專利名稱：對微陣列上的核酸進行解鏈曲線分析的方法和裝置的制作方法
對微陣列上的核酸進行解鏈曲線分析的方法和裝置相關申請的交叉引用本申請要求美國臨時申請的優(yōu)先權，該美國臨時申請的申請日為2008年6月25 日，申請?zhí)枮?1/075，528，在此以引用的方式將其全部內(nèi)容并入本申請中。
背景技術：
在此說明對微陣列上的核酸進行解鏈曲線分析的方法和裝置。微陣列技術于20世紀80年代末期和20世紀90年代早期從核酸雜交檢測發(fā)展而 來，如Southern雜交和Northern雜交。該微陣列技術本質(zhì)上是結合于陣列表面上的多種 不同的核酸序列探針與多種不同的靶DNA序列進行的高通量競爭性雜交。雖然，該技術應 用廣泛，但是最普遍的應用為基因表達譜和單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析。在基因表達分析 中，mRNA從細胞中抽提出來，轉(zhuǎn)錄成cDNA，同時用熒光染料進行染色標記，然后與含有互補 序列的探針的陣列芯片進行雜交。干燥后用陣列閱讀儀進行掃描，并通過軟件計算基因表 達差異。在該操作程序中，基因表達水平越高，熒光標記的靶DNA與探針結合越多，熒光信 號就越強。在SNP分析中，cDNA的合成可以省略因為基因組DNA可從細胞中抽提出來，限制 性內(nèi)切酶酶切后與芯片(固載)雜交。在SNP分析中，該陣列針對每個SNP設置至少4個 探針，在預期的SNP位點設置一個不同的堿基。SNP分析中陣列閱讀方法和基因表達譜分析 是相同的，但是還可以觀察到所有探針的一些結合，以及通過判斷DNA結合最多的探針來 確定正確SNP。微陣列技術允許高樣品通量。但是，相對于高準確度的低通量技術，已知的微陣 列技術具有準確度低和重復性差的缺陷。與所有其它的核酸競爭性結合測定一樣，已知的 微陣列技術具有靶DNA與錯誤探針結合的傾向，即所謂的錯交或者錯配。雖然對于給定的 序列，選擇最佳雜交溫度可以減少錯配。但是，由于陣列系統(tǒng)可能在一陣列上帶有幾千個不 同的探針序列，所以實際上不可能同時優(yōu)化出所有探針的最佳雜交溫度，而只能針對所有 的探針計算出一個平均雜交溫度；然而，即使是在最佳條件下進行雜交也仍然會出現(xiàn)錯配。 可以確定的是，這種錯配傾向，和探針選擇缺少標準化一樣，是微陣列分析中誤差的主要來 源。雖然微陣列技術已經(jīng)獲得了許多有價值的成果，但是標準應用需要采用具有較高 準確度和成本較高的方法，如實時聚合酶鏈式反應(PCR)，對結果進行有效性驗證。對于基 因表達實驗，單一基因表達倍數(shù)差異在微陣列分析結果和實時PCR驗證結果之間可能具有 高達幾倍的差別。改進微陣列分析應該直接解決錯配問題。高準確度、低通量技術如實時PCR，它更 準確的原因在于對PCR引物進行溫度可控的雜交。因此只有引物與模板正確雜交，雙鏈產(chǎn) 物才能生成。那么在典型的實時PCR實驗期間，就可以通過觀察PCR產(chǎn)品的解鏈曲線來檢 查PCR反應的質(zhì)量。解鏈曲線分析是利用熱能斷開使雙鏈核酸(通常為DNA)結合在一起的氫鍵，使 該雙鏈結構熔解(“解鏈”)形成二條單鏈產(chǎn)物。DNA解鏈所需的熱量取決于其長度、胞嘧啶-鳥嘌呤(C-G)含量和雙鏈結構的互補程度。事實上，特定染料如STOR Green I可用于 監(jiān)測解鏈發(fā)生的精確溫度。內(nèi)插在雙鏈DNA之間的STOR Green I與溶液中游離狀態(tài)分子 相比，熒光強度高出1000多倍。因此，隨著溫度的升高，熒光大幅度降低表明雙鏈DNA正在 解鏈，并通?？梢岳L制熒光強度與溫度之間的關系曲線。如果在實時PCR反應期間發(fā)生錯 配，具有不同解鏈溫度的第二種PCR產(chǎn)品的出現(xiàn)將是明顯的，這表明反應中出現(xiàn)了錯誤，實 驗必須在更好的條件下重復進行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及對微陣列上的核酸進行解鏈曲線分析的方法和裝置。本發(fā)明的方法包 括提供一微陣列，該微陣列表面共價鍵結合多個核酸探針，其中，該微陣列由一蓋片覆蓋； 將溫度可控的流體引入由該微陣列和蓋片之間形成的樣品腔中；在與靶DNA的解鏈溫度相 對應的溫度范圍內(nèi)改變流體的溫度，使靶DNA從該微陣列中相繼地流出；掃描該微陣列，采 集熒光；收集從該微陣列中流出的靶DNA ；以及，重復使用該微陣列和收集到的靶DNA。采用先進的熒光分析技術，如熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、熒光壽命成像(FLIM)和 熒光相對光譜(FCS)，可以進一步減少噪聲。另外，原始數(shù)據(jù)進行歸一化可以通過在不同溫 度下重復掃描改善探測器增益背景，以消除光漂白作用的影響。本發(fā)明的裝置包括一微陣列工作臺，一光源和探測器，以及一溫度控制器。該溫度 控制器用于調(diào)整微陣列樣品腔中的流體的溫度，使該流體的溫度在分析期間發(fā)生變化，從 而使靶DNA與該微陣列分離。該光源照射至該微陣列上激發(fā)出的熒光，可由該探測器采集。本發(fā)明的一個方面利用一光束激發(fā)微陣列的預定部位和探測所發(fā)出熒光，提供對 位于該微陣列上的核酸進行解鏈曲線分析的裝置。該種裝置包括一照明子系統(tǒng)，其包括一 能產(chǎn)生光束的光源，該光束包括具有至少一種波長的電磁輻射波；該照明子系統(tǒng)還包括一 帶通濾光片，用于濾除波長接近核酸受激發(fā)所發(fā)出的熒光波長的光；一掃描鏡，使該光束發(fā) 生反射而允許熒光通過；以及一物鏡，使該光束聚焦至該微陣列的預定部位。該裝置還包括 一檢測由該微陣列的預定部位發(fā)出的熒光的熒光探測子系統(tǒng)。