一種細胞內atp的熒光成像方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物分析及生命科學領域，具體涉及一種細胞內ATP的熒光成像方法。
【背景技術】
[0002]作為細胞內能量傳遞的“分子通貨”，ATP(三磷酸腺)儲存和傳遞化學能，是體內組織細胞所需能量的主要來源，參與蛋白質、脂肪、糖和核苷酸的合成，對細胞許多代謝過程均有重要的調節(jié)作用，ATP的含量變化可以反映細胞的變異和損傷。因此，ATP作為重大疾病的標志物之一得到了廣泛的研宄和關注。通過檢測惡性腫瘤ATP濃度變化，可以了解其細胞代謝情況，為惡性腫瘤藥敏的異質性和個體化療提供可行性治療方案。因此，建立快速、靈敏、準確的ATP熒光成像分析方法不僅有助于癌癥等重大疾病的早期診斷及治療，同時對于臨床醫(yī)學、生命科學、食品衛(wèi)生、環(huán)境監(jiān)測、醫(yī)藥及化妝品等諸多領域也有著重要的實際意義。
[0003]目前，國內外對于細胞內ATP的熒光成像方法的研宄還停留在傳統(tǒng)方法階段，即采用特定的熒光染料進行成像研宄，存在過分依賴熒光染料、成像檢測技術單一等不足。為此，有關細胞內活性小分子如ATP的熒光成像研宄內容成為近年來細胞成像的研宄熱點之一，特別是熒光成像新原理、新方法的提出以及新型探針材料的設計、合成正成為目前亟待研宄并亟須解決的核心問題。
[0004]近幾年來，金納米籠作為一種新興的納米載體得到了廣泛的關注。該納米材料具有中空多孔的結構，內部為空心結構，光滑的籠壁表面上分布著許多小孔。與傳統(tǒng)的納米顆粒相比，金納米籠的局域表面等離子共振峰位于近紅外區(qū)700?900nm，該波段對于生物醫(yī)學意義重大，尤其是對于細胞及活體研宄。利用基于靜電作用修飾的金納米籠-核酸適體的納米熒光探針進行細胞中ATP的熒光成像技術還未見文獻報道。

【發(fā)明內容】

[0005]為了克服現(xiàn)有技術存在的不足，同時，也為了有效地利用新興納米載體的顯著優(yōu)點，針對基于靜電作用修飾的金納米籠載體進行細胞ATP的熒光成像技術未見報道，因此，本發(fā)明的目的:提供一種采用基于正電荷修飾的金納米籠-核酸適體的納米熒光探針進行細胞內ATP的熒光成像的方法，該方法所采用的納米熒光探針設計巧妙，結構簡單，對ATP選擇性好、細胞毒性小、細胞膜滲透能力強、胞內釋放可控性強、在細胞內的分散性好，作為活細胞內ATP的熒光成像納米探針，可實現(xiàn)細胞內ATP的分布及示蹤研宄和應用。將本發(fā)明提出的熒光成像方法用于細胞內ATP的熒光顯微成像，能夠方便、快捷地實現(xiàn)細胞內ATP的高靈敏、高準確度的熒光成像，具有選擇性好、響應時間短、易于直接觀測、便于實時監(jiān)測等優(yōu)點，可在生物活性物質的成像檢測及應用方面發(fā)揮重要作用，為腫瘤細胞熒光成像的基礎研宄和應用開發(fā)提供新的方法和技術。
[0006]本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)發(fā)明目的的。本發(fā)明所采用的納米熒光探針是以金納米籠作為載體，利用其空心多孔的結構特性，在其內部裝載熒光分子，為了防止熒光分子的外泄，通過在其表面組裝ATP適體分子門，將金納米籠表面的孔封堵；其中，所述的ATP適體可以通過靜電作用被組裝到金納米籠表面，具體可以通過在金納米籠表面修飾正電荷的方法而將其組裝到金納米籠表面，優(yōu)選地采用聚二烯丙基二甲基氯化銨即Pdda作為正電荷修飾劑在金納米籠表面修飾一層聚陽離子。
[0007]優(yōu)選地，所述的納米熒光探針內部裝載的熒光分子可以是羅丹明B。
[0008]一種采用基于靜電作用修飾的金納米籠的納米熒光探針進行細胞內ATP的熒光成像的方法，包括如下步驟:
[0009](I)取適量細胞，以2000?3000轉/min下離心5?lOmin，移除上清液；
[0010](2)加入制備好的基于靜電作用修飾的ATP納米熒光探針，并用移液槍均勻分散細胞和探針，置于37°C恒溫水浴箱孵育10?50min后進行激光共聚焦掃描成像實驗；
[0011]所述的基于靜電作用修飾的金納米籠的ATP納米熒光探針的制備方法，包括如下步驟:
[0012](I)在金納米籠的懸浮液中加入Pdda溶液，室溫振蕩過夜；
[0013](2)離心分離，加入羅丹明B溶液，室溫振蕩過夜；
[0014](3)向上述溶液中加入ATP核酸適體溶液，室溫振蕩過夜，離心分離，用PBS緩沖溶液稀釋后即制得基于靜電作用修飾的納米熒光探針。
[0015]本發(fā)明的有益效果:將本發(fā)明提出的熒光成像方法用于細胞內ATP的熒光顯微成像，能夠方便、快捷地實現(xiàn)細胞內ATP的高靈敏、高準確度的熒光成像，具有選擇性好、響應時間短、易于直接觀測、便于實時監(jiān)測等優(yōu)點，可在生物活性物質的成像檢測及應用方面發(fā)揮重要作用，為腫瘤細胞熒光成像的基礎研宄和應用開發(fā)提供新的方法和技術。本發(fā)明所采用的基于靜電作用修飾的納米熒光探針具有設計巧妙、機構簡單的優(yōu)點，對ATP選擇性好、細胞毒性小、細胞膜滲透能力強、胞內釋放可控性強、在細胞內的分散性好，作為活細胞內ATP的熒光成像納米探針，可實現(xiàn)細胞內ATP的分布及示蹤研宄和應用。該成像方法在生物醫(yī)學、生命科學等領域具有較大的應用潛力和廣闊的應用前景，可用于細胞內ATP的特異性成像檢測，為癌癥等重大疾病的早期診斷及治療提供新的途徑和方法。
【附圖說明】
[0016]圖1采用基于靜電作用修飾的金納米籠的納米熒光探針得到的細胞內ATP熒光顯微成像圖。
【具體實施方式】
[0017]以下是本發(fā)明涉及的具體實施例，對本發(fā)明的技術方案做進一步描述，但是本發(fā)明的保護范圍并不限于這些實施例。凡是不背離本發(fā)明構思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護范圍之內。
[0018]下面通過實施例具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受下述實施例的限定。
[0019]實驗儀器:THZ-82A氣浴恒溫振蕩器(金壇市醫(yī)療器械廠)；KDC_160HR高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)；Leica TCS SP5II激光共聚焦顯微鏡(德國萊卡公司)。
[0020]實驗試劑:聚乙烯吡咯烷酮K-30 (PVP,中國國藥化學公司)；硝酸銀(AgNO3,上海試劑一廠)；硫化鈉(Na2S,天津博迪化工股份有限公司)；鹽酸(煙臺三和化學試劑有限公司)；乙二醇(