專利名稱：核苷酸鏈的修飾方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核苷酸鏈的修飾方法，特別是涉及用修飾物質(zhì)直接修飾核苷
酸鏈的3'末端來(lái)對(duì)核苷酸鏈進(jìn)行標(biāo)簽化、標(biāo)記化、固定化的方法。
背景技術(shù)：
一直以來(lái)，基因分析中釆用放射性同位素作為用于對(duì)DNA、 RNA、寡核 苷酸、核酸等核苷酸鏈進(jìn)行標(biāo)簽化、標(biāo)記化的修飾物質(zhì)，但由于存在因半衰 期產(chǎn)生的使用時(shí)間的限制、使用場(chǎng)所的限制、被放射線照射的問(wèn)題、廢棄的問(wèn) 題等，因此趨向于減少其使用。近年來(lái)，作為替代放射性同位素的修飾物質(zhì)， 廣泛釆用熒光素等熒光物質(zhì)或生物素等。
作為修飾核苷酸鏈的5'末端的方法，提出有將5'末端的磷酸基作為官能團(tuán)
通過(guò)化學(xué)的交聯(lián)縮合反應(yīng)來(lái)用修飾物質(zhì)進(jìn)行修飾的方法(例如，非專利文獻(xiàn)1 2(在后列舉，下同))。此外，還提出了通過(guò)在核苷酸鏈的化學(xué)合成時(shí)引入賦予 了修飾物質(zhì)的磷酸基來(lái)修飾核苷酸鏈的方法(例如，專利文獻(xiàn)1 4和非專利文 獻(xiàn)3 4)，該方法同時(shí)可以應(yīng)對(duì)核苷酸鏈的化學(xué)合成的自動(dòng)化，所以被廣泛應(yīng) 用。
然而，修飾5'末端的上述方法中，對(duì)于l分子核苷酸鏈只能用l分子修飾物 質(zhì)進(jìn)行修飾，交聯(lián)縮合反應(yīng)也需要較長(zhǎng)時(shí)間。關(guān)于核苷酸鏈的化學(xué)合成時(shí)進(jìn)行 修飾的方法，雖然化學(xué)合成被認(rèn)為最大核苷酸數(shù)可以達(dá)到130，但該合成方法 中核苷酸逐一層疊聚合，1次的層疊聚合效率最高也就99%，因此合成的核苷 酸數(shù)越大則合成收率越低，為了獲得足夠的收量，必須限制核苷酸數(shù)(例如， 非專利文獻(xiàn)5)。另外，檢測(cè)基因時(shí)利用堿性磷酸酶的顯色或發(fā)光反應(yīng)因靈敏度 高而被廣泛采用(例如非專利文獻(xiàn)6 7)，但因?yàn)閴A性磷酸酶具有引發(fā)核苷酸鏈 的5'末端的脫磷酸化反應(yīng)的性質(zhì)，所以使修飾物質(zhì)從核苷酸鏈離解，對(duì)于修飾 了 5 '末端的核苷酸鏈無(wú)法利用堿性磷酸酶。除了修飾5'末端的方法之外，還提出有利用核苷酸鏈的復(fù)制反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄反 應(yīng)，通過(guò)引入預(yù)先用修飾物質(zhì)修飾了的核苷酸來(lái)獲得用修飾物質(zhì)修飾了的核苷 酸鏈的方法。復(fù)制反應(yīng)中，可以例舉以往的基于放射性同位素的標(biāo)簽化、標(biāo)記
化中所采用的切口平移法、隨機(jī)引物法、引物延伸法等，利用DNA聚合酶的復(fù) 制反應(yīng)引入預(yù)先用修飾物質(zhì)實(shí)施了修飾處理的脫氧核糖核苷-5'-三磷酸來(lái)代 替放射性同位素；在轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，利用RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引入預(yù)先用修飾 物質(zhì)實(shí)施了修飾處理的核糖核苷-5'-三磷酸(例如專利文獻(xiàn)5 8和非專利文獻(xiàn) 6、 8 9)。這些修飾方法具有操作簡(jiǎn)便、核苷酸鏈的修飾量高、修飾物質(zhì)穩(wěn)定、 修飾物質(zhì)不因堿性磷酸酶而離解的優(yōu)點(diǎn)，因此作為適合于基因分析的方法被廣 泛采用。另外，這些修飾方法可以與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、即所謂PCR法或RNA擴(kuò)增 反應(yīng)并用，從而同時(shí)實(shí)現(xiàn)基因的擴(kuò)增反應(yīng)和標(biāo)簽化、標(biāo)記化反應(yīng)(例如，非專 利文獻(xiàn)10 12)，因此被廣泛應(yīng)用于統(tǒng)稱為DNA微陣列的基因的綜合分析(例如， 專利文獻(xiàn)9 10和非專利文獻(xiàn)13 15)。
但是，上述的基于復(fù)制反應(yīng)或轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的修飾方法是引入預(yù)先用修飾 物質(zhì)修飾了的核苷酸、即擬似的核苷酸的方法，所以引入效率比原來(lái)的核 苷酸差，并用PCR時(shí)擴(kuò)增效率也比原來(lái)的核苷酸差(例如，專利文獻(xiàn)8和非專 利文獻(xiàn)16)，修飾物質(zhì)的引入量也是隨機(jī)的，為每1分子核苷酸鏈12 25分 子(例如，非專利文獻(xiàn)17)，修飾量的再現(xiàn)性存在問(wèn)題。此外，由于在核苷 酸鏈內(nèi)賦予修飾物質(zhì)，基因分析的雜交中，即核苷酸鏈形成雙鏈時(shí)，修飾 物質(zhì)產(chǎn)生的位阻不可避免。另外，預(yù)先用修飾物質(zhì)修飾了的核苷酸的合成 復(fù)雜，不是任何人都可以容易地進(jìn)行合成的(例如，非專利文獻(xiàn)8、 18)，因 而修飾物質(zhì)的種類受到限定。 '
作為其它的修飾方法，還有不像上述的利用復(fù)制反應(yīng)或轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的修 飾方法那樣需要作為模板的核苷酸鏈，在沒(méi)有模板的情況下通過(guò)核苷酸的 附加反應(yīng)修飾核苷酸鏈的方法。例如，有利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，使 預(yù)先用修飾物質(zhì)實(shí)施了修飾處理的脫氧核糖核苷-5'-三磷酸或雙脫氧核糖核 苷-5'-三磷酸加尾于核苷酸鏈的3'末端的方法(例如，非專利文獻(xiàn)19 21); 利用RNA連接酶，使預(yù)先用修飾物質(zhì)實(shí)施了修飾處理的脫氧核糖核苷-3',5'-二磷酸或核糖核苷-3'，5'-二磷酸加尾的方法(例如，專利文獻(xiàn)ll和非專利文獻(xiàn)22)。其中，使雙脫氧核糖核苷-5'-三磷酸加尾的方法或者使核糖核苷-3'，5
'-二磷酸加尾的方法僅能對(duì)l分子核苷酸鏈修飾l分子修飾物質(zhì)，但使預(yù)先用
修飾物質(zhì)修飾了的脫氧核糖核苷-5'-三磷酸加尾的方法能夠?qū)分子核苷酸 鏈用多分子的修飾物質(zhì)進(jìn)行修飾。
