條或測試卡失 效。15分鐘內(nèi)出結(jié)果。本發(fā)明所述試紙條吸水墊為一種濾紙，包括吸水紙和濾油紙，切成要求大小直接使用。 貼在底板的末端，起吸水作用。本發(fā)明所述試紙條上特定包被的NC膜是一種專門用于膠體金試紙條的材料，由一層濾 膜和膠膜組成，成巻筒裝，NC膜上噴2條線，分別為捕獲線和質(zhì)控線，捕獲線噴涂的是葉酸 -牛血清白蛋白抗原，質(zhì)控線噴涂的是兔抗小鼠二抗；NC膜貼在底板的中間，兩端分別與結(jié) 合墊和吸水墊連接。本發(fā)明所述試紙條上結(jié)合墊為玻璃纖維紙，用含聚乙烯薛的硼酸緩沖液浸泡處理后，37 'C干燥過夜，噴涂上膠體金標(biāo)記的葉酸單克隆抗體，再冷凍千燥，葉酸單克隆抗體是針對葉 酸抗原表位，結(jié)合墊上與樣品墊銜接，下與NC膜銜接。本發(fā)明所述試紙條樣品墊為玻璃纖維紙，用含聚乙烯醇的硼酸緩沖液浸泡處理，緩沖液 ra為7.2，浸泡處理后，37r干燥過夜，在試劑條中起過濾樣品的作用，位于結(jié)合墊上，貼 在底板上。本發(fā)明還提供上述試紙條在制備HCY診斷試紙條中的應(yīng)用，診斷試紙條還包括標(biāo)識條， 此標(biāo)識條為兩個帶有標(biāo)識的不干膠紙，分別粘貼在試紙條的兩端，帶有箭頭端是貼在樣品墊 和結(jié)合墊上，由此端浸入待測樣品，靠另一端的吸水墊的吸水作用，使樣品經(jīng)過NC膜。本發(fā)明還提供上述試紙條在制備HCY測試卡中的應(yīng)用，測試卡還包括塑料卡，此塑料 卡是一個用塑料特制的卡，由上下2片組成，上下片可嵌合在一起，下片主要有一個放試紙 條的槽和與上片結(jié)合的卡齒，上片主要包括一個檢測孔、 一個樣品孔以及與下片結(jié)合的卡齒， 檢測孔旁邊分別印有T和C字樣，T表示捕獲線的位置，C表示質(zhì)控線的位量，檢測孔是觀 察結(jié)果的窗口，樣品孔是滴加樣品的位置。此塑料卡起保護(hù)試紙條的作用，并且更美觀，減少污染和保護(hù)操作者的安全。本發(fā)明所述試紙條的制備方法，包括如下步驟1) 葉酸-BSA抗原制備將BSA、葉酸和偶聯(lián)劑于反應(yīng)液中室溫避光反應(yīng)，凝膠展析分離偶聯(lián)物，透析，濃縮，制成免疫抗原和包被抗原。2) 膠體金的制備a量取一定量的洗液于潔凈的燒瓶中，煮沸5分鐘，再^^一次酸洗液，煮沸5分鐘； b量取一定量的超純水于該燒瓶中，煮沸5分鐘，再換一次超純水，煮沸5分鐘； c棄去超純水，稱取適量三蒸水于該燒瓶中，加熱至沸騰，加入適量1%氯金酸，加熱 至沸騰；d攪拌下加入6-10毫升2%檸檬酸三鈉，沸騰5-IO分鐘。3) 膠體金探針標(biāo)記將葉酸單克隆抗體用0.005mol/LNaCl透析過夜，離心除去蛋白沉 淀。取膠體金100毫升，調(diào)節(jié)膠體金溶液PH值9.0，攪拌加入1毫升稀釋的葉酸單克隆抗體， 再緩慢加入1毫升lCmBSA充分混勻，攪拌15分鐘，4°C 13000g/min離心40分鐘；棄上清， 加入工作液100毫升溶解；在容器上貼上標(biāo)簽，注上批號、批量及有效期；儲存條件4'C保 存。4) 制備檢測葉酸的膠體金免疫試紙條先將玻璃纖維膜放入質(zhì)量百分比濃度為1%的牛血清白蛋白、質(zhì)量百分比濃度為1%的TX-100的磷酸鹽緩沖液中封閉30min, 37'C烘干。再將玻璃纖維膜浸泡于標(biāo)記葉酸單克隆抗 體的膠體金探針中，真空干燥。將制備好的試劑條板上NC膜用噴膜機分別噴上捕獲抗原(葉 酸-BSA偶聯(lián)抗原)和質(zhì)控抗體(兔抗Balb/c球蛋白抗體)。噴完后37'C干燥過夜。將吸水墊、 已包被的硝酸纖維膜(NC膜)、玻璃纖維膠體金結(jié)合墊、樣品墊、標(biāo)識條依次粘于底板上， 裁成細(xì)條，即成一種檢測葉酸的膠體金免疫試紙條。