該裝置還包括一流體循環(huán)子 系統(tǒng)，其包括一微陣列盒，該微陣列盒包括一具有用于容置微陣列載體的開口的框架，該開 口圍繞其內(nèi)部邊緣設置一間隔物。該流體循環(huán)子系統(tǒng)還包括一流體入口、一流體出口、一設 置于框架上的光學窗口和一設置于框架上的與該光學窗口相對的密封件。在該微陣列載體 容置于該開口中時，間隔物將微陣列載體與光學窗口隔開，并形成一空腔，該空腔定義為一 允許流體從流體入口進入微陣列載體中，在流體全面流經(jīng)微陣列載體后到達流體出口處的 微陣列腔。該流體循環(huán)子系統(tǒng)還包括一泵，該泵從流體池中抽出流體，并使流體流入與該流 體入口連接的流體供應管中，該流體返回管與該流體出口連接。該裝置還包括一溫度控制 套件，其包括一溫度控制器和一流體加熱器。本發(fā)明的裝置允許光束和微陣列之間可以相 對移動。本發(fā)明的另一個方面是在裝置中提供一進行核酸解鏈曲線分析的微陣列盒。該微 陣列盒包括一框架，該框架具有一包括一內(nèi)部邊緣的用于容置一微陣列載體的開口，該開 口圍繞其內(nèi)部邊緣設有間隔物。該微陣列盒還包括一設置于框架上、并位于該開口一側的 光學窗口，一流體入口，一流體出口 ；以及一設置于框架上的與該光學窗口相對的密封件。 該間隔物設置為，在該微陣列載體容置于開口中時，通過間隔物將微陣列載體與光學窗口隔開，使二者之間形成一定義為微陣列腔的空腔。該微陣列腔設置為經(jīng)流體入口引入流體， 使該流體全面流經(jīng)微陣列載體后經(jīng)流體出口從微陣列腔中排出。本發(fā)明的該微陣列盒還包 括一用于加熱該微陣列的熱控體，該熱控體包括一用于容置一微陣列的底座；一與該底座 樞接的熱控部件，使該熱控部件可在打開位置和關閉位置間轉(zhuǎn)動；以及，一連接于該熱控部 件上的加熱器。本發(fā)明的第三個方面是提供一種利用一光束激發(fā)微陣列的預定部位和探測所發(fā) 出熒光的方法對位于該微陣列上的核酸進行解鏈曲線分析的裝置。該裝置包括一照明子系 統(tǒng)，其包括一產(chǎn)生該光束的光源，該光束包括具有至少一種波長的電磁輻射波。該裝置還包 括一檢測由該微陣列的預定部位發(fā)出的熒光的熒光探測子系統(tǒng)。該裝置還包括一流體循環(huán) 子系統(tǒng)，其包括一帶有一微陣列腔的微陣列盒，該微陣列盒包括一流體入口和一流體出口。 該流體循環(huán)子系統(tǒng)還包括一泵，該泵從流體池中抽出流體，并使流體流入與該流體入口連 接的流體供應管中。該流體循環(huán)子系統(tǒng)還包括一與該流體出口連接的流體返回管，以及一 溫度控制套件，該溫度控制套件包括一用于調(diào)整流體循環(huán)子系統(tǒng)中流體的溫度的溫度控制 器。該裝置還包括一微陣列定位件，其包括一可移動地連接于一基座上的用于容納該微陣 列盒的基架，一連接于該基座上的沿著第一軸方向移動該基架的第一基架定位件，以及一 連接于該基座上的沿著與第一軸基本垂直的第二軸方向移動該基架的第二基架定位件。本發(fā)明的第四個方面是提供一種通過微陣列閱讀儀對位于微陣列載體上的核酸 進行解鏈曲線分析的方法。該方法包括如下步驟初始化該微陣列閱讀儀；初始化該微陣 列載體；獲取數(shù)據(jù)；處理數(shù)據(jù)；以及，分析數(shù)據(jù)。該初始化該微陣列閱讀儀的步驟還包括如 下步驟對該微陣列閱讀儀中的掃描頭進行調(diào)焦；進行預覽掃描；以及，確定掃描部位。該 獲取數(shù)據(jù)的步驟進一步包括如下步驟將該微陣列載體加熱至預定溫度；控制該微陣列在 該預定溫度上保持預定時間；用預定體積的流體沖洗該微陣列載體；以及，對該微陣列載 體進行掃描。在此，可通過被加熱流體的連續(xù)流動對該微陣列載體進行加熱，沖洗期間該被 加熱流體的流速是不斷增加的，溫度是不斷升高的，以提高該微陣列的溫度?？稍诙鄠€升高 的溫度上重復進行這些步驟。該處理數(shù)據(jù)的步驟進一步包括如下步驟打開一首次掃描的 數(shù)據(jù)文件；打開一通用特征列表文件；使該通用特征列表與首次掃描數(shù)據(jù)文件的相應部分 對準；界定微陣列載體上的每個微陣列點的唯一特征形狀；以及，保存該定制的特征列表 文件。該分析數(shù)據(jù)的步驟進一步包括如下步驟打開一定制的特征列表文件；創(chuàng)建一綜合 結果文件；打開一掃描的圖像文件；使該通用特征列表與掃描的圖像的相應部分對準；檢 測每個特征的強度；創(chuàng)建一保存特征數(shù)據(jù)的文件；對特征強度值進行歸一化；以及，保存該 綜合結果。對特征強度值進行歸一化的步驟進一步包括如下步驟為微陣列載體上的每個 探針點設定一定制特征的初始標線；以及，基于該初始的標線比較每個特征的強度。


本發(fā)明將參考實施方式僅作為非限制性實例的附圖進行描述，其中圖1示出了根據(jù)本發(fā)明第一種實施方式的微陣列分析裝置和系統(tǒng)，其中的熱控部 件用于對循環(huán)流體進行預加熱和控制該微陣列的溫度；圖2示出了用于一將循環(huán)流體輸送至微陣列中和控制該微陣列溫度的微陣列腔；圖3為圖9所示微陣列載體和腔的橫截面示意圖4示出了熱控子系統(tǒng)和緩沖液輸送子系統(tǒng)的透視圖，圖中，微陣列腔處于打開 狀態(tài)；圖5為微陣列腔處于關閉狀態(tài)的頂部透視圖，圖中還示出循環(huán)流體預加熱子系 統(tǒng)；圖6A和6B為根據(jù)對微陣列上二個探針點進行解鏈曲線分析所獲得的相對熒光值 繪制的曲線；圖7示出了根據(jù)本發(fā)明第二種實施方式的包括可提高探測靈敏度的熒光相關光 譜的實時陣列裝置和系統(tǒng)；圖8示出了根據(jù)本發(fā)明第三種實施方式的具有循環(huán)緩沖液的實時陣列裝置和系 統(tǒng)；圖9示出了采用增益熒光強度歸一法的解鏈曲線圖；圖IOA至IOD為示出本發(fā)明的裝置和系統(tǒng)的操作步驟的流程圖。