但是，這樣使預(yù)先用修飾物質(zhì)修飾了的脫氧核糖核苷三磷酸加尾的方法 由于修飾了的核苷酸的附加數(shù)根據(jù)反應(yīng)條件而隨機(jī)，而且還形成不需要的核苷 酸序列，因此也在基因分析的雜交中成為錯(cuò)配的主要原因。此外，像上述的利 用復(fù)制反應(yīng)或轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的修飾方法中說(shuō)明的那樣，預(yù)先用修飾物質(zhì)修飾了 的核苷酸不是任何人都可以容易地進(jìn)行合成的，因而修飾物質(zhì)的種類受到 限定。
在核苷酸鏈的3'末端引入修飾物質(zhì)除了上述的加尾之外，還可以通過(guò) 化學(xué)合成法來(lái)實(shí)現(xiàn)，該情況下不會(huì)形成不需要的核苷酸序列。但是，無(wú)法 避免對(duì)于化學(xué)合成法已經(jīng)提到的收量和核苷酸鏈長(zhǎng)的限制的問(wèn)題。
核苷酸鏈的修飾不僅用于標(biāo)簽化、標(biāo)記化，也為了將核苷酸鏈固定于 基板上而進(jìn)行。作為固定化用的基板，以往采用進(jìn)行加工而使其具有疏水 性和正電荷的硝化纖維素、尼龍、聚偏氟乙烯等的基板，通過(guò)核苷酸鏈和 基板的疏水鍵以及核苷酸鏈的磷酸基(帶負(fù)電)和帶正電的基板的靜電偶 合，核苷酸鏈被固定于基板。
該固定化方法中，核苷酸鏈越長(zhǎng)，則每l分子核苷酸鏈的基板占有率越 高，因此基板單位面積的固定化量越少，產(chǎn)生固定于基板的核苷酸鏈離解
等問(wèn)題。于是，采用如下的方法通過(guò)用具有官能團(tuán)的修飾物質(zhì)修飾核苷
酸鏈的末端的同時(shí)，預(yù)先在基板表面形成對(duì)應(yīng)于所述官能團(tuán)的結(jié)合基團(tuán)， 使修飾物質(zhì)的官能團(tuán)和基板表面的結(jié)合基團(tuán)交聯(lián)縮合，從而將核苷酸鏈以
共價(jià)鍵固定于基板表面(例如，專利文獻(xiàn)12 15和非專利文獻(xiàn)23)。該方法 與以往的疏水鍵和靜電偶合相比，可以更穩(wěn)定且牢固地將核苷酸鏈固定化。 作為官能團(tuán)-結(jié)合基團(tuán)的組合，可以采用氨基-羧基、氨基-異硫氰酸酯基、 氨基-醛基、氨基-琥珀酰亞胺基、氨基-環(huán)氧基等。
但是，用具有官能團(tuán)的修飾物質(zhì)修飾核苷酸鏈的5'末端的情況下，由 于介以磷酸基，因此產(chǎn)生上述的問(wèn)題，即由于核苷酸鏈因磷酸酶而離解，因此基于發(fā)光反應(yīng)的檢測(cè)困難。用具有官能團(tuán)的修飾物質(zhì)修飾核苷酸鏈的 3'末端的情況下，也產(chǎn)生上述的問(wèn)題，即為了能夠通過(guò)化學(xué)合成來(lái)合成且 獲得足夠的收量，核苷酸鏈長(zhǎng)受到限制。
作為解決以上的核苷酸鏈的標(biāo)簽化、標(biāo)記化、固定化的方法，有直接用
修飾物質(zhì)對(duì)核苷酸鏈的3'末端部分進(jìn)行修飾的方法(參照專利文獻(xiàn)16)。該方法
如下在核苷酸鏈的3'側(cè)附加2個(gè)以上的具有尿嘧啶堿基的核苷酸，將附加了
的核苷酸用尿嘧啶DNA糖苷酶分解而在3'末端形成醛基，通過(guò)該醛基和修飾物 質(zhì)所具有的氨基的反應(yīng)而生成共價(jià)鍵，從而直接用修飾物質(zhì)對(duì)核苷酸鏈的3'末
端進(jìn)行修飾。
(專利文獻(xiàn))
1:曰本專利1651975號(hào)公報(bào)
2:日本專利1706289號(hào)公報(bào)
3:曰本專利1780550號(hào)公報(bào)
4:日本專利1845794號(hào)公報(bào)
5:日本專利1972288號(hào)公報(bào)
6:日本專利2131226號(hào)公報(bào)
7:日本專利2625095號(hào)公報(bào)
8:日本專利特開(kāi)昭61-115094號(hào)公報(bào)
9:日本專利3272365號(hào)公報(bào)
10:日本專利特表2002-538836號(hào)公報(bào)
11:日本專利特開(kāi)平5-331185號(hào)公報(bào)
12:日本專利特開(kāi)2000-63154號(hào)公報(bào)
13:日本專利特開(kāi)2001-66304號(hào)公報(bào)
14:日本專利特開(kāi)2003-161731號(hào)公報(bào)
15:日本專利特表2003-526078號(hào)公報(bào)
16:日本專利特開(kāi)2003-246794號(hào)公報(bào)
(非專利文獻(xiàn))
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如上所述，對(duì)于核苷酸鏈的修飾方法提出有各種方法，這些方法各有 長(zhǎng)短，存在使用者不得不根據(jù)用途選擇修飾方法的負(fù)擔(dān)。簡(jiǎn)而言之，介以 磷酸基對(duì)核苷酸鏈的5'末端進(jìn)行修飾的方法存在穩(wěn)定性的問(wèn)題，在核苷酸 鏈的化學(xué)合成中對(duì)5'末端或3'末端實(shí)施修飾處理的方法存在核苷酸鏈長(zhǎng)的 限制和收量的問(wèn)題。利用復(fù)制反應(yīng)或轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的方法的用途限定于從一開(kāi) 始就用熒光物質(zhì)等修飾物質(zhì)對(duì)核苷酸鏈進(jìn)行標(biāo)簽化、標(biāo)記化，其復(fù)制效率 和轉(zhuǎn)錄效率也存在問(wèn)題。附加預(yù)先用修飾物質(zhì)修飾了的核苷酸的加尾法形
成不需要的核苷酸序列。為了將核苷酸鏈固定于基板，理想的是用具有在 與基板表面的結(jié)合基團(tuán)之間生成共價(jià)鍵的官能團(tuán)的修飾物質(zhì)對(duì)核苷酸鏈進(jìn) 行修飾，但該修飾中上述的問(wèn)題也無(wú)法避免。
專利文獻(xiàn)10記載的方法雖然不論核苷酸鏈的鏈長(zhǎng)怎樣，都可以直接用 任意的修飾物質(zhì)對(duì)核苷酸鏈的3側(cè)進(jìn)行修飾，但在附加反應(yīng)、分解反應(yīng)和修 飾反應(yīng)中分別需要進(jìn)行釆用反應(yīng)條件的改變和乙醇沉淀等的試樣回收，至 修飾反應(yīng)結(jié)束需要10小時(shí)以上。
本發(fā)明是解決上述問(wèn)題的發(fā)明，其目的在于在直接用修飾物質(zhì)對(duì)核苷 酸鏈的3末端進(jìn)行修飾時(shí)，使反應(yīng)條件的改變達(dá)到最低限度，縮短所需時(shí)間。
為了解決上述課題，本發(fā)明的核苷酸的修飾方法的特征在于，在將作 為修飾對(duì)象的核苷酸鏈和具有與構(gòu)成所述核苷酸鏈的堿基不同的特定堿基 的核苷酸加入到緩沖液而得的反應(yīng)混合液中，使對(duì)所述核苷酸向所述核苷 酸鏈的3'末端的附加進(jìn)行催化的酶、特異地作用于所述核苷酸的分解酶和 修飾所述核苷酸鏈的所需的修飾物質(zhì)共存，在將所述核苷酸附加到所述核 苷酸鏈的3'末端的同時(shí)，分解所附加的核苷酸的序列而在所述核苷酸鏈的3'