上述膠體金制備過程中，優(yōu)選三蒸水200毫升，氯金酸10毫升，檸檬酸三鈉7.5毫升。 上述膠體金探針標(biāo)記過程中，優(yōu)選加入10%BSA后，再加入1毫升10%PEG20000充分 混勻，離心棄上清，加入工作液溶解。本發(fā)明的有益效果應(yīng)用本發(fā)明提供的試紙條檢測人體內(nèi)葉酸水平，成本低廉，操作簡 單、快速、靈敏，且特異性好，不需要特殊檢測儀器設(shè)備，因此可廣泛應(yīng)用干各級醫(yī)療檢驗 場所，尤其基層醫(yī)療機構(gòu)，包括鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院等均可開展。本發(fā)明有益于葉酸缺乏的篩查的普 及，進(jìn)而對于心腦血管事件發(fā)生，新生兒神經(jīng)管畸形等疾病的預(yù)防有極為重要的意義。6隨綱

圖1為本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖1:底板；2:吸水墊；3:特定包被的硝酸纖維膜；4:捕獲線；5:質(zhì)控線；6:結(jié)合墊；7: 樣品墊。圖2為本發(fā)明的檢測結(jié)果示意圖a:陰性；b:陽性；C:無效；4:捕獲線；5:質(zhì)控線 圖3為本發(fā)明的試紙條外觀示意圖a:樣本墊；b:結(jié)合墊；C:捕獲線；d:質(zhì)控線；e:試紙條名稱圖4為本發(fā)明的測試卡外觀示意圖a:樣本孔；b:測試孔；T:捕獲線；C:質(zhì)控線。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所作出的本 領(lǐng)域等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范周。 實施例l:葉酸膠體金免疫試紙條制備方法，它包括如下步驟1、 葉酸-BSA抗原制備取適量BSA和葉酸分別溶于12.5mlPBS錐形瓶中，各自磁力攪拌器攪拌10分鐘，將葉 酸溶液加入BSA溶液中，邊加邊攪拌，再加入25%戊二醛，避光反應(yīng)5小時，凝膠層析分離 偶聯(lián)物，于PBS內(nèi)透析24h，濃縮。2、 膠體金的制備量取一定量的洗液于潔凈的250ml三角燒瓶中，煮沸5分鐘，再換一次酸洗液，煮沸5 分鐘；量取一定量的超純水于該燒瓶中，煮沸5分鐘，再換一次超純水，煮沸5分鐘；棄去 超純水，稱取200ml超純水于該燒瓶中，加熱至沸騰，加入P/。氯金酸10ml，邊煮邊攪拌， 加熱至沸騰；攪拌下加入2%檸檬酸三鈉10ml，沸水下快速攏拌，直到氯金酸溶液的顏色慢 慢穩(wěn)定，呈紅色后，繼續(xù)沸騰7分鐘，制成小顆粒膠體金。3、 膠體金探針標(biāo)記將葉酸單克隆抗體用0.005mol/L NaCl透析過夜，離心除去蛋白沉淀。取膠體金100毫 升，調(diào)節(jié)膠體金溶液PH值9.0，攪拌加入1毫升稀釋的SAH單克隆抗體，再加入1毫升10%BSA 充分混勻，緩饅加入，攪拌15分鐘，離心，條件4'C 13000g/min， 40分鐘；棄上清，加入 工作液100毫升溶解；儲存條件4'C保存。4、 制備檢測葉酸的膠體金免疫試紙先將玻璃纖維膜放入質(zhì)量百分比濃度為1%的牛血清白蛋白、質(zhì)量百分比濃度為1%的TX-100的磷黢鹽緩沖液中封閉30min， 37'C烘干，再將玻璃纖維膜浸泡于標(biāo)記葉酸單克隆抗體的膠體金探針中，真空干燥，將制備好的試劑條板上NC膜用噴膜機分別噴上捕獲抗原(葉酸-BSA偶聯(lián)抗原)和質(zhì)控抗體(兔抗Balb/c球蛋白抗體)。噴完后37'C干燥過夜。將吸水墊、已包被的硝酸纖維膜、玻璃纖維膠體金結(jié)合墊、樣品墊依次粘于底板上，裁成細(xì)條，即成一種檢測葉酸的膠體金免疫試紙條。 