具體實施例方式盡管以下將參照僅示出特定實施例的附圖詳細說明本發(fā)明的具體實施方式
，但是 一開始必須清楚的是，本領域的技術人員通過對在此公開的技術方案進行改動仍可獲得本 發(fā)明所希望的技術效果。相應地，以下說明的內(nèi)容應包括相應領域的技術人員根據(jù)本發(fā)明 公開的內(nèi)容可以直接獲知的大量信息，而并非僅局限于在此公開的內(nèi)容。本發(fā)明盡管不能完全阻止微陣列上的錯配，但可以利用解鏈曲線對結果進行雙重 校核，以發(fā)現(xiàn)錯配和確定錯配的數(shù)量。在該方法中，每個基因或者表達序列標簽(EST)均具 有一個探針，該探針利用多種應用軟件設計為在預定的溫度(例如65°C )下解鏈。在根據(jù)本發(fā)明的裝置和系統(tǒng)中，每個探針均連接在一微陣列芯片2的與各自相對 應的探針點4上，雜交以類似于傳統(tǒng)微陣列的方式進行，只是本發(fā)明中的雜交是在定制的 雜交和解鏈腔中，溫度適度嚴格受控下進行。在溫度適度嚴格受控下進行雜交的期間，結合 以靶分子與SWs進行正確配對為目的，不希望出現(xiàn)較多錯配。雜交可在閱讀儀內(nèi)部進行， 或者在外部雜交皿中進行。本發(fā)明無需對芯片進行干燥，而是使緩沖液保持于微陣列上，通 過緩沖液流經(jīng)微陣列的方式對其進行一系列沖洗，以將未雜交的靶DNA從微陣列中沖出。 沖洗后，將微陣列腔放置在閱讀儀上，蓋片窗口面朝光學系統(tǒng)。閱讀時，每次升溫的增量范 圍為5°C至0. 01°C，每次改變溫度的時間間隔可以為1分鐘至若干小時。對微陣列2上的每個探針點4進行掃描，如果熒光減弱，則表明雙鏈DNA解鏈正在 解鏈為單鏈DNA。該種檢測在預定的熒光跟蹤窗口(如55°C 75°C)內(nèi)進行。如果垃圾 DNA與給定的探針低親和力的結合，則垃圾DNA將在55°C以下解鏈，而不被檢測到；如果探 針與具有正確互補序列的靶DNA結合，解鏈將在65°C左右進行。SNPs的一個堿基錯配對也 將在熒光跟蹤窗口(55°C 75°C)內(nèi)解鏈，但是，這些解鏈曲線與正確配對的解鏈曲線將相 差幾度。每種產(chǎn)物的相對濃度(正確配對相對于SNP的含量)可以通過計算每條曲線下面 的面積或者峰值檢測出來，因此，可以消除背景，確定錯配相對正確配對的相對含量，以及 確定是否存在SNPs。熔點分析可以通過降低由靶DNA錯配引起的噪聲提高信噪比，獲得更高的準確 度。另外，也可以利用先進的熒光光譜技術如FRET、FLIM或者FCS來提高信噪比，這些技術中的每種技術均可以區(qū)分與DNA探針結合的靶DNA和位于DNA探針附近、但未與其結合靶 DNA。另外，這些技術可以結合在一起或者單獨使用。FRET采用被稱為是FRET對的二種熒光染料，可用于指示DNA的兩條互補鏈之間的 距離小于或等于lOnm。與一單鏈DNA結合的FRET供體受激發(fā)后，會將其熒光能量轉(zhuǎn)移至 位于另一互補DNA鏈的FRET受體上。因此，激發(fā)供體染料會使受體染料發(fā)出熒光，但是，若 要獲得該種效果，受體鏈與給體鏈之間的距離必須在通常為10 15nm之間，或者更短。因 此，探測到FRET表明DNA兩條互補鏈是結合在一起的，而沒有彼此解鏈。FLIM是探測激發(fā)狀態(tài)的衰減速度(熒光壽命)，而不是熒光強度。由于熒光染料所 存在的微觀環(huán)境可以影響衰減速度，因此，基于單鏈和雙鏈DNA具有不同熒光壽命的事實， 可利用FLIM確定一 DNA鏈是單鏈還是雙鏈。FCS利用自相關函數(shù)檢測熒光顆粒的擴散速度。該函數(shù)可用于確定一熒光標記的 DNA鏈是否與另一條鏈相結合。能夠檢測和確定靶DNA與探針正確配對的數(shù)量，和錯配的數(shù)量有以下3個優(yōu)點第一，提高基因表達譜的準確性。對于通常的微陣列，無法確定與探針正確配對結 合的DNA數(shù)量和一個或者二個堿基對錯配的DNA數(shù)量。解鏈曲線分析可以精確檢測正確配 對結合的DNA數(shù)量，進而提高了測試的整體準確度，無需進行方法學驗證。第二，可確定探針與靶DNA間的一堿基對錯配的能力可用于確證是否存在SNPs。 標準的微陣列通常采用四種探針或者更多，使各探針在SNP位點上具有不同的堿基；隨后， 微陣列閱讀儀確定具有較多靶DNA分子結合的探針。在此，即使采用多種探針也無法證實 結果的正確性，而且該種技術在探針序列具有重復序列元素時特別容易出錯。解鏈曲線分 析可以精確地檢測每個探針錯配與正確配對的相對值，無需進行方法學驗證。第三，該種方式具有可重復利用微陣列和樣品的優(yōu)點。在檢測結束時，樣品從微陣 列上解鏈下來，收集后可重復使用，這樣，微陣列和樣品均可保存以供下次試驗使用。利用 共價鍵改進探針結合技術，使一些微陣列可重復使用5次。通過重復利用陣列，可以消除因 細胞中基因表達的動態(tài)范圍寬而引起的稀釋問題。不同的基因可以在寬范圍的水平下表 達，如果表達過高，陣列探針將飽和，如果表達過低，結合將不會發(fā)生。由于在進行基因表達 譜分析之前無法預測基因表達水平，因此，試驗通常需要在不同稀釋倍數(shù)下重復進行幾次。 通過采用實時陣列程序，樣品可從微陣列解鏈下來，調(diào)整稀釋倍數(shù)，因此，同樣的芯片和樣 品可以在幾個稀釋倍數(shù)下重復使用，無需使用多個芯片。本發(fā)明的實時陣列過程是采用傳統(tǒng)微陣列芯片的微陣列技術。例如是標準尺寸 為25mmX75mm的，用共價鍵結合程序固定探針的傳統(tǒng)微陣列芯片，可由許多生產(chǎn)廠家提 供。