檢測早期糖尿病腎病的膠體金試紙條的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種檢測早期糖尿病腎病的膠體金試紙條的制備方法，所述膠體金試紙條包括樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸水墊以及支撐墊，所述制備方法包含以下步驟：制備膠體金的步驟；制備膠體金抗體復合物的步驟；金標墊處理步驟；在硝酸纖維素膜上制備檢測線的步驟；在硝酸纖維素膜上制備控制線的步驟；樣品墊處理步驟；制備吸水墊的步驟；組裝膠體金試紙條的步驟。本發(fā)明通過上述步驟制備成的膠體金試紙條可以實現(xiàn)同時定量檢測早期糖尿病腎病的多種生物標志物，解決單一生物標志物篩查譜狹窄及預見性較差的問題，從而節(jié)省檢測早期糖尿病腎病的成本，提高檢測的準確性及效率。
【專利說明】
檢測早期糖尿病腎病的膠體金試紙條的制備方法
技術(shù)領域
[0001]本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學疾病檢測領域，尤其涉及一種檢測早期糖尿病腎病的膠體金試紙條的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]糖尿病腎病是糖尿病最嚴重的慢性微血管并發(fā)癥之一，并最終引起終末腎衰竭，是糖尿病患者死亡的主要原因。然而，糖尿病腎病早期很難發(fā)現(xiàn)，且臨床糖尿病腎病診斷黃金標準肌酐和蛋白尿也只能間接反映腎臟實質(zhì)性病變，在正常蛋白尿期間無法診斷早期糖尿病腎病。通常當臨床確診時，糖尿病腎病患者錯過了最佳的治療時機，致使疾病急劇惡化，不可逆轉(zhuǎn)。因此，針對糖尿病腎病早期損傷生物標志物早發(fā)現(xiàn)、早干預，具有重要的現(xiàn)實意義。
[0003]目前研究發(fā)現(xiàn)了許多早期糖尿病腎病相關的生物標志物，有些生物標志物可以在此階段釋放到尿液中，尿液中的蛋白種類及含量的高低直接反映了泌尿系統(tǒng)，尤其是腎臟的健康狀態(tài)，可以預測糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展及預后的情況。比如足糖萼蛋白(podocalyxin)，是足細胞損傷的早期生物標志物，并與疾病的發(fā)展正相關;IV型膠原蛋白(Collagen IV)，在維持細胞基底膜正確裝配方面具有重要的作用；腎病蛋白(Nephrin)，在裂空隔膜的裝配中發(fā)揮重要的作用；肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(L-FABP)，是腎小球間質(zhì)細胞損傷的生物標志物，可以預測糖尿病腎病的發(fā)生；中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)、胱抑素C(cystatinC)、神經(jīng)生長因子-1(Netrin-1)是腎小管近端損傷的生物標志物。對這些與疾病發(fā)生發(fā)展密切相關的生物標志物進行檢測，有助于了解糖尿病腎病發(fā)生和發(fā)展，有效提高對腎病并發(fā)癥的預測能力。
[0004]免疫膠體金技術(shù)(Immune colloidal gold technique)是以膠體金作為示蹤生物標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術(shù)，英文縮寫為GICT。膠體金是由氯金酸(HAuC14)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸橡酸鈉、縣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結(jié)合物的免疫和生物學特性，因而使膠體金廣泛地應用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。
