一種檢測青霉噻唑酸的免疫膠體金試紙條及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種快速檢測牛奶中青霉素降解物的方法，特別是一種檢測青霉噻唑 酸的免疫膠體金試紙條及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，關(guān)于乳及乳制品的安全問題的報道日漸增多，其中比較突出的問題即牛奶 中的抗生素殘留，特別是青霉素類抗生素的殘留。青霉素類抗生素由于價廉、高效、低毒廣 泛用于治療奶牛和其他動物疾病。然而由于使用和操作的不規(guī)范導(dǎo)致青霉素類抗生素殘留 現(xiàn)象十分嚴(yán)重。一些不法商販向牛奶中摻加內(nèi)酰胺酶使牛奶中殘留的青霉素降解，主 要產(chǎn)物為青霉噻唑酸，造成"無抗奶"假象從而逃避安全檢測。然而研宄發(fā)現(xiàn)，青霉素致敏 反應(yīng)時主要的抗原決定簇是青霉噻唑蛋白。青霉素極易降解成青霉噻唑酸，在體內(nèi)與組織 蛋白結(jié)合形成青霉噻唑蛋白，引發(fā)速發(fā)型過敏反應(yīng)。
[0003] 目前國內(nèi)外對青霉素檢測的研宄比較多，但世界各國針對青霉素降解產(chǎn)物的檢測 方法的報道卻很少。傳統(tǒng)方法有碘量法、高效液相色譜法等，而且這些方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)， 但都操作復(fù)雜不能實(shí)現(xiàn)青霉素降解物的現(xiàn)場快速檢測。目前關(guān)于青霉噻唑酸膠體金免疫層 析試紙條分析方法未見相關(guān)報道。
[0004] 膠體金免疫層析技術(shù)（GoldImmunochromatographyAssay，GICA)是二十世紀(jì)八、 九十年代在酶聯(lián)免疫分析方法的基礎(chǔ)上發(fā)展的新型快速免疫檢測技術(shù)。該技術(shù)操作簡單快 速、結(jié)果容易判定、安全無污染等諸多優(yōu)點(diǎn)使其在世界各國應(yīng)用十分廣泛，成為體外快速診 斷領(lǐng)域發(fā)展的趨勢性方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明創(chuàng)造旨在提出一種檢測青霉噻唑酸的免疫膠體金試紙條。
[0006] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明創(chuàng)造的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 一種檢測青霉噻唑酸的免疫膠體金試紙條，包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、 吸水墊和PVC背板，在PVC背板上按順序依次粘附有樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水 墊；所述的結(jié)合墊上包被有青霉噻唑酸抗體一膠體金標(biāo)記物；所述的硝酸纖維素膜上分別 包被有青霉噻唑酸抗原構(gòu)成的檢測線e和羊抗兔二抗構(gòu)成的質(zhì)控線，兩條線間隔距離為 5mm〇
[0008] 本發(fā)明還公開了上述免疫膠體金試紙條的制備方法，包括如下步驟：
[0009] (1)青霉噻唑酸抗血清純化，得到青霉噻唑酸多克隆抗體；
[0010] (2)制備青霉噻唑酸抗原；
[0011] (3)采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金；
[0012] (4)將步驟（1)純化的抗體加入到步驟（3)制備的膠體金中，制備青霉噻唑酸抗 體一膠體金標(biāo)記物；
[0013] (5)將步驟（4)制備的青霉噻唑酸抗體一膠體金標(biāo)記物包被于結(jié)合墊上；（6)將步 驟（2)制備的青霉噻唑酸抗原包被在硝酸纖維素膜上構(gòu)成檢測線，并將羊抗兔二抗包被于 硝酸纖維素膜上構(gòu)成質(zhì)控線；
[0014] (7)在PVC背板上按順序依次粘附樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，得到所 述的青霉噻唑酸膠體金免疫層析試紙條。
[0015] 上述材料中樣品墊和硝酸纖維素膜購自美國Millipore公司，結(jié)合墊、吸水墊和 PVC背板購自上海金標(biāo)生物科技公司。
[0016] 本發(fā)明純化了青霉噻唑酸抗血清，得到了青霉噻唑酸多克隆抗體，備用。制備青霉 噻唑酸抗原作為檢測線的包被抗原，采用購買的羊抗兔二抗作為質(zhì)控線的捕獲抗體。利用 競爭法來檢測青霉噻唑酸，根據(jù)檢測線條帶的深淺判斷待測樣品中是否含有青霉噻唑酸。 若質(zhì)控線條帶無顏色，則該試紙條失效。
[0017] 與現(xiàn)有國內(nèi)外檢測青霉噻唑酸的方法相比，本發(fā)明具有以下突出的優(yōu)點(diǎn)：1、本發(fā) 明的青霉噻唑酸膠體金免疫層析試紙條是利用抗原抗體的特異性反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的，因此特異性 高，靈敏度好。2、本發(fā)明的檢測試紙條檢測時間快速（10分鐘）且不需要任何特殊儀器、設(shè) 備，檢測成本低。3、本發(fā)明的檢測試紙條操作簡便，不需由專業(yè)人員操作。4、本發(fā)明的檢測 試紙條儲存方便，在室溫下可保存2個月。