帶有硅橡膠墊的玻璃或者硅橡膠材質(zhì)的耐熱雜交-解鏈蓋片固定在芯片表面。將小體 積(10 400 μ 1)樣品引入陣列腔中后密封。在核酸樣品與芯片雜交后使緩沖液保持于微 陣列上，由該蓋片覆蓋緩沖液；與之相對應的常規(guī)微陣列芯片分析步驟是，取下蓋片沖洗陣 列，干燥后對微陣列進行讀數(shù)。將該芯片置于閱讀儀上，在控制芯片溫度逐漸升高的條件 下，針對微陣列上的每個探針點反復檢測其熒光強度。針對每個探針，結合每個閱讀溫度上 的熒光強度數(shù)據(jù)生成解鏈曲線。通過軟件對數(shù)據(jù)曲線進行分析確定是否存在SNPs的一個堿基對錯配，以及確定 噪聲中是否存在多個堿基對錯配。相對于與探針正確配對結合的核酸，與探針結合的垃圾核酸或者噪聲將在更低的溫度下解鏈，這樣，就可以在測定中消除這種來源的誤差。包含一 個錯配堿基對的SNPs比與靶DNA正確配對結合的，在稍低的溫度下解鏈，這樣很容易區(qū)分 和精確檢測SNPs。因此，SWs的存在得到驗證，噪聲影響在任何操作程序中(例如基因表 達譜，SNP分析等)均被消除了。在此，該過程可以二種方法完成，一種是用泵使緩沖流經(jīng)微陣列的流控方法，另一 種是無需緩沖液流經(jīng)微陣列的靜態(tài)緩沖液方法。每種方法需要以下說明的相應裝置。流控方法和裝置a.裝置說明本發(fā)明的實時陣列流控系統(tǒng)包括圖1所示的五個子系統(tǒng)，這些子系統(tǒng)分別為照明 子系統(tǒng)10、熒光探測子系統(tǒng)、流體循環(huán)子系統(tǒng)、微陣列平移子系統(tǒng)和熱控子系統(tǒng)。該使微陣列成像的照明子系統(tǒng)10包括一光源12，如激光、弧光燈、LED燈，或者其 它適用形式的光源。圖中所示的照明子系統(tǒng)10采用的是共聚焦照明方式，在此也可以采用 其它的照明方式。該光源12發(fā)出的光束14穿過激發(fā)光濾光片16，該激發(fā)光濾光片16用于 濾除波長接近激發(fā)出的熒光的波長范圍的光，該激發(fā)光濾光片16可以是帶通濾光片和/或 者二向色濾光片。該光束14通過激發(fā)光濾光片后再穿過一分束器18，該分束器18允許光 束14通過，而不允許激發(fā)出的熒光波長通過。該分束器18可以是二向色濾光片。該光束 14隨后被掃描鏡20反射，該反射光經(jīng)一物鏡和/或者聚焦透鏡22聚焦至該微陣列2上。 在圖1所示的實施方式中，該掃描鏡20與一平移驅(qū)動器M連接，該平移驅(qū)動器M可帶動 掃描鏡相對微陣列2在“X”軸上運動。聚焦至微陣列2上的光束14即可激發(fā)其上的探針 點4產(chǎn)生熒光。圖1所示的實施方式還包括一用于支撐該微陣列2的工作臺沈，該工作臺沈與一 可帶動其相對掃描鏡20在“Y”軸上運動的平移驅(qū)動器觀連接，“Y”軸與掃描鏡20的運動 方向“X”軸垂直。該微陣列平移子系統(tǒng)通過工作臺沈?qū)崿F(xiàn)了二維運動。該“Y”軸平移驅(qū) 動器28帶動微陣列2在一方向上運動，而“X”軸平移驅(qū)動器M帶動掃描鏡20和物鏡22 在橫穿微陣列2、與“Y”軸呈90度垂直的方向上運動。該種運動方式使系統(tǒng)可以對微陣列 2的整個區(qū)域進行掃描，以探測探針點4處的熒光。在此可以采用其它類型的運動裝置，如 直線電機、齒條與小齒輪傳動裝置或者其它類似的裝置。該熒光探測子系統(tǒng)30基于一高靈敏度的探測器32，例如光電倍增管、雪崩光電二 極管和/或其它類型的光電探測器，數(shù)碼相機也可以作為探測器32使用。由物鏡22采集 到的由微陣列2發(fā)出的熒光沿著光束14的路徑入射至掃描鏡20，反射后到達分束器18，該 分束器18具有一選擇涂層，該涂層將從微陣列的探針點4處發(fā)出的熒光朝探測器32的方 向上反射，而不是使其改變方向至朝向光源12的方向上。該激發(fā)出的熒光隨后經(jīng)一二向色 濾光片34進入探測器32中，在此，如果采用激光、LED光源或者其它單色光源，則不需要設 置該二向色濾光片34，因此這些光源的波長具有高準確度。根據(jù)系統(tǒng)所需的靈敏度，可以使 用不同種類的探測器按照上述方法檢測熒光水平。如圖2和3所示，由該微陣列2和光學窗口 74或者蓋片之間的空腔定義為一微陣 列腔72。該微陣列腔72保持和/或向微陣列輸送流體。如圖4所示，該微陣列腔72與一 熱控部件96緊密接觸。該熱控部件的溫度由加熱器44和加熱控制器46精確控制。待引 入微陣列腔中的溶液先流經(jīng)置于該熱控部件96內(nèi)部的預加熱器48，以使引入微陣列腔72中的溶液的溫度和微陣列2的溫度相均衡。引入微陣列腔中的溶液可以是雜交溶液、緩沖溶液，或者其它流體。在此可通過選 通閥50選擇輸出來自一個或者多個溶液池52，54中的溶液，如如圖1所示的雜交溶 液(池 52)或者緩沖溶液(池54)。在需要將雜交溶液從池52引入微陣列腔72中時，控制選通閥 50打開雜交溶液池22，通過控制泵56運轉(zhuǎn)足夠長的時間即可使雜交溶液充滿微陣列腔72。 該熱控部件96的溫度控制在能使雜交較好地完成的適當溫度上。該雜交步驟可在將微陣 列2裝載至該裝置上之前完成。在雜交完成和該裝置做好準備后，將控制該熱控部件96的溫度調(diào)整至起始溫度。 在其達到起始溫度后，控制該選通閥50輸出池54中的緩沖溶液，并通過泵56將雜交溶液 從微陣列腔72中沖出。在溫度穩(wěn)定后，該熒光掃描子系統(tǒng)掃描微陣列上的點4，并記錄熒光水平。該微陣 列腔72中的流體隨后將未結合的熒光標簽從微陣列腔72中沖出，該廢溶液經(jīng)廢液管10進 入廢液池60中。完成初始閱讀后，開始線性升溫過程。通過改變溫度控制器46的輸入使該微陣列 2的溫度升高。