[0005]目前檢測早期糖尿病腎病的檢測設備中常用的方法是采用酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA)，其技術(shù)缺點如下:檢測設備體積大、成本高;檢測時間長、重復性不好，不適合臨床的快速篩查。然而，目前尚無利用多種生物標志物同時進行定量檢測的設備，因此不能實現(xiàn)同時定量檢測早期糖尿病腎病的多種生物標志物，從而無法為早期糖尿病腎病臨床診斷提供依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的主要目的在于提供一種檢測早期糖尿病腎病的膠體金試紙條的制備方法，旨在解決目前檢測設備無法同時定量檢測早期糖尿病腎病多種生物標志物的問題。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種檢測早期糖尿病腎病的膠體金試紙條的制備方法，所述膠體金試紙條包括樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸水墊以及支撐墊，所述制備方法包含以下步驟:
[0008]制備膠體金的步驟:將0.01%的氯金酸與I %檸檬酸鈉混合，煮沸攪拌直到出現(xiàn)紅色得到膠體金，將該膠體金保存?zhèn)溆茫?br>[0009]制備膠體金抗體復合物的步驟:將與每種生物標志物對應的其中一種單克隆抗體分別與制備好的膠體金混合并通過梯度稀釋法確定最低濃度的單克隆抗體，在標記單克隆抗體時，取制備好的膠體金與最低濃度的單克隆抗體混合，攪拌后加入牛血清白蛋白(BSA)并經(jīng)純化獲得膠體金抗體復合物；
[0010]金標墊處理步驟:將金標墊在BSA中浸泡第一段時間后并干燥，將制備好的膠體金抗體復合物均勻鋪在金標墊上并恒溫干燥第二段時間；
[0011]在硝酸纖維素膜上制備檢測線的步驟:將選擇的每種與生物標志物對應的另一種配對單克隆抗體按照排列順序在硝酸纖維素膜上平行劃線制作成多條檢測線并恒溫干燥第二段時間；
[0012]在硝酸纖維素膜上制備控制線的步驟:將二抗在硝酸纖維素膜上的檢測線之后劃一根與檢測線平行的線制作成控制線并恒溫干燥第二段時間；
[0013]樣品墊處理步驟:將樣品墊在磷酸緩沖液(PBS)中浸泡第一段時間，恒溫干燥第二段時間制作成樣品墊備用；
[0014]制備吸水墊的步驟:選擇吸水墊并按照預定寬度進行裁剪；
[0015]組裝膠體金試紙條的步驟:將上述制備好的樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜以及吸水墊首尾相互重疊預設長度并依次粘貼在支撐墊上，經(jīng)裁剪得到膠體金試紙條。
[0016]優(yōu)選的，所述樣品墊和金標墊均采用玻璃纖維膜或聚酯膜材料制成，所述吸水墊采用吸水纖維或吸水海綿材料制成。
[0017]優(yōu)選的，所述通過梯度稀釋法確定最低濃度的單克隆抗體的步驟包括如下步驟:
[0018]選擇一種單克隆抗體，利用0.002mol/L、pH 9.0的I3BS將選擇的單克隆抗體稀釋到預設濃度梯度0.01?0.111^/1111 ；
[0019]將所述單克隆抗體稀釋液與膠體金按照1:5混合，并將PH調(diào)整為9.0，孵育10分鐘；
[0020]加入0.1ml的10%氯化鈉(NaCl)得到膠體金抗體復合物，然后檢測520nm下的吸光值，經(jīng)比較分析確定穩(wěn)定Iml膠體金的最低抗體量即為選擇的單克隆抗體的最低濃度；
[0021]確定其他單克隆抗體的最低濃度采用以上相同步驟；
[0022]通過比較每一種單克隆抗體的最低濃度來確定最低濃度的單克隆抗體。
[0023]優(yōu)選的，所述純化獲得膠體金抗體復合物的步驟包括如下步驟:
[0024]將膠體金與最低濃度的一種單克隆抗體混合液攪拌10分鐘，緩慢加入BSA使?jié)舛葹镮 %，繼續(xù)攪拌30分鐘，4°C靜置2?3小時，獲得免疫膠體金復合物；