末端形成對(duì)于所述修飾物質(zhì)具有結(jié)合能力的官能團(tuán)，用所述修飾物質(zhì)直接 對(duì)形成有所述官能團(tuán)的核苷酸鏈的3'末端進(jìn)行修飾。不在中途分離混合液 中的反應(yīng)產(chǎn)物等而進(jìn)行一系列的反應(yīng)，用修飾物質(zhì)直接修飾核苷酸鏈，所 以可以實(shí)現(xiàn)操作的簡(jiǎn)便化、短時(shí)間化，也不受核苷酸鏈長(zhǎng)的限制，因此便利性高。
可以從最初開(kāi)始就混合作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈、核苷酸、修飾物質(zhì) 和兩種酶，使附加反應(yīng)、分解反應(yīng)和修飾反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行；也可以將作為修 飾對(duì)象的核苷酸鏈、核苷酸和兩種酶混合而使附加反應(yīng)和分解反應(yīng)同時(shí)進(jìn) 行，在分解反應(yīng)后的混合液中加入修飾物質(zhì)來(lái)進(jìn)行修飾反應(yīng)。
本發(fā)明的特征在于，作為活化對(duì)附加反應(yīng)進(jìn)行催化的酶的活化因子， 添加不阻礙修飾物質(zhì)的修飾反應(yīng)的活化因子。這是因?yàn)榉磻?yīng)混合液理想的 是采用不含3步反應(yīng)的反應(yīng)阻礙因子的組成。
本發(fā)明的特征在于，使反應(yīng)混合液中包含使對(duì)附加反應(yīng)進(jìn)行催化的酶 的反應(yīng)活性溫和的緩沖劑成分。這是為了防止在核苷酸鏈的3'末端過(guò)度附 加具有特定堿基的核苷酸，使分解所附加的核苷酸的序列的后續(xù)的分解反
應(yīng)變得容易進(jìn)行。
對(duì)附加反應(yīng)進(jìn)行催化的酶為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶時(shí)，活化因子可以 使用除鈷離子以外的2價(jià)金屬陽(yáng)離子。這是因?yàn)橹灰皇氢掚x子，在修飾物 質(zhì)具有上述基團(tuán)的情況下也可以防止沉淀。優(yōu)選使用錳離子或鎂離子。
對(duì)附加反應(yīng)進(jìn)行催化的酶為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶時(shí)，作為緩沖劑成 分，可以優(yōu)選使用4-(2-羥基乙基)哌嗪-1-乙磺酸、2-嗎啉代乙磺酸或3， 3-
二甲基戊二酸。
附加的核苷酸的特定堿基可以是原來(lái)的(天然的)構(gòu)成核苷酸鏈的核苷 酸中所不含的堿基，B卩，不是腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶，而是 這些堿基經(jīng)烷基化、脫氨基化、^化、羥基化或氧化等而得的突變堿基。 如果是具有這樣的特定堿基的核苷酸，則特異的分解酶對(duì)其作用時(shí)，作為
修飾對(duì)象的核苷酸鏈本身可以維持初始的狀態(tài)。
作為分解酶，可以使用DNA糖苷酶或DNA修復(fù)酶。藉此，所附加的核苷 酸的序列中，發(fā)生堿基的脫離、脫氧核糖的開(kāi)環(huán)和3'位磷酸基的離解，在 核苷酸鏈的3'末端形成醛基。附加的核苷酸為2'-脫氧尿苷-5'-—磷酸時(shí)， 分解酶可以優(yōu)選使用尿嘧啶DNA糖苷酶。
修飾物質(zhì)可以是具有-NH2的物質(zhì)。這是因?yàn)榧词共徊捎锰貏e的催化反 應(yīng)，存在于修飾物質(zhì)中的-NH2也與醛基等自發(fā)地進(jìn)行交聯(lián)結(jié)合反應(yīng)。例如，在醛和-NH2之間形成席夫堿。
修飾物質(zhì)可以是對(duì)核苷酸鏈進(jìn)行標(biāo)簽化、標(biāo)記化的物質(zhì)。所述修飾物 質(zhì)可以是熒光性物質(zhì)、維生素、脂質(zhì)、氨基酸、寡肽、蛋白質(zhì)或生物體外 源性物質(zhì)。
修飾物質(zhì)可以是為了使核苷酸鏈結(jié)合于基板而介于其間的物質(zhì)。所述 修飾物質(zhì)可以是具有氨基和巰基的化合物。此外，可以是具有氨基和通過(guò) 水解而形成硅烷醇基的烷氧基硅烷基的化合物。
具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的核苷酸的修飾方法中，可以混合具有任意的堿基
序列的核苷酸鏈、具有特定堿基的核苷酸、對(duì)所述核苷酸向所述核苷酸鏈
的3'末端的附加反應(yīng)進(jìn)行催化的酶、作為作用于所述核苷酸的DNA糖苷酶或 DNA修復(fù)酶的分解酶、以及對(duì)于通過(guò)以所述酶所附加的核苷酸被所述分解酶 分解而形成于所述核苷酸鏈的3'末端的醛基具有結(jié)合能力的修飾物質(zhì)。
此外，可以在加入有具有任意的堿基序列的核苷酸鏈的緩沖液中混合 2'-脫氧尿苷-5'-三磷酸、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶及其活化因子和尿嘧啶DNA
糖苷酶，對(duì)該反應(yīng)混合液進(jìn)行加熱處理或堿處理后，在該經(jīng)過(guò)處理的反應(yīng) 混合液中混合具有H2N-的修飾物質(zhì)。
如果采用本發(fā)明的核苷酸鏈的修飾方法，則可以在將核苷酸鏈保持于 原來(lái)的狀態(tài)、即不追加多余的核苷酸的情況下，簡(jiǎn)便地以較短時(shí)間用所需 的修飾物質(zhì)進(jìn)行修飾。不論核苷酸鏈?zhǔn)菃捂溸€是雙鏈都可以。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明
圖l是表示本發(fā)明的核苷酸鏈的修飾方法的原理的反應(yīng)模式圖。 圖2是表示利用

圖1的反應(yīng)來(lái)對(duì)核苷酸鏈進(jìn)行標(biāo)簽化、標(biāo)記化的過(guò)程的 反應(yīng)模式圖。
圖3是表示利用圖1的反應(yīng)來(lái)將核苷酸鏈固定于貴金屬基板的過(guò)程的反 應(yīng)模式圖。
圖4是表示本發(fā)明的核苷酸鏈的修飾方法的各反應(yīng)過(guò)程中的反應(yīng)狀況 的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。
圖5是表示本發(fā)明的核苷酸鏈的修飾方法中的酶活化因子的影響的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。
圖6是表示本發(fā)明的核苷酸鏈的修飾方法的加尾反應(yīng)中的酶活化因子
和緩沖劑成分的影響的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。 實(shí)施發(fā)明的最佳方式