在微陣列2的溫度穩(wěn)定后，微陣列2的熒光掃描完畢，熒光強度記錄完畢。 在有效的溫度范圍內(nèi)重復進行改變溫度、閱讀步驟和沖洗步驟。該溫度控制器46還可以包 括一為其提供溫度反饋信號的溫度傳感器62，以精確控制該熱控部件96的溫度。該加熱器 44可以是電阻加熱器和/或諸如珀耳帖熱電元件等其它類型的加熱器。b.微陣列腔說明參照圖2和3，所示的微陣列腔72相對于對系統(tǒng)的說明進行了倒置，使探針點4變 為位于該微陣列2的底面上。該微陣列2保持于具有框架76的微陣列盒70中。該框架76 確定微陣列2現(xiàn)對于光學系統(tǒng)的位置，并使微陣列2與光學窗口 74相互隔開。該框架76 包括一置于框架76中開口 80周圍的間隔物78。該微陣列腔72允許流體在微陣列2和光 學窗口 74之間流動。流體通過一流體入口 82引入微陣列腔72中，全面流經(jīng)該微陣列腔2后到達流體 出口 84處。該光學窗口 74與框架76密封連接。該微陣列2通過一密封件86固定。在 此，也可以采用其它方式將微陣列2密封于框架76中，如粘接或者熱密封方式。微陣列盒 70以下述方式裝載于熱控體90中。c.熱控體說明該熱控體90是一種將微陣列盒70與流體系統(tǒng)和加熱控制器連接在一起的裝置。 參照圖4和5，該熱控體90由底座92支撐，該底座92固定于工作臺26上。該底座92用于 支撐微陣列盒70，該熱控部件96通過鉸鏈94與底座92連接，使該熱控部件96可以相對底 座92轉(zhuǎn)動，以打開該微陣列盒70。在圖4所示的實施方式中，珀耳帖裝置作為加熱器44為 熱控部件96提供熱能，在此，也可以使用其它類型的加熱器，如電阻加熱器或者循環(huán)流體。 該加熱器44產(chǎn)生的熱量由加熱板98通過熱控部件96傳遞至微陣列2。圖4所示的該珀耳 帖加熱器44上連接一熱沉100，通過該熱沉100增加或者散去由珀耳帖加熱器44產(chǎn)生的熱 量。該熱控部件96包括一與微陣列直接接觸的接觸面102，采用直接接觸的方式有利于保 持微陣列2溫度的均勻性。圖5示出的熱控體90去除了該加熱器44和熱沉100，以露出流體預加熱器48。該預加熱器48包括置于溝槽106中的管道104，該溝槽106設置于熱控部件96中。管道104 包括一供流體引入的預加熱器入口 108。熱控部件96通過管道104將熱量傳遞給管道中的 流體。在管道104的末端，流體通過與入口 82相對應的入口管接頭110引入微陣列腔72 中。廢液經(jīng)與出口 84相對應的出口管接頭112從微陣列中流出，并 流入廢液管58中。d.加熱裝置的流控方法該實時陣列流控方法可以利用任何常規(guī)的用于雙色微陣列分析(例如Cy3或者 Cy5)的任何一種顏色的染料來實施。在傳統(tǒng)的微陣列中，靶DNA已被永久染色，在靶DNA與 探針結合和游離在溶液中時均將發(fā)出熒光。未結合的熒光標記DNA的存在將產(chǎn)生不期望的 背景，進而在系統(tǒng)中產(chǎn)生噪聲?？刂粕倭康木彌_溶液從光學窗口 74下方流過微陣列芯片2 可以消除噪聲，并可在線性升溫過程中，使解鏈的靶DNA從微陣列中沖出。在此，可以采用多種方式完成該工序，首先進行簡單的升溫循環(huán)，接著通過緩沖溶 液脈沖沖洗微陣列腔，使已解鏈的靶DNA經(jīng)被加熱的廢液管58流至廢液收集池60中；之 后，在X軸和Y軸平移驅(qū)動器的帶動下掃描微陣列2，檢測剩余熒光。另一種實施方式是使溫度受控的緩沖液連續(xù)流經(jīng)該微陣列腔72，補償散失的熱 量，盡量保持溫度穩(wěn)定；接著啟用循環(huán)升溫過程；之后進行掃描，檢測剩余熒光。然而，另一種實施方式是包括微陣列掃描前進行的升溫循環(huán)的各種循環(huán)，其中，對 于多次升溫循環(huán)和掃描均省略了緩沖液沖洗步驟，節(jié)省了時間和緩沖液。例如，在至少二次 升溫和掃描循環(huán)后再通過緩沖液沖洗微陣列，這樣只需在至少重復進行二次升溫循環(huán)和掃 描后進行一次緩沖液沖洗循環(huán)。對于每種實施方式，循環(huán)重復將已解鏈的DNA移至廢液收集池60中的升溫過程和 通過物鏡22對微陣列2進行掃描的過程，直到將所有已解鏈DNA均從微陣列芯片2中沖出 為止。之后，針對每個探針點4，通過軟件繪制熒光強度隨溫度變化的曲線。該種方法通過確定精確的解鏈溫度，可以檢測未配對的靶DNA和SNPs，該種方法 適用于任何利用共價鍵結合的方式將靶DNA固定在玻璃載體上的陣列系統(tǒng)，以及適用于任 何市場上可以獲得的染色系統(tǒng)。另外，由于該方法將解鏈的靶DNA收集于廢液池60中，因 此，樣品被純化后又可在另外的實驗中使用。靶DNA的重復使用是有益的，特別是在難于獲 得樣品的情況下。靜態(tài)緩沖方法實現(xiàn)溫度控制的另一種可選的方法是使用電阻加熱器44直接對微陣列2進行加 熱或者冷卻，而不是通過循環(huán)流體。在此說明的照明、探測和平移子系統(tǒng)均類似于緩沖液熱控系統(tǒng)中的相應部分。該 微陣列2安裝于熱控部件的頂部，該熱控部件包括一溫度傳感器62和一加熱和/或制冷元 件44。該溫度傳感器62輸出的溫度信號反饋給溫度控制器46，該控制器46根據(jù)該溫度信 號向加熱/制冷元件44發(fā)出控制信號，以精確控制微陣列2的溫度。該微陣列2的溫度可 進行增量式變化或者線性變化。雜交完成后，該微陣列2在位于其下方的加熱元件44的作用下逐漸升溫，通過特 定的熒光染料可以監(jiān)測與與DNA探針結合的靶DNA的解鏈過程。該應用適合使用兩種類型 截然不同的染料，如SYBR GreenI的嵌入型染料，或者如BEBO的小溝結合型染料。這些染 料僅在DNA是雙鏈時才會產(chǎn)生熒光，因此，在溫度線性升高時，如果檢測到熒光減少，則說明雙鏈DNA正在解鏈為單鏈DNA，并可在預定的溫度窗口內(nèi)測定。