實施例2:葉酸膠體金免疫試紙條制備方法，它包括如下步驟葉酸-BSA抗原為實施例1制備。1、 膠體金的制備量取一定量的洗液于潔凈的250ml三角燒瓶中，煮沸5分鐘，再換一次酸洗液，煮沸5 分鐘；量取一定量的超純水于該燒瓶中，煮沸5分鐘，再換一次超純水，煮沸5分鐘；棄去 超純水，稱取200ml超純水于該燒瓶中，加熱至沸騰，加入P/。氯金酸10ml，邊煮邊攪拌， 加熱至沸騰；攪拌下加入2o/。檸樣酸三鈉7.5ml，沸水下快速攪拌，直到氯金酸溶液的顏色慢 慢穩(wěn)定，呈紅色后，繼續(xù)沸騰9分鐘，制成中等大小的膠體金顆粒。2、 膠體金探針標(biāo)記將葉酸單克隆抗體用0.005mol/L NaCl透析過夜，離心除去蛋白沉淀。取膠體金100毫 升，調(diào)節(jié)膠體金溶液PH值9.0,攪拌加入1毫升稀釋的葉酸單克隆抗體，再加入1毫升10%BSA 充分混勻，再加入1毫升1(^PEG20000充分混勻，緩慢加入，攪拌15分鐘，離心，條件4'C 13000g/min， 40分鐘；棄上清，加入工作液100毫升溶解；在容器上貼上標(biāo)簽，注上批號、 批量及有效期；儲存條件4'C保存。3、 制備檢測葉酸的膠體金免疫試紙條先將玻璃纖維膜放入質(zhì)量百分比濃度為1%的牛血清白蛋白、質(zhì)量百分比濃度為0.5%的TX-100的磷酸鹽緩沖液中封閉30rmn， 37'C烘干，再將玻璃纖維膜浸泡于標(biāo)記葉酸單克隆抗體的膠體金探針中，真空干燥，將制備好的試劑條板上NC膜用噴膜機分別噴上捕獲抗原(葉酸-BSA偶聯(lián)抗原)和質(zhì)控抗體(兔抗Balb/c球蛋白抗體)。噴完后37t:干燥過夜。將吸水墊、已包被的硝酸纖維膜、玻璃纖維膠體金結(jié)合墊、樣品墊依次粘于底板上，裁成細(xì)條，即成一種檢測葉酸的膠體金免疫試紙條。 實施例3:葉酸膠體金免疫試紙條制備方法，它包括如下步驟 葉酸-BSA抗原為實施例l制備。1、 膠體金的制備量取一定量的洗液于潔凈的250ml三角燒瓶中，煮沸5分鐘，再換一次酸洗液，煮沸5 分鐘；量取一定量的超純水子該燒瓶中，煮沸5分鐘，再換一次超純水，煮沸5分鐘；棄去 超純水，稱取200ml超純水于該燒瓶中，加熱至沸騰，加入l。/o氯金酸10ml，邊煮邊攪拌， 加熱至沸騰；攪拌下加入2%檸樣酸三鈉6.6ml,沸水下快速攪拌，直到氯金酸溶液的顏色慢 慢穩(wěn)定，呈紅色后，繼續(xù)沸騰9分鐘，制成較大的膠體金顆粒。2、 膠體金探針標(biāo)記將葉酸單克隆抗體用0.005mol/L NaCl透析過夜，離心除去蛋白沉淀。取膠體金100毫 升，調(diào)節(jié)膠體金溶液PH值9.0，攪拌加入1毫升稀釋的葉酸單克隆抗體，再加入1毫升10%BSA 充分混勻，再加入1毫升10%Casein充分混勻，緩慢加入，攪拌15分鐘，離心，條件4'C 13000g/min， 40分鐘；棄上清，加入工作液100毫升溶解；在容器上貼上標(biāo)簽，注上批號、 批量及有效期；儲存條件4'C保存。3、 制備檢測葉酸的膠體金免疫試紙條-先將玻瓖纖維膜放入質(zhì)量百分比濃度為1%的牛血清白蛋白、質(zhì)量百分比濃度為0.5%的 TX-100的磷酸鹽緩沖液中封閉30min， 37。C烘干，再將玻璃纖維膜浸泡于標(biāo)記SAH單克隆 抗體的膠體金探針中，真空干燥，將制備好的試劑條板上NC膜用噴膜機分別噴上捕獲抗原 (葉酸-BSA偶聯(lián)抗原)和質(zhì)控抗體(兔抗Balb/c球蛋白抗體)。噴完后37'C干燥過夜。將吸 水墊、已包被的硝酸纖維膜、玻璃纖維膠體金結(jié)合墊、樣品墊依次粘于底板上，裁成細(xì)條， 即成一種檢測葉酸的膠體金免疫試紙條。