以下，基于附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明。
首先，參照?qǐng)Dl對(duì)本發(fā)明的核苷酸鏈的修飾方法的原理進(jìn)行說(shuō)明。圖中
的x表示腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶中的任意的堿基，u表示尿嘧
啶堿基。n表示任意的自然數(shù)，m表示O或任意的自然數(shù)。
在加入有具有任意的堿基序列的核苷酸鏈(I )的緩沖液中混合以下式
8 8 i
HO卞O卞O卞O
0一0一 0一
表示的2'-脫氧尿苷-5'-三磷酸(以下略作dUTP)、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(以 下略作TdT)、尿嘧啶-DNA糖苷酶(以下略作UDG)和活化TdT的活化因子。作 為活化因子，理想的是使用作為2價(jià)陽(yáng)離子的鎂離子或錳離子。
藉此，通過(guò)TdT的聚合酶作用，在核苷酸鏈(I)的3'末端呈直鏈狀連續(xù) 地加尾2個(gè)以上的以下式表示的2'-脫氧尿苷-5'-—磷酸(以下略作d麗P)，生成核苷酸鏈(II)。同時(shí)，通過(guò)UDG的作用，所加尾的dUMP的尿嘧啶堿基被離解的同時(shí)，脫氧核糖的糖苷鍵被水解，生成具有醛基的核苷酸鏈(ni)。通過(guò)預(yù)先使TdT酶和UDG酶共存，可以在以TdT使dUMP加尾的同時(shí)，使所加尾的dUMP立即進(jìn)入到以UDG進(jìn)行分解的反應(yīng)。
接著，將含生成的核苷酸鏈(III)的反應(yīng)混合液在90 10(TC進(jìn)行5 15分鐘的加熱處理，或者實(shí)施在反應(yīng)混合液中滴加氫氧化鈉溶液或氫氧化鉀溶液等強(qiáng)堿溶液的堿處理。藉此，分解了的加尾部分離解，獲得在作為起始物質(zhì)的核苷酸鏈(I )的3'末端直接形成有醛基的核苷酸鏈(IV)。
最后，在含核苷酸鏈(IV)的反應(yīng)混合液中混合具有H2N-的修飾物質(zhì)(圖中的Y表示構(gòu)成修飾物質(zhì)的化合物、分子或物質(zhì)的其余部分)。藉此，存在于修飾物質(zhì)的-NH2和形成于核苷酸鏈的3'末端的醛基在無(wú)特別的催化反應(yīng)的情況下自發(fā)地進(jìn)行交聯(lián)結(jié)合反應(yīng)，在-NH2和醛基之間形成席夫堿，獲得用修飾物質(zhì)直接修飾了3'末端的不含多余的核苷酸的核苷酸鏈(V)。
還有，作為上述的TdT的活化因子，以往廣泛采用鈷離子，但確認(rèn)鈷離子與這樣修飾核苷酸鏈的具有-NH2的修飾物質(zhì)形成不溶性的沉淀物，因此理
想的是本發(fā)明中避免采用鈷離子。
本發(fā)明中作為T(mén)dT的活化因子所優(yōu)選采用的所述的鎂離子和錳離子不會(huì)與修飾物質(zhì)形成不溶性的沉淀物。鎂離子和錳離子的酶活化能力雖然比鈷離子低，但通過(guò)釆用這樣的離子，反而可以限制基于TdT的dUMP的加尾量，因此可以使以加尾于核苷酸鏈的dUMP為底物的基于UDG的反應(yīng)容易進(jìn)行，即可以通過(guò)UDG迅速地消化底物。dUMP通過(guò)呈直鏈狀連續(xù)地對(duì)作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈加尾2個(gè)以上，可以起到尿嘧啶DNA糖苷酶底物的作用。
如上所述，在不分離反應(yīng)混合液中的成分和反應(yīng)產(chǎn)物的情況下進(jìn)行一系列的反應(yīng)，可以用修飾物質(zhì)直接對(duì)核苷酸鏈的3'末端進(jìn)行修飾，能夠?qū)崿F(xiàn)操作的簡(jiǎn)化、短時(shí)間化。
與以往的方法相比，本發(fā)明的核苷酸鏈的修飾方法由于不是利用復(fù)制反應(yīng)或轉(zhuǎn)錄反應(yīng)來(lái)引入修飾物質(zhì)的方法，因此不像引入反應(yīng)那樣修飾物質(zhì)的修飾量依賴于核苷酸鏈的鏈長(zhǎng)。此外，與基于交聯(lián)縮合反應(yīng)的修飾5'末端的方法(例如，Nucleic Acids Res. 13巻1529頁(yè)1985年)相比，修飾時(shí)間可以大幅縮短。另外，與在核苷酸鏈的化學(xué)合成中同時(shí)修飾5'末端的方法相比，也可以避免在化學(xué)合成中成為課題的核苷酸鏈的鏈長(zhǎng)、即核苷酸數(shù)的限制(合成收率)的問(wèn)題?；谶@些原因，該方法在需要核苷酸鏈的標(biāo)簽化、標(biāo)記化、固定化等的基因分析等中是有用的。
核苷酸鏈的主鏈(除3'末端以外的部分)中不存在修飾物質(zhì)，所以基因分析中，在修飾了的核苷酸鏈和其靶核苷酸鏈之間形成雙鏈時(shí)，也可以避免修飾物質(zhì)引起的雙鏈形成的位阻的產(chǎn)生。
如果作為目標(biāo)的核苷酸鏈?zhǔn)强苫瘜W(xué)合成的鏈長(zhǎng)為數(shù)十核苷酸的核苷酸鏈，則也可以通過(guò)預(yù)先合成具有特定的堿基序列的核苷酸鏈，從而省略第l步反應(yīng)
(核苷酸鏈(1)—核苷酸鏈(n))。
為了對(duì)核苷酸鏈進(jìn)行標(biāo)簽化、標(biāo)記化，例如如圖2所示，使在被廣泛用作修飾物質(zhì)的生物素的末端形成有氨氧基的N-氨氧基甲基羰基肼基-D-生物素(A)(以下略作氨氧基生物素)與核苷酸鏈(IV)反應(yīng)，則作為核苷酸鏈(V)，可以獲得在3'末端直接結(jié)合有生物素的核苷酸鏈。這樣進(jìn)行了生物素標(biāo)記的核苷酸鏈可以良好地用作用于雜交等基因分析的探針或靶。
為了對(duì)核苷酸鏈進(jìn)行固定化，例如如圖3所示，通過(guò)使例如8-氨基-1-辛硫醇(B)等具有氨基的硫醇與在3'末端具有醛基的核苷酸鏈(IV)反應(yīng)，從而使醛基和氨基之間發(fā)生縮合，獲得在核苷酸鏈的3'末端直接結(jié)合有8-氨基-1-辛硫醇(殘基)的修飾核苷酸鏈(V)。
接著，通過(guò)用滴加等方法使該具有巰基的核苷酸鏈(V)與金等貴金屬的基板(C)接觸，從而可以形成巰基和貴金屬的牢固的共價(jià)鍵，將核苷酸鏈(V)固定于基板(C)。通過(guò)這樣操作，可以將以貴金屬作為基板的電化學(xué)測(cè)定法、石英振子微平衡法、表面等離子體共振法等測(cè)定方法用于基因分析。
采用貴金屬等的金屬基板或形成有金屬薄膜的玻璃或塑料的支承體的情況下，可以將存在具有與金屬基板或金屬薄膜的結(jié)合性的巰基和具有與核苷酸鏈的結(jié)合性的-朋2這兩者的8-氨基-1-辛硫醇等氨基垸基硫醇用作修飾物質(zhì)。
此外，采用玻璃基板的情況下，可以將存在由水解而生成具有與玻璃的結(jié)合性的硅烷醇基的甲氧基硅烷基或乙氧基硅烷基等烷氧基硅垸基和具有與核
苷酸鏈的結(jié)合性的-NH2這兩者的Y -氨基丙基三乙氧基硅垸等硅垸偶聯(lián)化合物
用作修飾物質(zhì)。