針對每個探針點4，熒光 強度_溫度曲線如圖6A和6B所示?？梢赃x 擇的是，可將任一用于微陣列的常規(guī)染料與先進熒光標記技術諸如FRET、 FLIM或者FCS等結合使用。這些技術可以區(qū)分與探針結合的靶DNA和位于DNA探針附近、 但未與其結合的靶DNA，這樣可以消除任何由位于探針點附近的已解鏈靶DNA產(chǎn)生的背景信號。探針點分析在完成每個溫度點的掃描后，生成用于進行熒光強度分析的數(shù)字圖像文件。對于 圖像上的每個探針點，軟件找到該探針點的邊緣，以在該探針點與微陣列的其它區(qū)域之間 設定邊界。該探針點通常是圓形的，但也可以是方形或者不規(guī)則形狀。一旦確定了探針點的 邊界，就可針對邊界內(nèi)的像素計算平均或中位熒光強度。在更高的溫度點上進行熒光強度 分析時創(chuàng)建新的圖像文件，記錄和復制探針點邊界的準確位置、形狀和面積。為了確定精確 的解鏈曲線，必須在實驗期間保持探針點分析的一致性。除了僅找出所獲得的第一張圖像 的探針點的邊緣外，還可以采用如圓形等確定形狀或者其他具有確定直徑的幾何形狀。必 須將用于定義探針點邊界的精確位置、形狀和形狀面積復制到每個隨后的圖像中，以確保 熒光分析和解鏈曲線測定的一致性。圖IOA至IOD示出了本發(fā)明裝置操作的流程圖。解鏈曲線數(shù)據(jù)的分析方法圖6A和6B示出了利用市面上購買的微陣列和Cy3染料標記的人靶cDNA獲得的解 鏈曲線，該探針位點最初具有足夠的熒光，其中微陣列來自美國加州、森尼韋爾的Arrayit 公司。圖中示出了針對二個特定探針點繪制的解鏈曲線，圖6A示出了鈣粘蛋白1探針點產(chǎn) 生的解鏈曲線，該曲線僅在熔點為63°C附近出現(xiàn)了一個主要的解鏈點，表明僅具有一個主 要的雜交產(chǎn)物。圖6B示出了 肌動蛋白探針點產(chǎn)生的解鏈曲線，該曲線至少在熔點為 46°C和62°C附近出現(xiàn)了二個主要的解鏈點，表明至少形成了二種雜交產(chǎn)物，而且，在較低溫 度處解鏈的產(chǎn)物可能與靶序列發(fā)生錯配。另外，還可以通過解鏈曲線推斷出每種雜交產(chǎn)物 的相對濃度。如果探針序列已知，可以通過估計解鏈溫度確定結合是非特定噪音還是SNP。 傳統(tǒng)的微陣列技術無法獲得該種信息。在分析中，熔點對于特定的DNA是唯一的。在達到解鏈溫度后，熒光強度的改變速 率降至接近預解鏈溫度時的值。曲線的斜率也可用于指示熔點，獲得解鏈曲線的斜率是另 一種確定熔點的方法。針對給定溫階，或者熒光強度改變的斜率或速率明確指示了熔點。可供選擇的探測形式_熒光相關光譜(FCS)如圖7所示，熒光相關光譜(FCS)可作為熒光分析的另一種可供選擇的方法。利 用熒光研究雙鏈核酸解鏈的傳統(tǒng)方法是，熒光減弱的功能之一是檢測核酸雙鏈的分離；相 比之下，F(xiàn)CS可以通過擴散的改變檢測雙鏈核酸的分離。該種類型的分析與配置有一針孔 202和附加透鏡204的如圖1所示的裝置是兼容的；該種類型的分析與配置有一針孔202和 附加透鏡204的標準共聚焦激光-掃描顯微鏡也是兼容的；而且，該種類型的分析與雙光子 激光掃描顯微鏡同樣是兼容的。參照緩沖液熱控方法和裝置，F(xiàn)CS成像分析以上述相同的方式進行。雜交完成后， 將該微陣列芯片2置于平移工作臺26上。溫度可控的緩沖液供應管206和已加熱緩沖液 返回管208均與一加熱器210連接。隨著溫度的升高，經(jīng)溫度可控的緩沖液供應管206進入微陣列2中的已加熱緩沖液脈沖通過已加熱緩沖液返回管208沖出已解鏈的靶DNA，其 中，該已加熱緩沖液返回管208經(jīng)一三通閥(圖7中未示出)通向一廢液收集池。之后，通 過X軸平移電機24和Y軸平移電機28來回移動平移工作臺26和微陣列2完成對微陣列2 的掃描，以檢測剩余熒光，在該過程中，由物鏡22掃描和收集發(fā)出的熒光，熒光經(jīng)過光學系 統(tǒng)到達探測器32處，由探測器32檢測熒光強度。同理，也可通過使掃描鏡210，212與平移 電機24，28連接的方式掃描微陣列點4。如圖7所示，F(xiàn)CS僅有的 特殊要求是光學系統(tǒng)必須具有一的針孔202和附加的透 鏡204，而且計算機軟件是利用計算機處理的芯片或者卡所具有的相關函數(shù)處理熒光數(shù)據(jù)。 采用FCS具有以下優(yōu)點該種分析程序具有更高的靈敏度，可以準確探測靶DNA的一個分 子；FCS可以通過檢測和比較擴散速率，區(qū)分與探針結合的靶DNA和游離于溶液中的自由靶 DNA ；FCS不依賴于熒光強度確定DNA是否已經(jīng)解鏈，而且擴散速率也可以給出一些關于靶 DNA分子量的信息。緩沖液循環(huán)裝置該緩沖液循環(huán)裝置是前述的流控預加熱裝置的變形。在該實施方式中，循環(huán)流體 用于控制微陣列2的溫度。該緩沖液循環(huán)裝置與流控預加熱裝置相比，照明、熒光探測和掃 描或者平移子系統(tǒng)均相同，只有溫度控制子系統(tǒng)不同。一微陣列腔72保存試劑和/或者向微陣列輸送試劑。該試劑和/或緩沖液具有 兩個作用，一個作用是保持微陣列2的濕度，另一個作用是控制溫度。該循環(huán)系統(tǒng)具有一試 劑/緩沖液供應閥302，用于將新的試劑引入微陣列中，和/或者循環(huán)現(xiàn)有的試劑/緩沖液。 如果該試劑/緩沖液供應閥302處于循環(huán)模式，則泵304用于使流體循環(huán)流動，控制流體順 次流經(jīng)一供應管306、該微陣列腔72、返回管308、廢液三通閥310和換熱器312或溫度控制 器，最終返回至三通試劑/緩沖液供應閥302處。