實施例4:葉酸的膠體金免疫診斷試紙條制備方法，它包括如下歩驟將兩個帶有標(biāo)識的不干膠紙(標(biāo)識條)分別粘貼在實施例2中所制備試紙條的兩端，帶 有箭頭端是貼在樣品墊和結(jié)合墊上，由此端浸入待測樣品，靠另一端的吸水墊的吸水作用， 使樣品經(jīng)過NC膜。即成一種檢測葉酸的膠體金免疫診斷試紙條，見圖3。實施例5:葉酸的膠體金免疫診斷測試卡制備方法，它包括如下步驟將實施例2中所制備試紙條放入塑料卡下片試紙條槽中，與上片嵌合，即成一種檢測葉 酸的膠體金免疫診斷測試卡，見圖4。此塑料卡是一個用塑料特制的卡，由上下2片組成，上下片可嵌合在一起，下片主要有一個放試紙條的槽和與上片結(jié)合的卡齒，上片主要包括一個檢測孔(見圖4b)、 一個樣品孔(見圖4a)以及與下片結(jié)含的卡齒，檢測孔旁邊分別印有 T和C字樣，T表示捕獲線的位置，C表示質(zhì)控線的位置，檢測孔是觀察結(jié)果的窗口，樣品孔是滴加樣品的位置。 實施例6:葉酸免疫膠體金診斷層析試紙條使用方法如圖l, 2所示，將試紙條樣品墊7插入待測液中，浸潤后取出，水平放童，約10 15分鐘后，在NC膜3上僅僅出現(xiàn)一條質(zhì)控線5，見圖2b，結(jié)果為陽性，在NC膜3上同時出現(xiàn)捕獲線4和質(zhì)控線5，見圖2a，結(jié)果為陰性，不出現(xiàn)線條見圖2c表示試紙條失效。試紙條檢測靈敏度為lng/ml。 實施例7:葉酸免疫膠體金診斷層析測試卡使用方法如圖4所示，將樣本加入樣本孔a，加樣量 75微升 80微升，水平放置，約10 15分鐘后，僅在測試孔b的質(zhì)控線C處出現(xiàn)一條線， 結(jié)果為陽性，在測試孔b的捕獲線T和質(zhì)控線C處分別出現(xiàn)一條線，結(jié)果為陰性，不出現(xiàn)線 條表示測試卡失效。測試卡檢測靈敏度為lng/ml。
權(quán)利要求
1. 一種檢測葉酸的免疫膠體金層析試紙條，其特征在于所述試紙條是由底板(1)上的依次接合吸水墊(2)、特定包被的硝酸纖維膜(NC膜)(3)、NC膜上有捕獲線(4)和質(zhì)控線(5)，涂覆膠體金標(biāo)記特異抗體的玻璃纖維膠體金結(jié)合墊(6)、樣品墊(7)而組成的條形物；所述玻璃纖維膠體金結(jié)合墊(6)涂覆膠體金標(biāo)記特異抗體為葉酸單克隆抗體。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述試紙條，其特征在于所述吸水墊(2)為一種濾紙，包括吸水紙和 濾油紙；吸水墊貼在底板的末端。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述試紙條，其特征在于所述特定包被的NC膜(3)由一層濾膜和膠 膜組成，NC膜上涂葉酸-牛血清白蛋白抗原和兔抗小鼠二抗；NC膜貼在底板的中間，兩 端分別與結(jié)合墊和吸水墊連接。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述試紙條，其特征在于所述結(jié)合墊(6)為玻璃纖維紙，用含聚乙烯 醇的硼酸緩沖液浸泡處理后，37'C干燥過夜，噴涂上膠體金標(biāo)記的葉酸單克隆抗體，再冷 凍干燥，葉酸單克隆抗體是針對葉酸抗原表位，結(jié)合墊上與樣品墊銜接，下與NC膜銜接。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述試紙條，其特征在于所述樣品墊(7)為玻璃纖維紙，用含聚乙烯 醇的硼酸緩沖液浸泡，緩沖液PH為7.2，浸泡處理后，37'C干燥過夜；樣品墊位于結(jié)合 墊上。
6、 一種權(quán)利要求l所述的試紙條在制備葉酸診斷試紙條中的應(yīng)用，其特征在于診斷試紙條 還包括標(biāo)識條，此標(biāo)識條為兩個帶有標(biāo)識的不干膠紙，分別粘 貼在試紙條的兩端，帶有箭 頭端是貼在樣品墊和結(jié)合墊上，由此端浸入待測樣品，靠另一端的吸水墊的吸水作用，使 樣品經(jīng)過NC膜。