以上，對(duì)使具有尿嘧啶堿基的dUMP加尾，然后使UDG作用而將dUMP分解的例子進(jìn)行了說(shuō)明，但也可以使用如以下的表l中所例舉的具有通過(guò)天然的核苷酸鏈中所含的腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的烷基化、脫氨基化、鹵化、羥基化或氧化等突變而生成的天然的核苷酸鏈中所不含的堿基的核苷酸(即，除2'-脫氧腺苷-5'-—磷酸、2'-脫氧胞苷-5'-—磷酸、2'-脫氧鳥(niǎo)苷-5'-—磷酸和2'-脫氧胸苷-5'-—磷酸以外的2'-脫氧核糖核苷-5'-—磷酸)。
若更具體地例舉，即上述的尿嘧啶是存在于胞嘧啶的4位的碳上的氨基發(fā)生脫氨基化而突變?yōu)轸驶玫膲A基。同樣地，存在于腺嘌呤的6位的碳上的胺發(fā)生脫氨基化而突變?yōu)轸驶玫膲A基是次黃嘌呤，腺嘌呤的3位的氮發(fā)生甲基化的突變所得的堿基是3-甲基腺嘌呤，鳥(niǎo)嘌呤的8位的碳氧化而突變?yōu)轸驶玫膲A基是8-氧鳥(niǎo)嘌呤(各堿基的符號(hào)標(biāo)注基于國(guó)際純化學(xué)和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)的基準(zhǔn))。
組合這些核苷酸的加尾和特異地作用于同一核苷酸的DNA糖苷酶或DNA修復(fù)酶，也可以在保持修飾反應(yīng)前的初始的核苷酸鏈的結(jié)構(gòu)和構(gòu)成的狀態(tài)下于核苷酸鏈的3'末端形成醛基，能夠用具有針對(duì)醛基的結(jié)合基團(tuán)(-NH2基等)的修飾物質(zhì)直接進(jìn)行修飾。[表l]
核苷酸的堿基適用的DNA糖苷酶 DNA修復(fù)酶
尿嘧啶 5-羥基尿嘧啶 5, 6-二羥基尿嘧啶 5-氟尿嘧啶 尿嘧啶DNA糖苷酶
次黃嘌呤 次黃嘌呤DNA糖苷酶
3-甲基腺嘌呤 3-乙基腺嘌呤 3-甲基腺嘌昤DNA糖苷酶I型
3-甲基腺嘌昤 次黃嘌呤 3-甲基鳥(niǎo)嘌呤 7-甲基鳥(niǎo)嘌呤 ■ 1, N6-橋亞乙基腺嘌呤 8-氧鳥(niǎo)嘌呤 7-乙基嘌呤 3-乙基嘌呤 7, 3-二乙基嘌呤 1-羧乙基腺嘌呤 7-羧乙基鳥(niǎo)嘌昤 Cf-甲基嘧啶 7-(2-乙氧基乙基)鳥(niǎo)嘌呤 7-(2-羥基乙基)鳥(niǎo)嘌呤 7-(2-氯乙基)鳥(niǎo)嘌呤 1.2-雙(7-脒基)乙烷 3-乙硫基乙基嘌呤 N2'3-橋亞乙基鳥(niǎo)嘌呤 N'''-亞乙烯基鳥(niǎo)嘌呤 5-羥甲基尿嘧啶 5-甲?；蜞奏? 1, N'-亞乙烯基胞嘧啶 ■ 1, N'-亞乙烯基鳥(niǎo)嘌呤 3, N'-亞乙烯基鳥(niǎo)嘌呤 3-甲基腺嘌呤DNA糖苷酶II型
胸腺嘧啶二醇 5, 6-二氧胸腺嘧啶 5,6-二羥基二氫胸腺嘧啶 羥基胞嘧啶 尿素 5-羥基-5-甲基乙內(nèi)酰脲 6-羥基-5, 6-二羥基嘧啶 5-羥基尿嘧啶 5-羥基-6-氨胸腺嘧啶 5, 6-二氫尿嘧啶 尿嘧啶二醇 5-羥基-6-氫尿嘧啶 核酸內(nèi)切酶m
■ 8-氧鳥(niǎo)嘌呤 .7,8-二氨-8-氧鳥(niǎo)嘌呤 8-氧腺嘌呤 甲酰氨基鳥(niǎo)嘌昤 甲基甲酰氨基鳥(niǎo)嘌昤，8-氧鳥(niǎo)嘌呤DNA糖昔酶
■ 7-甲基鳥(niǎo)嘌呤 1, 6-二氨基-5-甲酰氨基嘧啶 甲酰氨基鳥(niǎo)嘌呤 甲基甲酰氨基鳥(niǎo)嘌呤 甲酰氨基腺嘌呤 8-氧腺嘌呤 8-氧鳥(niǎo)嘌呤 .7, 8-二氫-8-氧鳥(niǎo)嘌呤 羥基胞嘧啶 5-羥基尿嘧啶 黃曲霉素結(jié)合咪唑開(kāi)環(huán)狀鳥(niǎo)嘌呤 咪唑開(kāi)環(huán)狀N-2-氨基芴-8-鳥(niǎo)嘌呤 甲酰氨基嘧啶DNA糖苷酶
8-氧鳥(niǎo)嘌呤 腺嘌呤/鳥(niǎo)嘌呤錯(cuò)配.MutY-DNA糖苷酶
1,N'-亞乙烯基胞嘧啶 尿嘧啶/鳥(niǎo)嘌呤錯(cuò)配 錯(cuò)配尿嘧啶DNA糖苷酶
嘧啶二聚體 嘧啶二聚體DNA糖苷酶
■胸腺嘧啶/鳥(niǎo)嘌呤錯(cuò)配 鳥(niǎo)嘌昤/鳥(niǎo)嘌呤錯(cuò)配 胸腺嘧啶DNA糖苷酶修飾物質(zhì)具有針對(duì)形成于核苷酸鏈的官能團(tuán)的結(jié)合基團(tuán)即可，官能團(tuán)
如上所述為醛基的情況下，可以適當(dāng)采用例如氨基(H2N-)、肼基(H2NHN-)或 氨氧基(H2NO-)等含H2N-的基團(tuán)。
作為用于標(biāo)簽化、標(biāo)記化的修飾物質(zhì)，除了上述的氨氧基生物素(維生 素)之外，還可以使用作為具有氨氧基的熒光物質(zhì)的熒光素、德克薩斯紅 (Texas Red)、若丹明、以Cy3和Cy5為代表的花青類化合物或者非熒光性的 洋地黃毒苷等。如果用熒光性物質(zhì)修飾核苷酸鏈，則對(duì)于基因分析、特別 是熒光原位雜交(FISH法)是有用的。還有，生物素為維生素的一例，洋地 黃毒苷為脂質(zhì)的一例。
氨基酸、寡肽、蛋白質(zhì)也具有氨基，因此可以使用。氨基酸中，由于 具有熒光性，可以優(yōu)選使用苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。不具有熒光性的 氨基酸和肽等也可以通過(guò)使熒光素等(以下稱為標(biāo)記化合物)結(jié)合于側(cè)鏈來(lái) 使用。
肽存在對(duì)應(yīng)于構(gòu)成其的氨基酸的數(shù)量的側(cè)鏈，因此可以使多個(gè)標(biāo)記化 合物結(jié)合。例如，3個(gè)賴氨酸連接而成的三聚賴氨酸在側(cè)鏈中存在3個(gè)氨基， 因此可以任意地修飾共計(jì)3個(gè)具有羧基、琥珀酰亞胺基等的標(biāo)記化合物。
作為蛋白質(zhì)，例如可以使用堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶或具有有色性、 熒光性的藻紅蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、血紅蛋白、綠色熒光蛋白、藍(lán)色熒光蛋白、 水母發(fā)光蛋白等。
并不局限于肽(包括蛋白質(zhì))，也可以將具有氨基的烷基、烯丙基、環(huán) 烷烴、芳香族、糖類等烴類用標(biāo)記化合物修飾而得的物質(zhì)用作修飾物質(zhì)來(lái) 修飾核苷酸鏈。
除此之外，在表面形成有氨基的金膠體、銀膠體等貴金屬膠體或者以 磁性微粒、聚苯乙烯珠等高分子微粒為代表的微粒等生物體外源性物質(zhì)也 可以用作核苷酸鏈的修飾物質(zhì)。
用于結(jié)合到基板上的修飾物質(zhì)只要具有針對(duì)形成于核苷酸鏈的官能團(tuán) 的結(jié)合基團(tuán)和針對(duì)基板的結(jié)合基團(tuán)即可，例如若是具有氨基和巰基的化合 物，則可以無(wú)特別限定地進(jìn)行使用。上述的氨基垸基硫醇是其具體例子。 氨基和巰基間的烴殘基可以是直鏈狀、分支狀、環(huán)狀、烯丙基鏈狀、芳香環(huán)狀等各種形態(tài)，其碳數(shù)、氨基的位置等可以改變。