[0025]將所述免疫膠體金復合物采用離心法純化，先2000rpm離心10分鐘后將上清轉(zhuǎn)移到離心管中，再12000rpm離心20分鐘后去掉上清；
[0026]用TBS緩沖液懸起紅色沉積物，再用TBS懸起紅色沉積物為原體積的1/10，即為純化的Iml膠體金抗體復合物。
[0027]優(yōu)選的，所述第一段時間為2?3小時，所述第二段時間為3?12小時，所述恒溫為25 °C ?30 °C。
[0028]優(yōu)選的，其特征在于，所述生物標志物包括足糖萼蛋白、IV型膠原蛋白、肝型脂肪酸結(jié)合蛋白和中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白。
[0029]優(yōu)選的，所述單克隆抗體包括足糖萼蛋白單克隆抗體、IV型膠原蛋白單克隆抗體、中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白單克隆抗體以及肝型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體。
[0030]優(yōu)選的，所述多條檢測線設置在所述硝酸纖維素膜的排列順序是沿著樣品墊上的樣品層析方向并按照生物標志物分子量從大到小平行等間隔排列。
[0031]優(yōu)選的，所述預設長度為1.5?2mm，所述二抗為羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。
[0032]相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明通過上述制備方法制備成的膠體金試紙條可以針對早期糖尿病腎病的多種早期生物標志物進行檢測，解決單一生物標志物篩查譜狹窄及預見性較差的問題，可以節(jié)省檢測成本，提高檢測準確性。此外，所述膠體金試紙條可以結(jié)合定量檢測儀一起使用實現(xiàn)多種生物標志物的同時定量檢測，為早期糖尿病腎病臨床診斷提供依據(jù)，提尚檢測效率。
【附圖說明】
[0033]圖1是本發(fā)明檢測早期糖尿病腎病的膠體金試紙條較佳實施例的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0034]圖2是本發(fā)明檢測早期糖尿病腎病的膠體金試紙條的制備方法較佳實施例的流程示意圖。
[0035]本發(fā)明目的的實現(xiàn)、功能特點及優(yōu)點將結(jié)合實施例，參照附圖做進一步說明。
【具體實施方式】
[0036]為更進一步闡述本發(fā)明為達成上述目的所采取的技術(shù)手段及功效，以下結(jié)合附圖及較佳實施例，對本發(fā)明的【具體實施方式】、結(jié)構(gòu)、特征及其功效進行詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0037]如圖1所示，圖1是本發(fā)明檢測早期糖尿病腎病的膠體金試紙條較佳實施例的結(jié)構(gòu)示意圖。在本實施例中，所述膠體金試紙條包括樣品墊1、金標墊2、硝酸纖維素膜3、吸水墊4以及支撐墊5。其中，所述樣品墊1、金標墊2、硝酸纖維素膜3、吸水墊4首尾相互重疊預設長度(例如1.5?2mm)并粘貼在所述支撐墊5上。所述金標墊2上包被多種生物標志物的單克隆抗體，所述硝酸纖維素膜3上設置有多條檢測線31(例如Tl?T4)和一條控制線32，每一條檢測線31包被有一種與所述金標墊2上所包被的單克隆抗體相配對的另一種單克隆抗體。所述控制線32包被二抗，例如羊抗鼠IgG或者兔抗鼠IgG。所述二抗是指能和金標墊2上標記的一種單克隆抗體結(jié)合，即抗抗體，其主要作用是檢測金標試紙條的有效性。本發(fā)明實施例中所使用的包被一詞意為非特異性吸附固定意思，本發(fā)明實施例中所使用的材料和試劑除特別說明外，均為普通市售。