如果需要向系統(tǒng)引入新的試劑或者緩沖液，則使三通閥302和314均打開，允許試 劑/緩沖液從池52，54中引入。環(huán)路中過量的試劑/緩沖液直接通過廢液管58流入廢液 池60中。通過設置一選擇閥50，可向微陣列2中輸送多種試劑，在此并不局限于圖中示出 的二個試劑瓶，也可以采用多個試劑瓶。該熱控系統(tǒng)包括一溫度控制器或換熱器312，通過該換熱器設定流經(jīng)微陣列2的 試劑/緩沖液的溫度。該換熱器312在完成對微陣列的熒光掃描的過程中保持流體溫度恒 定。該換熱器312也可以改變試劑/緩沖液的溫度，以獲得針對微陣列2的解鏈曲線。采用預加熱皿314可以快速改變微陣列的溫度。該預加熱皿314的溫度可以設定 為使試劑的溫度與隨后所期望的溫度相當。在完成對微陣列的掃描后，引入新的不同溫度 的試劑溶液。新溫度溶液可使微陣列的溫度產(chǎn)生每秒rc以上的快速變化。試劑溫度的快 速變化減少了對微陣列2的總體閱讀時間。熒光強度數(shù)據(jù)歸一化方法熒光強度隨著微陣列探針點溫度的改變而改變，探針點溫度升高，熒光強度降低。 為了對熒光強度的改變進行補償，可以主動改變探測系統(tǒng)增益，溫度每升高一溫階，增益增 加一階。每個溫階增益的增量要使探針點熒光強度的平均值保持在探測系統(tǒng)范圍的中間位 置上。圖9示出了一利用熒光強度數(shù)據(jù)歸一化方法處理數(shù)據(jù)的實施例。熒光FRET、FLIM 或 FCS 方法
通過采用先進的熒光光譜技術，如FRET、FLIM或FCS，可以進一步提高信噪比。這 些技術中的每種技術均可以區(qū)分與DNA探針結合的靶DNA和位于DNA探針附近、但未與其 結合的靶DNA。另外，這些技術可以結合在一起或者單獨分開使用。FRET采用被稱為是FRET對的二種熒光染料，二種熒光染料可用于指示DNA的兩條 互補鏈之間的距離在10 15nm之間，或者更短。FRET對中的FRET供體標記于DNA的一條 鏈上，如探針DNA。當FRET供體受激發(fā)后，會將其熒光能量轉(zhuǎn)移至存在于另一條互補的靶 DNA上的FRET受體上，因此，激發(fā)供體染料會使受體染料發(fā)出熒光。但是，若要獲得該種效 果，具有FRET受體和具有FRET供體的兩條DNA鏈之間的距離必須在最佳距離10 15nm 之間，或者更短。因此，如果探測到FRET，則表明DNA兩條互補鏈很可能是結合在一起，而 沒有解鏈；反之，如果探測到FRET減弱，則表明DNA的兩條互補鏈正在彼此分開。實際上， 可以利用FRET對的熒光強度的比值。例如，如果該FRET染料對為Cy3和Cy5，作為供體的 Cy3標記于探針DNA上，而靶DNA由受體Cy5標記，在靶DNA與探針DNA結合時，可以觀察 到最佳的Cy5熒光，Cy5熒光與Cy3熒光強度的比值較高；隨著靶DNA與探針DNA分開，Cy5 的熒光強度降低表明靶DNA正與探針DNA分離，Cy5熒光與Cy3熒光強度的比值較低。
FLIM檢測的是熒光的指數(shù)衰減速度，而不是熒光強度。由于熒光染料所存在的微 觀環(huán)境可以影響衰減速度，因此，基于DNA單鏈和雙鏈具有不同熒光壽命的事實，F(xiàn)LIM可用 于確定一 DNA鏈是單鏈還是雙鏈。一旦靶DNA與探針DNA結合在一起，熒光染料周圍的環(huán) 境立刻改變，相應地熒光壽命相對于溶液中未結合的靶DNA也被改變(如改變了幾納秒或 者更多)。FLIM可單獨使用，或者結合FRET技術一起使用以降低微陣列系統(tǒng)中的噪音。微陣列流控方法的實施例一雙色微陣列的基因表達譜一位癌癥研究者想比較癌癥細胞株和同型未轉(zhuǎn)化的正常細胞，需要完成以下步 驟獲取每種類型的細胞，抽提mRNA，合成DNA并同時用Cy3或者Cy5熒光染料進行染色標
記。 傳統(tǒng)的微陣列基因表達譜包括如下步驟將2種cDNA樣品混勻；將混合物置于陣 列上，蓋上蓋片，制成雙色微陣列；完成雜交。這是一個較大量的cDNA與其它類型細胞cDNA 競爭與陣列探針點結合的雜交過程。雜交完成后對陣列進行沖洗和干燥，然后用傳統(tǒng)的可 獲取雙色熒光的閱讀機對陣列進行讀數(shù)。基因表達水平通過檢測一種染料的熒光強度并將 它與其它染料的熒光強度比較來確定。傳統(tǒng)微陣列因準確度差，誤差高達幾倍，所有有意義 的結果均必須采用更精確的低通量方法如實時定量PCR進行驗證。該驗證步驟顯著增加了 實驗的總體成本。相對之下，流控陣列方法的雜交過程以相同的方式進行，但是不用對陣列進行干 燥，而是使芯片保持潮濕，將其放置于一微陣列盒中，使印制陣列的表面被一光學窗口或者 蓋片覆蓋。在機器中閱讀該芯片的過程中，逐漸升溫和掃描芯片獲取二種顏色的熒光，直到 所有的靶DNA均已與探針DNA解鏈為止。由于該方法采用流控陣列，因此可通過將溫度受 控的緩沖液抽至位于陣列表面和蓋片之間的腔內(nèi)的方法改變微陣列的溫度和沖洗微陣列， 過量的緩沖液和已解鏈的靶DNA被排放至廢液收集池中。對于緩沖液在陣列中的每次沖洗 或者每次脈沖，重復循環(huán)掃描芯片以獲取熒光強度。針對每個探針繪制出熒光強度隨溫度變化的曲線。與傳統(tǒng)微陣列方法相比，流控 陣列通過避開在較低溫度下繪制解鏈曲線的方法，可在最終的計算結果中消除任何垃圾DNA或者噪聲。該種方法的精確度高，無需進行驗證實驗。微陣列系統(tǒng)中存在的常規(guī)噪音將 使樣品間的基因表達不同，使實測值偏小。 例如，如果基因表達的真正差異為2 1，過多的噪聲將使該差異呈現(xiàn)接近1 1 的結果。通過采用解鏈曲線分析，在每種樣品相對其它樣品將在基因表達上具有最大區(qū)別 的溫度上進行閱讀，可能獲得最準確的閱讀結果。因此，采用解鏈曲線分析將糾正在基因表 達上的區(qū)別，使其更接近真值2 1。另外，通過觀察解鏈曲線可以檢測 是否存在SNPs，SNPs 的解鏈溫度比預計溫度低少許值。制作陣列時，檢測每個SNP需要使用高達40個不同的探 針，而采用解鏈分析使所需的探針數(shù)降低至每個SNP 4個或者更少，通量提高了 10倍。在 此可以采用根據(jù)溫度增加調(diào)整增益的歸一化程序，也可以不采用。在該程序中，如果需要較 高地提高準確度和降低噪音，則可以采用FRET、FILM、雙光子顯微鏡和/或FCS (實施例3)。 再者，根據(jù)親和力純化核酸，可重復使用廢液中的靶DNA。而且，該微陣列芯片在清除靶DNA 和沖洗芯片后也可以重復使用。