【附圖說明】
[0018] 構(gòu)成本發(fā)明創(chuàng)造的一部分的附圖用來提供對本發(fā)明創(chuàng)造的進(jìn)一步理解，本發(fā)明創(chuàng) 造的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本發(fā)明創(chuàng)造，并不構(gòu)成對本發(fā)明創(chuàng)造的不當(dāng)限定。在 附圖中：
[0019] 圖1為本發(fā)明檢測試紙條的組裝示意圖。
[0020] 圖2為檢測結(jié)果的判定。
[0021] 圖3為青霉素降解物試紙條特異性的確定（從左至右：空白，青霉噻唑酸、青霉素、 氯霉素、三聚氰胺、四環(huán)素、沙丁胺醇、諾氟沙星、氧氟沙星、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧嗪，青霉 噻唑酸濃度為100yg/L，其他藥物濃度均為1000yg/L)。
[0022] 圖4為青霉噻唑酸檢測限的確定（青霉噻唑酸的濃度從左到右分別為0、5、10、 50yg/L)
[0023] 圖5為青霉噻唑酸試紙條在室溫下的穩(wěn)定性。（a)室溫放置兩周，（b)室溫放置四 周，（c)室溫放置六周，（d)室溫放置八周。每組青霉噻唑酸的濃度分別為0、10、50yg/L。
[0024] 圖6為添加BPA的牛奶樣品檢測結(jié)果（青霉噻唑酸的濃度從左到右分別為0、10、 50、100yg/L)〇
[0025] 圖7為添加BPA的奶粉樣品檢測結(jié)果（青霉噻唑酸的濃度從左到右分別為0、40、 100、200yg/kg)〇
[0026] 附圖標(biāo)記說明：
[0027] 1、樣品墊、2、結(jié)合墊、3、硝酸纖維素膜、4、吸水墊
[0028] 5、檢測線、6、質(zhì)控線、7、PVC板
【具體實(shí)施方式】
[0029] 需要說明的是，在不沖突的情況下，本發(fā)明創(chuàng)造中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可 以相互組合。
[0030] 下面將參考附圖并結(jié)合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明創(chuàng)造。
[0031] 實(shí)施例1(制備實(shí)施例）
[0032](一）青霉噻唑酸抗血清的純化
[0033] 本實(shí)驗(yàn)所用青霉噻挫酸抗血清由實(shí)驗(yàn)室自制，采用ProteinA-Sepharose4B作 親合層析介質(zhì)純化青霉噻唑酸抗血清，可一次性獲得接近純度較高的特異性抗體。具體操 作步驟為（1)平衡：用平衡緩沖液（〇.2mol/L的磷酸緩沖液）沖洗管路，平衡柱子，至基線 平穩(wěn)。（2)上樣：用平衡緩沖液將青霉噻唑酸特異性抗血清等體積稀釋后上柱。（3)洗雜： 用平衡緩沖液洗雜至雜蛋白的紫外吸收峰出現(xiàn)后繼續(xù)沖洗至基線平穩(wěn)。（4)洗脫收集：用 0.lmol/LpH2. 7的甘氨酸緩沖液洗脫特異性IgG抗體。當(dāng)紫外吸收曲線呈上升趨勢，收集 特異性抗體。并迅速用Tris-HCl中和抗體至中性。（5)封柱：抗體收集完成后迅速用醋酸 緩沖液酸化純化柱后，用平衡緩沖液中和純化柱，最后用20%乙醇飽和封柱。將純化收集的 抗體，用PH7. 4的磷酸緩沖液4°C透析三天后取出，添加0.1 % (w/v)的疊氮鈉，用磷酸緩沖 液將濃度稀釋成lmg/mL，備用。利用該抗體與膠體金結(jié)合制備青霉噻唑酸抗體一膠體金標(biāo) 記物。
[0034](二）青霉噻唑酸抗原的制備
[0035] 采用活化酯法制備青霉噻唑酸抗原。稱取IOmg青霉噻唑酸、5mgNHS和IOmgEDC 粉末，分別加至試管中，加入200yL0.01m〇l/L磷酸鹽緩沖液（pH5.7)溶解混合后置于旋 渦混合器上振蕩至試管中出現(xiàn)渾濁，再加入5mgEDC，置于搖床上反應(yīng)5h。將上述反應(yīng)液取 出置于離心管中，3000rpm，4°C離心l_2min，將上清取出，即活化酯液。
[0036]稱IOmg雞卵白蛋白（OVA)溶于2mL 0? Olmol/L磷酸鹽緩沖液（pH5. 7)，冰浴下加 入反應(yīng)液后4°C過夜反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物于pH7. 4的磷酸鹽緩沖液（PBS)中4°C透析三天，然后 精確量取反應(yīng)溶液的體積，測定濃度后，加入0.1 % (w/v)的疊氮鈉，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0037] 利用該抗原包被硝酸纖維素膜上的檢測線。
[0038] 實(shí)施例2(制備實(shí)施例）
[0039] 青霉噻唑酸膠體金免疫層析試紙條組裝及制備方法
[0040] 1、試紙條組裝：
[0041] 本發(fā)明的試紙條組成如下：樣品墊1、結(jié)合墊2、硝酸纖維素膜3、吸水墊4和PVC板 8,在PVC板8上按順序依次粘附有樣品墊1、結(jié)合墊2、硝酸纖維素膜3、吸水墊4 ;所述的結(jié) 合墊2上包被有青霉噻唑酸抗體一膠體金標(biāo)記物；所述的硝酸纖維素膜3上分別包被有青 霉噻唑酸抗原構(gòu)成的檢測線5和羊抗兔二抗構(gòu)成的質(zhì)控線6。