[0038]在本實施例中，所述多種生物標志物包括，但不限于，足糖萼蛋白(podocalyxin)、IV型膠原蛋白(CollagenIV)、肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(L-FABP)和中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)。
[0039]每一條檢測線31包被有一種與所述金標墊2上所包被的抗體相配對的另一種單克隆抗體，所述多條檢測線設置在所述硝酸纖維素膜3的排列順序是沿著樣品墊上的樣品層析方向6并按照生物標志物分子量從大到小平行等間隔排列。例如，足糖萼蛋白(podocalyxin)、IV型膠原蛋白(Collagen IV)、肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(L-FABP)和中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)，按照分子量依次大約為55KDa、160KDa、14KDa、21KDa，因此，不同檢測線31包被的另一種抗單克隆抗體從左到右依次為抗IV型膠原蛋白(Collagen IV)單克隆抗體、抗足糖萼蛋白(podocalyxin)單克隆抗體、抗中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)單克隆抗體及抗肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(L-FABP)單克隆抗體。
[0040]在本實施例中，所述樣品墊I和金標墊2均采用玻璃纖維膜或聚酯膜材料制成，所述樣品墊I為待檢測的樣品(例如尿液)的加樣位置。所述金標墊2上標記有針對生物標志物的單克隆抗體。所述檢測線31包被的抗體和金標墊2包被的抗體為一種相互配對單克隆抗體。所述控制線32包被的抗體為一種能和金標墊2上標記的一種單克隆抗體結(jié)合的二抗，例如，羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。所述樣品墊1、金標墊2、硝酸纖維素膜3、吸水墊4首尾相互重疊預設長度(例如1.5?2mm)并粘貼在所述支撐墊5上。所述吸水墊4采用吸水能力強的吸水纖維或吸水海綿材料制成，能夠?qū)λ鰳悠穳|I上的樣品液體具有強吸引流作用，即樣品液體通過所述金標墊2將金標抗體-抗原復合物或者金標抗體復合物沿著樣品液體的層析方向6吸附至所述硝酸纖維素膜3上相應的檢測線位置或控制線位置。所述支撐墊5為一種硬質(zhì)塑料底板或PVC支撐底板。
[0041]如圖2所示，圖2是本發(fā)明檢測早期糖尿病腎病的膠體金試紙條的制備方法較佳實施例的流程示意圖。所述膠體金試紙條的制備方法包括步驟:
[0042]步驟S21，制備膠體金的步驟:將0.01%的氯金酸與I %檸檬酸鈉混合，煮沸攪拌直到出現(xiàn)紅色得到膠體金，將該膠體金保存?zhèn)溆茫?br>[0043]在本實施例中，采用檸檬酸三鈉還原法制備直徑為20?30nm的膠體金顆粒100ml。首先，配制0.01 %的氯金酸，例如取99ml三蒸水加入至500ml的錐形瓶中，加入I %氯金酸水溶液Iml，使氯金酸的濃度為0.01%；將配制好的0.01%的氯金酸加熱煮沸，然后加入1.0?
2.0ml的I %檸檬酸鈉，期間不停的攪拌，繼續(xù)煮沸直到出現(xiàn)紅色，再繼續(xù)煮沸10分鐘，定容至100ml，并將配制好的膠體金保存在4°C溫度下備用。
[0044]步驟S22，制備膠體金抗體復合物的步驟:將每一種單克隆抗體分別與制備好的膠體金混合并通過梯度稀釋法確定最低濃度的單克隆抗體，在標記抗體時，取制備好的膠體金與最低濃度的單克隆抗體混合，攪拌之后加入牛血清白蛋白(BSA)，繼續(xù)攪拌并經(jīng)純化獲得膠體金抗體復合物；
[0045]在本實施例中，選擇一種單克隆抗體，利用0.002mol/L、pH9.0的磷酸緩沖液(P B S)將選擇的與生物標志物對應的單克隆抗體稀釋到預設的濃度梯度(例如0.0I?