基板在石英振子微平衡法和表面等離子體共振法等中廣泛采用金基板， 但并不局限于此，除金之外，還可以使用鉑、銀等貴金屬或銅、鈀、銦、鎳、 鐵、鋁及它們的合金等。
作為修飾物質(zhì)，可以使用具有氨基的硅垸偶聯(lián)化合物，通過(guò)它可以將核苷 酸鏈固定于玻璃、硅、二氧化硅、氧化鋁、云母以及聚苯乙烯、尼龍、環(huán)氧樹(shù) 脂等高分子樹(shù)脂等的基板上，也可以適用于以往的各種基因分析方法。
硅烷偶聯(lián)化合物只要是具有氨基和垸氧基硅垸基(例如甲氧基硅烷基、乙 氧基硅烷基等)的化合物，即可與烷基硫醇同樣，在對(duì)結(jié)構(gòu)等沒(méi)有特別限定的 情況下使用?？墒褂玫墓柰榕悸?lián)化合物例如有Y-氨基丙基三乙氧基硅垸、N-0 -慮基乙基)-Y -氨基丙基甲基二甲氧基硅烷、N- P -(氨基乙基)-Y -氨基丙 基三甲氧基硅烷、N-e-復(fù)基乙基)-Y-氨基丙基三乙氧基硅烷、氨基丙基 三甲氧基硅垸等。
本來(lái)不具有氨基、氨氧基或肼基的物質(zhì)通過(guò)介以具有這些結(jié)合基團(tuán)的合適 的間隔基團(tuán)(spacer),也可以修飾核苷酸鏈。例如，具有羧基的物質(zhì)通過(guò)介以 1，2-二氨基乙垸、1，6-二氨基己垸等具有二氨基結(jié)構(gòu)的物質(zhì)作為間隔基團(tuán)，可 以修飾核苷酸鏈。另外，具有氰基的物質(zhì)或者像格利雅(Grignard)試劑那樣具
有齒化鎂的物質(zhì)也可以用作修飾物質(zhì)。
以下，例舉具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。
.(實(shí)施例l)
作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈采用核苷酸數(shù)25的單鏈化學(xué)合成寡聚脫氧核苷 酸(委托日本西格瑪奧德里奇公司進(jìn)行合成)。該核苷酸鏈的堿基序列自5'末端 起為CTTATGATTTTTGTGTGAACCTCCC，是與人骨骼肌肌球蛋白重鏈1的DNA堿基序 列5786 5810位(美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心的GenBank，因特網(wǎng)網(wǎng)站(http:〃 爾.ncbi.nlm. nih.gov/Genbank/index. html)，登錄號(hào)NM—005963， 2004年2 月至今)的序列互補(bǔ)的堿基序列。A、 G、 T、 C分別表示腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺 嘧啶、胞嘧啶。
將2. 5uM上述的核苷酸鏈、lu(單位)/ul TdT(法門(mén)塔斯公司(Fermentas 社)制)、0.2u/ixl UDG(紐英倫生物技術(shù)公司(New England BioLabs社)制)、lmM dUTP、 2mM氯化鎂(各自的最終濃度)混合于50mM 4-(2-羥基乙基)哌嗪-l-乙磺酸-氫氧化鉀緩沖液(pH7. 2)中(總量50y 1)，在37t:使其反應(yīng)2小時(shí)， 在10(TC進(jìn)行15分鐘的加熱處理。接著，添加氨氧基生物素(株式會(huì)社同仁 化學(xué)研究所(同仁化學(xué)研究所)制)至2mM，將該反應(yīng)混合液稀釋至作為修飾 對(duì)象的核苷酸鏈達(dá)到2uM后，在37'C使其反應(yīng)1小時(shí)。氯化鎂是由于需要2 價(jià)金屬陽(yáng)離子作為T(mén)dT的活化因子而添加的。
通過(guò)7M尿素-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(《分子克隆(第2版)》11.23頁(yè)1989 年)追蹤該核苷酸修飾過(guò)程。采用含7^尿素和5%甘油的15%聚丙烯酰胺，緩沖 液采用89mM Tris-硼酸、2mM乙二胺四乙酸鈉。核苷酸鏈的檢測(cè)通過(guò)SYBR Gold(英杰公司(Invitrogen社)帝i」)染色實(shí)施。結(jié)果示于圖4。
泳道l表示分子量標(biāo)記(普洛麥格公司(Pr咖ega社)制)的電泳圖案，泳道2 表示未處理的核苷酸鏈的電泳圖案，泳道3表示在37'C反應(yīng)2小時(shí)后的核苷酸鏈 的電泳圖案，泳道4表示在10(TC進(jìn)行15分鐘的加熱處理后的核苷酸鏈的電泳圖 案，泳道5表示用生物素進(jìn)行修飾處理后的核苷酸鏈的電泳圖案。
泳道l的分子量標(biāo)記包含10nt 100nt (以10nt為間隔，10nt表示核苷酸數(shù) IO)的核苷酸鏈，圖中的箭頭分別表示100nt、 80nt、 50nt、 30nt、 20nt和10nt 的電泳遷移位置。泳道2中所示的未處理的核苷酸鏈為25nt。
泳道3中，核苷酸鏈為27 30nt左右。這表示通過(guò)使TdT和UDG共存于反應(yīng) 混合液中，依次進(jìn)行了dUMP向核苷酸鏈的加尾反應(yīng)和所加尾的dUMP的分解反 應(yīng)。
泳道4中，核苷酸鏈長(zhǎng)恢復(fù)到25nt。這表示被UDG分解了的dUMP通過(guò)加熱處 理而離解。
泳道5中，與泳道2和泳道4的核苷酸鏈相比，核苷酸鏈的遷移率變慢。該 結(jié)果被解釋為因?yàn)橛蒙锼刂苯有揎椇塑账徭湹?'末端時(shí)電泳的遷移率變慢 (Chollet A.等，Nucleic Acids Res. 13巻1529頁(yè)1985年等)，所以表示核 苷酸鏈被用生物素修飾。這是因?yàn)榘殡SdUMP的離解，在核苷酸鏈的3'末端形成 醛基，該醛基和氨氧基反應(yīng)，不需要特別的催化劑，自發(fā)地進(jìn)行交聯(lián)結(jié)合反應(yīng)， 在作為-NH2的一種的氨氧基和醛基之間形成席夫堿，從而核苷酸鏈的3'末端被 直接用生物素修飾。以上的實(shí)施例l中所示的核苷酸鏈的堿基序列的構(gòu)成、鏈長(zhǎng)、修飾物質(zhì) 的種類、反應(yīng)條件、反應(yīng)組成(緩沖液等)僅僅是本發(fā)明的示例，并不局限 于這些例子，可以任意地進(jìn)行改變。
(比較例l)
將2. 5 ti M (最終濃度，下同)核苷酸鏈、W P 1 TdT、 0. 2u/ u 1 UDG、 lmM dUTP 混合的操作與實(shí)施例l相同，但預(yù)先添加l慮氨氧基生物素，TdT的活化因子采 用2raM氯化鈷，在O. 1M二甲胂酸鉀緩沖液(pH7.2)的緩沖下于37。C保持30分鐘。
與實(shí)施例1同樣地通過(guò)7M尿素-聚丙烯酰胺凝膠電泳法追蹤該核苷酸修飾 過(guò)程。結(jié)果示于圖5。
泳道l為與實(shí)施例l相同的分子量標(biāo)記，標(biāo)記于泳道l旁的箭頭分別表示 100nt、 50nt、 30nt、 20nt和10nt的電泳遷移位置。
泳道2表示未處理的核苷酸鏈，泳道3表示實(shí)施了修飾處理的核苷酸鏈。
泳道2和泳道3中所示的核苷酸鏈間未發(fā)現(xiàn)電泳遷移率的差異。這表示泳道 3的核苷酸鏈沒(méi)有被用生物素修飾，即未發(fā)生TdT的加尾反應(yīng)。