7、 一種權(quán)利要求l所述的試紙條在制備葉酸測試卡中的應(yīng)用，其特征在于測試卡還包括塑 料卡，此塑料卡是一個用塑料特制的卡，由上下2片組成，上下片可嵌合在一起，下片主 要有一個放試紙條的槽和與上片結(jié)合的卡齒，上片主要包括一個檢測孔、 一個樣品孔以及 與下片結(jié)合的卡齒，檢測孔旁邊分別印有T和C字樣，T表示捕獲線的 位置，C表示質(zhì)控 線的位霣，檢測孔是觀察結(jié)果的窗口，樣品孔是滴加樣品的位置。
8、 一種檢測葉酸的免疫膠體金層析試紙條的制備方法，包括如下步驟- 1) 葉酸-BSA抗原制備- 將葉酸、BSA和偶聯(lián)劑于反應(yīng)液中室溫避光反應(yīng)，凝膠層析分離偶聯(lián)物，透析，濃縮， 制成免疫抗原和包被抗原； 2) 膠體金的制備a量取一定量的洗液于潔凈的燒瓶中，煮沸5分鐘，再換一次酸洗液，煮沸5分鐘； b量取一定量的超純水于該燒瓶中，煮沸5分鐘，再換一次超純水，煮沸5分鐘； c棄去超純水，稱取適量三蒸水于該燒瓶中，加熱至沸騰，加入適量1%氯金酸，加熱至 沸騰d攪拌下加入6 10毫升2%檸檬酸三鈉，沸騰5-IO分鐘；3) 膠體金探針標(biāo)記將葉酸單克隆抗體用NaCl透析過夜，離心除去蛋白沉淀；取膠體金 100毫升，調(diào)節(jié)膠體金溶液PH值9.0，攪拌加入1毫升稀釋的葉酸單克隆抗體，再緩慢加入1毫升10y。BSA充分混勻，攪拌，離心棄上清，加入工作液溶解； 4)制備檢測葉酸的膠體金免疫試紙條先將玻璃纖維膜放入質(zhì)量百分比濃度為1%的牛血清白蛋白、質(zhì)量百分比濃度為1%的TX-100的磷酸鹽緩沖液中封閉30min，37t:烘干， 再將玻璃纖維膜浸泡于標(biāo)記葉酸單克隆抗體的膠體金探針中，真空干燥，將制備好的 試劑條板上NC膜用噴膜機分別噴上捕獲抗原(葉酸-BSA偶聯(lián)抗原)和質(zhì)控抗體(兔 抗Balb/c球蛋白抗體)，噴完后37。C干燥過夜；將吸水墊、已包被的硝酸纖維膜、玻 璃纖維膠體金結(jié)合墊、樣品墊依次粘于底板上，裁成細(xì)條，即成一種檢測葉酸的膠體 金免疫試紙條。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述制備方法，其特征在于2)步中所述三蒸水為200毫升，所述氯金 酸為10蹇升，所述檸檬酸三鈉為7.5毫升。
10、 根據(jù)權(quán)利要求8所述制備方法，其特征在于3)步中所述加入10。/。BSA后，再加 入1毫升10%PEG20000充分混勻，離心棄上清，加入工作液溶解。
全文摘要
本發(fā)明提供一種葉酸免疫膠體金檢測試紙條及其制備方法。該試紙條是由底板(1)上的依次接合吸水墊(2)、特定包被的硝酸纖維膜(NC膜)(3)、NC膜上有捕獲線(4)和質(zhì)控線(5)，涂覆膠體金標(biāo)記特異抗體的玻璃纖維膠體金結(jié)合墊(6)、樣品墊(7)而組成的條形物；所述玻璃纖維膠體金結(jié)合墊(6)涂覆膠體金標(biāo)記特異抗體為葉酸單克隆抗體。應(yīng)用本發(fā)明所提供的試紙條檢測人血清中葉酸水平，具有操作簡單、快速、靈敏和特異性好等特點，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N33/577GK101246172SQ20071006389
公開日2008年8月20日 申請日期2007年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月14日
發(fā)明者多 于, 瑕 吳, 張彥明, 徐希平, 燕 王, 玉 王 申請人:北京華安佛醫(yī)藥研究中心有限公司;安徽省生物醫(yī)學(xué)研究所