0.lmg/ml);將抗體稀釋液與膠體金按照1:5混合(例如將抗體稀釋液0.2ml加入到Iml的膠體金中)，PH調(diào)整為9.0，孵育10分鐘后，在加入0.1ml的10%氯化鈉(NaCl)得到膠體金抗體復合物，然后檢測520納米(nm)下的吸光值，穩(wěn)定Iml膠體金的最低抗體量即為選擇的標記抗體的最低濃度;其他單克隆抗體的最低濃度采用以上同樣方法確定;通過比較每一種單克隆抗體的最低濃度來確定最低濃度的單克隆抗體。
[0046]在標記單克隆抗體時，取1ml制備好的膠體金放置于50ml的小燒杯中，調(diào)節(jié)PH值為9.0，緩慢加入穩(wěn)定Iml膠體金的最低濃度的單克隆抗體，攪拌10分鐘，之后緩慢加入牛血清白蛋白(BSA)使BSA濃度為I %，繼續(xù)攪拌30分鐘，4°C靜置2?3小時，獲得1ml的免疫膠體金復合物;將標記好的膠體金復合物進行離心法純化，2000rpm離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到離心管中，再12000rpm離心20分鐘后去掉上清。用TBS緩沖液輕輕懸起疏松的紅色沉積物。重復以上操作一次，再用TBS輕輕懸起疏松的紅色沉積物為原體積的I /10，S卩為Iml純化的免疫膠體復合物。采用同樣方法分別確定將要檢測的其他生物標志物單克隆抗體的最低濃度，并分別純化以備使用。
[0047]步驟S23，金標墊處理步驟:將金標墊2在BSA中浸泡第一段時間(例如2?3)小時后并干燥，采用制備好的膠體金抗體復合物均勻鋪在處理好的金標墊2上并恒溫干燥第二段時間備用；
[0048]在本實施例中，采用浸泡標金法制備金標墊2。先用2.0%的BSA浸泡金標墊2(例如玻璃纖維膜或聚酯膜)2?3小時，干燥后備用;采用膠體金抗體復合物用噴金儀以1.0ul/cm作為噴量均勻鋪在處理好的金標墊2上，恒溫(例如25°C?30 0C )干燥第二段時間(例如3?12小時)。
[0049]步驟S24，在硝酸纖維素膜上制作檢測線的步驟:將選擇的每種與生物標志物對應的另一種配對單克隆抗體按照排列順序在硝酸纖維素膜3上平行劃線制作成多條檢測線31并恒溫干燥第二段時間；
[ΟΟδΟ]在本實施例中，取濃度為2.0?2.5mg/ml的單克隆抗體，按照lul/cm在硝酸纖維素膜3上分別劃多條平行線，各平行線之間距離5?10mm，每一線條長度0.5?0.8cm，恒溫25°C?30°C干燥第二段時間(例如3?12小時)制作成檢測線31。所述多條檢測線31設置在硝酸纖維素膜3的排列順序是沿著樣品墊I上的樣品層析方向并按照生物標志物分子量從大到小平行等間隔排列。
[0051]步驟S25，在硝酸纖維素膜上制作控制線的步驟:將二抗在硝酸纖維素膜3上的檢測線31之后(例如檢測線T4)劃一根與每一條檢測線31平行的線制作成控制線32并恒溫干燥第二段時間；
[0052]在本實施例中，取濃度為2.0?2.5mg/ml的二抗，按照lul/cm在硝酸纖維素膜3上劃線，與檢測線31平行間隔5?10mm，線條長度0.5?0.8cm，恒溫(例如25°C?30°C)干燥第二段時間(例如3?12小時)小時制成控制線32。
[0053]步驟S26，樣品墊處理步驟:將樣品墊在I3BS緩沖液中浸泡第一段時間(例如2?3)，恒溫25 °C干燥第二段時間制作成樣品墊I備用；
[0054]在本實施例中，將樣品墊I在0.lmol/L的PBS緩沖液中浸泡2?3小時，恒溫(例如250C?30 °C)干燥第二段時間(例如3?12小時)小時備用。
[0055]步驟S27，制作吸水墊的步驟:選擇吸水墊4并按照預定寬度進行裁剪;在本實施例中，裁剪一條預定寬度(例如長2cm*寬Icm)的吸水墊4。