接著，在不加入核苷酸鏈、附加的核苷酸、酶的情況下，采用氨氧基生物 素作為修飾物質(zhì)，考察與活化因子和緩沖液的組合是否合適。結(jié)果示于以下的 表2。
與氨氧基生物素的不溶性配合物形成
氯化鈷氯化鎂氯化錳
(+)(-)(-)
(+):有沉淀 (-):無(wú)沉淀
作為緩沖液，采用上述的二甲胂酸鉀時(shí)和采用實(shí)施例1中使用的4-(2-羥 基乙基)哌嗪-1-乙磺酸-氫氧化鉀等時(shí)，作為活化因子，即使使氯化鎂或氯 化錳和氨氧基生物素共存，也都不會(huì)沉淀，若與氯化鈷共存，則都產(chǎn)生褐 色的沉淀。這被認(rèn)為是因?yàn)殁掚x子和氨氧基生物素的氨基反應(yīng)，形成不溶 性的配合物。
該結(jié)果意味著，采用鈷離子作為活化因子的情況下，在核苷酸鏈的3'末端形成醛基等官能團(tuán)后，必須將該核苷酸鏈通過(guò)乙醇沉淀或其它方法與 鈷離子分離，難以立即進(jìn)行基于修飾物質(zhì)的修飾反應(yīng)。
與之相對(duì)，采用鎂離子或錳離子的情況下，不會(huì)因與具有-NH2的修飾 物質(zhì)反應(yīng)而產(chǎn)生不溶性的沉淀物。因此，在核苷酸鏈的3'末端形成醛基等官 能團(tuán)后，可以不進(jìn)行采用乙醇沉淀等的核苷酸鏈的回收操作或者采用凝膠過(guò)濾 等的反應(yīng)混合液組成的置換操作，在該同一反應(yīng)混合液中混合修飾物質(zhì)來(lái)立即 進(jìn)行修飾反應(yīng)。
(比較例2)
除了使用以下所示的含活化因子的各種緩沖液(總量50u l)以外，與實(shí)施 例l同樣地進(jìn)行操作，使dUMP加尾于核苷酸鏈上。
緩沖液l:含2mM氯化鎂的50mM 4- (2_羥基乙基)哌嗪-卜乙磺酸-氫氧化鉀 緩沖液(pH7， 2)(以下稱為含鎂磺酸緩沖液)
緩沖液2:含2mM氯化錳的50mM 4-(2-羥基乙基)哌嗪-1-乙磺酸-氫氧化鉀 緩沖液(pH7.2)(以下稱為含錳磺酸緩沖液)
緩沖液3:含2raM氯化鈷的0. 1M二甲胂酸鉀緩沖液(pH7. 2)(以下稱為含鈷 二甲胂酸鉀緩沖液)
與實(shí)施例l同樣地通過(guò)7M尿素-聚丙烯酰胺凝膠電泳法追蹤采用各緩沖液 的反應(yīng)混合液的30分鐘間隔的經(jīng)時(shí)變化(30分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘)。 結(jié)果示于圖6。
泳道l為與實(shí)施例l相同的分子量標(biāo)記，標(biāo)記于泳道l旁的箭頭分別表示 100nt、 50nt、 30nt、 20nt和10nt的電泳遷移位置。泳道2表示未處理的核苷酸 鏈。
泳道3 6分別表示采用含鎂磺酸緩沖液時(shí)的核苷酸鏈的經(jīng)時(shí)變化(30分 鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘)；泳道7 10分別表示采用含錳磺酸緩沖液時(shí) 的核苷酸鏈的經(jīng)時(shí)變化(30分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘)；泳道11 14分 別表示采用含鈷二甲胂酸鉀緩沖液時(shí)的核苷酸鏈的經(jīng)時(shí)變化(30分鐘、60分 鐘、90分鐘、120分鐘)。
如圖6所示，dUMP的加尾反應(yīng)效率在采用含鈷二甲胂酸鉀緩沖液時(shí)最高， 采用含錳磺酸緩沖液時(shí)次之，采用含鎂磺酸緩沖液時(shí)最低。 一直以來(lái)，在TdT的反應(yīng)中鈷離子-二甲胂酸緩沖液的組合顯示出最高的反應(yīng)活性(例如， Bollum F. J.著《酶(The Enzymes)》IO巻145頁(yè)1974年學(xué)術(shù)出版社 (Academic Press))，結(jié)果與之一致。
但是，如果是像本發(fā)明方法這樣以在核苷酸鏈的3'末端形成醛基等官能團(tuán) 為目的，反而理想的是TdT的反應(yīng)效率低的方法，因?yàn)橛糜谧鳛楹罄m(xù)反應(yīng)的采 用UDG的分解反應(yīng)的底物量減少。這是為了防止過(guò)度附加如dUMP等核苷酸，使
分解所附加的核苷酸的后續(xù)反應(yīng)變得容易進(jìn)行。
因此，從TdT的反應(yīng)效率、鈷離子是使修飾物質(zhì)沉淀的主要原因以及二 甲胂酸本身是砷化合物的角度來(lái)看，理想的是避免鈷離子-二甲胂酸緩沖液 的組合。
因此，使用TdT作為對(duì)附加反應(yīng)進(jìn)行催化的酶的情況下，其活化因子理 想的是使用例如錳離子或鎂離子等除鈷以外的2價(jià)金屬陽(yáng)離子，藉此可以防 止修飾物質(zhì)的沉淀。此外，理想的是使用例如4-(2-羥基乙基)哌嗪-1-乙磺 酸等使TdT的反應(yīng)活性溫和的緩沖劑成分?？梢允褂?-嗎啉代乙磺酸等好的 緩沖劑或3， 3-二甲基戊二酸等。
這些緩沖劑由于在其化學(xué)結(jié)構(gòu)中不具有氨基，因此可以避免由被廣泛 用作緩沖劑的如2-氨基-2-羥甲基-l,3-丙二醇(通稱Tris)等具有-NH2的緩
沖劑產(chǎn)生的修飾反應(yīng)的阻礙。
以上的實(shí)施例中，以d畫(huà)P的加尾反應(yīng)為例，示例了對(duì)于TdT的酶活化能
力并不太好的活化因子和使反應(yīng)溫和地進(jìn)行的緩沖液成分的組合，但本發(fā) 明中所用的緩沖液成分和TdT活化因子的組合并不局限于此。在具有表l所 示的堿基的2'-脫氧核苷-5'-—磷酸的加尾反應(yīng)中，可以適當(dāng)采用加尾反應(yīng) 溫和地進(jìn)行的緩沖液成分和除鈷離子以外的TdT活化因子的組合。
此外，通過(guò)化學(xué)合成或復(fù)制反應(yīng)所獲得的核苷酸鏈有時(shí)在其序列中形 成天然的核苷酸中所不存在的具有表l所示的堿基的核苷酸。例如，核苷酸 鏈的復(fù)制反應(yīng)中在該核苷酸鏈的堿基序列中存在大量鳥(niǎo)嘌呤或胞嘧啶的情 況下，通過(guò)復(fù)制反應(yīng)引入具有鳥(niǎo)嘌呤的核苷酸成為復(fù)制效率下降的主要原 因，因此利用具有次黃嘌呤來(lái)代替鳥(niǎo)嘌呤的核苷酸(例如，Nucleic Acids Res. 21巻4427頁(yè)1993年)。這樣通過(guò)復(fù)制反應(yīng)所獲得的核苷酸鏈在其序列中存在次黃嘌吟，如果通過(guò)本發(fā)明的核苷酸鏈的修飾方法加尾示例的具有次黃 嘌呤的核苷酸，則作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈也通過(guò)后續(xù)的分解反應(yīng)被分解。 這樣的情況下，適當(dāng)選擇具有除次黃嘌呤以外的堿基的核苷酸來(lái)進(jìn)行加尾
反應(yīng)即可。用于后續(xù)的分解反應(yīng)的DNA糖苷酶或DNA修復(fù)酶對(duì)具有作為其底 物的堿基的核苷酸具有特異性，因此可以避免作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈的 分解。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性