[0056]步驟S28，組裝膠體金試紙條的步驟:將上述制備好的樣品墊1、金標墊2、硝酸纖維素膜3以及吸水墊4首尾相互重疊預設長度并依次粘貼在支撐墊5上，經(jīng)裁剪得到膠體金試紙條；
[0057]在本實施例中，取長度為8?15cm的支撐墊5，在支撐墊5上依次粘貼樣品墊1、金標墊2、硝酸纖維素膜3、吸水墊4，各相鄰墊之間相互重疊預設長度(例如1.5?2mm)，并切成寬為(0.5?0.8) cm、長為(8?10) cm的膠體金試紙條。
[0058]在使用本發(fā)明利用述膠體金試紙條檢測早期糖尿病腎病患者的尿液(樣品)時，患者的尿液流經(jīng)樣品墊I，患者尿液中早期糖尿病腎病相關的生物標志物與金標墊2上的相應抗體結(jié)合，形成膠體金抗體復合物(即抗原抗體免疫復合物)；該復合物隨著樣品液體在硝酸纖維膜3上層析流動。當層析到檢測線區(qū)域時，則被預先包被有標志物的另一種單克隆抗體捕獲截留在檢測線31(例如Tl?T4)上，捕獲的某種標志物越多，在某一條檢測線31上顏色越深；同時，在層析過程中，未被截留的膠體金抗體復合物繼續(xù)前行，當?shù)竭_控制線32區(qū)域，則會被預先包被的二抗(例如羊抗鼠IgG)識別并截留在控制線32上，顯示紅色。根據(jù)不同檢測線31上紅色的深淺來判斷樣品中的不同標志物的含量。如果樣品中不含有某種標志物，則在相應的檢測線上不呈現(xiàn)顏色，如果含有某種標志物，就會在相應的檢測線31上呈現(xiàn)不同深淺程度的紅色?？刂凭€32上如果沒有紅色條帶出現(xiàn)，則說明膠體金試紙條失效。本發(fā)明所述膠體金試紙條具有檢測容易、應用廣泛、攜帶方便、篩查全面的優(yōu)點，并可以與顏色采集設備結(jié)合實現(xiàn)多種標志物的同時定量檢測，提高檢測效率。
[0059]以上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效功能變換，或直接或間接運用在其他相關的技術(shù)領域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種檢測早期糖尿病腎病的膠體金試紙條的制備方法，其特征在于，所述膠體金試紙條包括樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸水墊以及支撐墊，所述制備方法包含以下步驟: 制備膠體金的步驟:將0.01%的氯金酸與I %檸檬酸鈉混合，煮沸攪拌直到出現(xiàn)紅色得到膠體金，將該膠體金保存?zhèn)溆茫?制備膠體金抗體復合物的步驟:將與生物標志物對應的其中一種單克隆抗體分別與制備好的膠體金混合并通過梯度稀釋法確定最低濃度的單克隆抗體，在標記單克隆抗體時，取制備好的膠體金與最低濃度的單克隆抗體混合，攪拌后加入牛血清白蛋白(BSA)并經(jīng)純化獲得膠體金抗體復合物； 金標墊處理步驟:將金標墊在BSA中浸泡第一段時間后并干燥，將制備好的膠體金抗體復合物均勻鋪在金標墊上并恒溫干燥第二段時間； 在硝酸纖維素膜上制備檢測線的步驟:將選擇的每種與生物標志物對應的另一種配對單克隆抗體按照排列順序在硝酸纖維素膜上平行劃線制作成多條檢測線并恒溫干燥第二段時間； 在硝酸纖維素膜上制備控制線的步驟:將二抗在硝酸纖維素膜上的檢測線之后劃一根與檢測線平行的線制作成控制線并恒溫干燥第二段時間； 樣品墊處理步驟:將樣品墊在磷酸緩沖液(PBS)中浸泡第一段時間，恒溫干燥第二段時間制作成樣品墊備用； 制備吸水墊的步驟:選擇吸水墊并按照預定寬度進行裁剪； 組裝膠體金試紙條的步驟:將上述制備好的樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜以及吸水墊首尾相互重疊預設長度并依次粘貼在支撐墊上，經(jīng)裁剪得到膠體金試紙條。2.