本發(fā)明的核苷酸鏈的修飾方法可以在不受限于核苷酸鏈的鏈長(zhǎng)且保持 核苷酸鏈原來(lái)的狀態(tài)的情況下，用任意的修飾物質(zhì)定量、穩(wěn)定且簡(jiǎn)便地在 短時(shí)間內(nèi)修飾作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈的3'末端，所以在需要核苷酸鏈的標(biāo) 簽化、標(biāo)記化、固定化等的基因分析等中是有用的。
權(quán)利要求
1. 核苷酸鏈的修飾方法，其特征在于，在將作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈和具有與構(gòu)成所述核苷酸鏈的堿基不同的特定堿基的核苷酸加入到緩沖液而得的反應(yīng)混合液中，使對(duì)所述核苷酸向所述核苷酸鏈的3′末端的附加進(jìn)行催化的酶、特異地作用于所述核苷酸的分解酶和修飾所述核苷酸鏈的所需的修飾物質(zhì)共存，在將所述核苷酸附加到所述核苷酸鏈的3′末端的同時(shí)，分解所附加的核苷酸的序列而在所述核苷酸鏈的3′末端形成對(duì)于所述修飾物質(zhì)具有結(jié)合能力的官能團(tuán)，用所述修飾物質(zhì)直接對(duì)形成有所述官能團(tuán)的核苷酸鏈的3′末端進(jìn)行修飾。
2. 如權(quán)利要求l所述的核苷酸鏈的修飾方法，其特征在于，作為活化 對(duì)附加反應(yīng)進(jìn)行催化的酶的活化因子，添加不阻礙修飾物質(zhì)的修飾反應(yīng)的 活化因子。
3. 如權(quán)利要求l所述的核苷酸鏈的修飾方法，其特征在于，使反應(yīng)混 合液中包含使對(duì)附加反應(yīng)進(jìn)行催化的酶的反應(yīng)活性溫和的緩沖劑成分。
4. 如權(quán)利要求2所述的核苷酸鏈的修飾方法，其特征在于，對(duì)附加反應(yīng)進(jìn)行催化的酶為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶時(shí)，活化因子使用除鈷離子以外 的2價(jià)金屬陽(yáng)離子。
5. 如權(quán)利要求4所述的核苷酸鏈的修飾方法，其特征在于，活化因子 是錳離子或鎂離子。
6. 如權(quán)利要求3所述的核苷酸鏈的修飾方法，其特征在于，對(duì)附加反 應(yīng)進(jìn)行催化的酶為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶時(shí)，作為緩沖劑成分，使用4-(2-羥基乙基)哌嗪-l-乙磺酸、2-嗎啉代乙磺酸或3，3-二甲基戊二酸。
7. 如權(quán)利要求l所述的核苷酸鏈的修飾方法，其特征在于，附加的核 苷酸的特定堿基是腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶經(jīng)烷基化、脫氨基 化、鹵化、羥基化或氧化而得的突變堿基。
8. 如權(quán)利要求l所述的核苷酸鏈的修飾方法，其特征在于，分解酶是 DNA糖苷酶或DNA修復(fù)酶，由此形成的官能團(tuán)是醛基。
9. 如權(quán)利要求7所述的核苷酸鏈的修飾方法，其特征在于，附加的核苷酸為2'-脫氧尿苷-5'-—磷酸時(shí)，分解酶使用尿嘧啶DNA糖苷酶。
10. 如權(quán)利要求l所述的核苷酸鏈的修飾方法，其特征在于，修飾物質(zhì) 具有-麗2。
11. 如權(quán)利要求1或9中的任一項(xiàng)所述的核苷酸鏈的修飾方法，其特征 在于，修飾物質(zhì)是對(duì)核苷酸鏈進(jìn)行標(biāo)簽化、標(biāo)記化的物質(zhì)。
12. 如權(quán)利要求10所述的核苷酸鏈的修飾方法，其特征在于，修飾物 質(zhì)是熒光性物質(zhì)、維生素、脂質(zhì)、氨基酸、寡肽、蛋白質(zhì)或生物體外源性 物質(zhì)。
13. 如權(quán)利要求1或9中的任一項(xiàng)所述的核苷酸鏈的修飾方法，其特征 在于，修飾物質(zhì)是為了使核苷酸鏈結(jié)合于基板而介于其間的物質(zhì)。
14. 如權(quán)利要求12所述的核苷酸鏈的修飾方法，其特征在于，修飾物 質(zhì)是具有氨基和巰基的化合物。
15. 如權(quán)利要求13所述的核苷酸鏈的修飾方法，其特征在于，修飾物 質(zhì)是具有氨基和通過(guò)水解而形成硅烷醇基的垸氧基硅垸基的化合物。
16. 如權(quán)利要求l所述的核苷酸鏈的修飾方法，其特征在于，混合具有 任意的堿基序列的核苷酸鏈、具有特定堿基的核苷酸、對(duì)所述核苷酸向所 述核苷酸鏈的3'末端的附加反應(yīng)進(jìn)行催化的酶、作為作用于所述核苷酸的 DNA糖苷酶或DNA修復(fù)酶的分解酶、以及對(duì)于通過(guò)以所述酶所附加的核苷酸 被所述分解酶分解而形成于所述核苷酸鏈的3'末端的醛基具有結(jié)合能力的 修飾物質(zhì)。
17. 如權(quán)利要求l所述的核苷酸鏈的修飾方法，其特征在于，在加入有 具有任意的堿基序列的核苷酸鏈的緩沖液中混合2'-脫氧尿苷-5'-三磷酸、 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶及其活化因子和尿嘧啶DNA糖苷酶，對(duì)該反應(yīng)混合液 進(jìn)行加熱處理或堿處理后，在該經(jīng)過(guò)處理的反應(yīng)混合液中混合具有H2N-的修 飾物質(zhì)。
全文摘要
在將作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈和具有與構(gòu)成所述核苷酸鏈的堿基不同的特定堿基的核苷酸加入到緩沖液而得的混合液中，使對(duì)所述核苷酸向所述核苷酸鏈的3′末端的附加進(jìn)行催化的酶、特異地作用于所述核苷酸的分解酶和修飾所述核苷酸鏈的所需的修飾物質(zhì)共存，在將所述核苷酸附加到所述核苷酸鏈的3′末端的同時(shí)，分解所附加的核苷酸的序列而在所述核苷酸鏈的3′末端形成對(duì)于所述修飾物質(zhì)具有結(jié)合能力的官能團(tuán)，用所述修飾物質(zhì)直接對(duì)形成有所述官能團(tuán)的核苷酸鏈的3′末端進(jìn)行修飾。在混合液中使3步反應(yīng)連續(xù)地進(jìn)行，可以實(shí)現(xiàn)操作的簡(jiǎn)便化、短時(shí)間化。
文檔編號(hào)C12N15/00GK101460619SQ20078002008
公開(kāi)日2009年6月17日 申請(qǐng)日期2007年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月6日
發(fā)明者上甲茂樹(shù) 申請(qǐng)人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社