如權(quán)利要求1所述的檢測早期糖尿病腎病的膠體金試紙條的制備方法，其特征在于，所述樣品墊和金標墊均采用玻璃纖維膜或聚酯膜材料制成，所述吸水墊采用吸水纖維或吸水海綿材料制成。3.如權(quán)利要求1所述的檢測早期糖尿病腎病的膠體金試紙條的制備方法，其特征在于，所述通過梯度稀釋法確定最低濃度的單克隆抗體的步驟包括如下步驟: 選擇一種單克隆抗體，利用0.002mol/L、pH 9.0的PBS將選擇的單克隆抗體稀釋到預設濃度梯度0.01?0.111^/1111 ； 將所述單克隆抗體稀釋液與膠體金按照I: 5混合，并將PH調(diào)整為9.0，孵育10分鐘； 加入0.1ml的10 %氯化鈉(NaCl)得到膠體金抗體復合物，然后檢測520nm下的吸光值，經(jīng)比較分析確定穩(wěn)定Iml膠體金的最低抗體量即為選擇的單克隆抗體的最低濃度； 確定其他單克隆抗體的最低濃度采用以上相同步驟； 通過比較每一種單克隆抗體的最低濃度來確定最低濃度的單克隆抗體。4.如權(quán)利要求1所述的檢測早期糖尿病腎病的膠體金試紙條的制備方法，其特征在于，所述經(jīng)純化獲得膠體金抗體復合物的步驟包括如下步驟: 將膠體金與最低濃度的一種單克隆抗體混合液攪拌10分鐘，緩慢加入BSA使?jié)舛葹镮 %，繼續(xù)攪拌30分鐘，4°C靜置2?3小時，獲得免疫膠體金復合物； 將所述免疫膠體金復合物采用離心法純化，先2000rpm離心10分鐘后將上清轉(zhuǎn)移到離心管中，再12000rpm離心20分鐘后去掉上清； 用TBS緩沖液懸起紅色沉積物，再用TBS懸起紅色沉積物為原體積的1/10，即為純化的Iml膠體金抗體復合物。5.如權(quán)利要求1所述的檢測早期糖尿病腎病的膠體金試紙條的制備方法，其特征在于，所述第一段時間為2?3小時，所述第二段時間為3?12小時，所述恒溫為25°C?30°C。6.如權(quán)利要求1所述的檢測早期糖尿病腎病的膠體金試紙條的制備方法，其特征在于，所述生物標志物包括足糖萼蛋白、IV型膠原蛋白、肝型脂肪酸結(jié)合蛋白和中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白。7.如權(quán)利要求6所述的檢測早期糖尿病腎病的膠體金試紙條的制備方法，其特征在于，所述單克隆抗體包括足糖萼蛋白單克隆抗體、IV型膠原蛋白單克隆抗體、中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白單克隆抗體以及肝型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體。8.如權(quán)利要求1所述的檢測早期糖尿病腎病的膠體金試紙條的制備方法，其特征在于，所述多條檢測線設置在所述硝酸纖維素膜的排列順序是沿著樣品墊上的樣品層析方向并按照生物標志物分子量從大到小平行等間隔排列。9.如權(quán)利要求1所述的檢測早期糖尿病腎病的膠體金試紙條的制備方法，其特征在于，所述預設長度為1.5?2mm，所述二抗為羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。
【文檔編號】G01N33/532GK106066399SQ201610348706
【公開日】2016年11月2日
【申請日】2016年5月24日 公開號201610348706.6, CN 106066399 A, CN 106066399A, CN 201610348706, CN-A-106066399, CN106066399 A, CN106066399A, CN201610348706, CN201610348706.6
【發(fā)明人】張貫京, 陳興明, 高偉明, 李慧玲, 徐之艷
【申請人】深圳市前海安測信息技術(shù)有限公司