權利要求
1.利用一光束激發(fā)微陣列的預定部位和探測所發(fā)出熒光的方法對位于該微陣列上的 核酸進行解鏈曲線分析的裝置包括一照明子系統(tǒng)，包括一光源，用于產(chǎn)生該光束，該光束包括具有至少一種波長的電磁輻射波； 一帶通濾光片，用于濾除波長接近核酸受激發(fā)所發(fā)出的熒光的波長的光； 一掃描鏡，用于使該光束發(fā)生反射而允許該發(fā)出的熒光通過；以及， 一物鏡，用于使該光束聚焦至該微陣列的預定部位上； 一熒光探測子系統(tǒng)，用于檢測由該微陣列的預定部位發(fā)出的熒光； 一流體循環(huán)子系統(tǒng)，包括 一微陣列盒，包括一框架，該框架包括一用于容置一微陣列載體的開口，該開口圍繞其內(nèi)部邊緣設有間 隔物；一流體入口 ；以及，一流體出口 ； 一光學窗口，設置于框架上；以及， 一密封件，設置于框架的與該光學窗口相對的位置上；其中，該間隔物設置為，在該微陣列載體容置于開口中時，通過間隔物將微陣列載體與 光學窗口隔開，使二者之間形成一空腔，該空腔定義為一允許流體從流體入口進入微陣列 載體中，在流體全面流經(jīng)微陣列載體后到達流體出口處的微陣列腔；一泵，用于從流體池中抽出流體，并使流體流入與該流體入口連接的流體供應管中； 一流體返回管，與該流體出口連接；以及， 一溫度控制套件，包括一溫度控制器和一流體加熱器； 其中，該光束和微陣列之間可進行相對移動。
2.根據(jù)權利要求1的裝置，其中，該微陣列在第一方向上移動，該光束在第二方向上移 動，該第二方向基本與第一方向垂直。
3.根據(jù)權利要求1的裝置，其中，該光束固定，該微陣列在第一方向和第二方向上移 動，該第二方向基本與第一方向垂直。
4.根據(jù)權利要求3的裝置，還包括一基架，可移動地連接于一基座上，該基架用于容納該微陣列盒； 一連接于該基座上的第一基架定位件，用于沿著第一軸方向移動該基架；以及， 一連接于該基座上的第二基架定位件，用于沿著與第一軸基本垂直的第二軸方向移動 該基架。
5.根據(jù)權利要求1的裝置，其中，該熒光探測子系統(tǒng)還包括一二向色濾光片，該二向色 濾光片的安裝在使核酸發(fā)出的熒光經(jīng)該二向色濾光片進入該熒光探測器中的位置上。
6.根據(jù)權利要求1的裝置，其中，該熒光探測器從包括光電倍增管、雪崩光電二極管、 光電探測器和數(shù)碼相機的探測器組中選擇。
7.根據(jù)權利要求1的裝置，其中，該流體加熱器包括一電加熱元件。
8.根據(jù)權利要求1的裝置，其中，該流體加熱器用于利用流體循環(huán)子系統(tǒng)傳遞熱能。
9.根據(jù)權利要求8的裝置，其中，該流體加熱器與微陣列腔之間傳遞熱能。
10.根據(jù)權利要求9的裝置，其中，該流體加熱器包括一珀耳帖熱電元件。
11.根據(jù)權利要求1的裝置，還包括一廢液管，該廢液管與流體供應管和流體返回管之一連通。
12.根據(jù)權利要求11的裝置，還包括一與廢液管連通的廢液池，該廢液池用于收集來 自流體循環(huán)子系統(tǒng)的廢液。
13.根據(jù)權利要求1的裝置，其中，該流體池包括一預加熱器。
14.根據(jù)權利要求1的裝置，其中，該流體池包括多個腔室，用于保存需要引入該流體 循環(huán)子系統(tǒng)中的不同流體。
15.根據(jù)權利要求14的裝置，還包括一選擇閥，用于從多種不同的流體中選擇一種特 定的流體引入該流體循環(huán)子系統(tǒng)中。
16.一種進行核酸溶解曲線分析的裝置使用的微陣列盒，該微陣列盒包括一框架，該框架具有一包括一內(nèi)部邊緣的用于容置一微陣列載體的開口，該開口圍繞 其內(nèi)部邊緣設有間隔物；一光學窗口，設置于該框架上，并位于該開口的一側； 一流體入口； 一流體出口 ；以及，一密封件，設置于框架的與該光學窗口相對的位置上；其中，該間隔物設置為，在該微陣列載體容置于開口中時，通過間隔物將微陣列載體與 光學窗口隔開，使二者之間形成一定義為微陣列腔的空腔；其中，該微陣列腔設置為經(jīng)流體入口引入流體，使該流體全面流經(jīng)微陣列載體后經(jīng)流 體出口從微陣列腔中排出。
17.一種用于加熱微陣列的熱控體，包括 一底座，用于容置一微陣列；一熱控部件，樞接于該底座上，使該熱控部件可在打開位置和關閉位置間轉(zhuǎn)動；以及， 一加熱器，連接于該熱控部件上。
18.根據(jù)權利要求14的熱控體，還包括一連接于加熱器上的熱沉。
19.根據(jù)權利要求14的熱控體，其中，該加熱器為珀耳帖加熱器。
20.根據(jù)權利要求14的熱控體，其中，該加熱器為阻抗類型加熱器。
21.根據(jù)權利要求14的熱控體，其中，該熱控部件包括流體預加熱器，該流體預加熱器 包括一流體管道，與之相對的是一容納微陣列芯片的凹槽，該流體管道設置為在其內(nèi)部的 流體引入微陣列載體之前，將熱量傳遞給該流體。
22.根據(jù)權利要求18的熱控體，其中，該流體管道包括一置于熱控部件中的溝槽和置 于該溝槽中的管道。
23.利用一光束激發(fā)微陣列的預定部位和探測所發(fā)出熒光的方法分析位于該微陣列上 的核酸的溶解曲線的裝置包括一照明子系統(tǒng)，包括一產(chǎn)生該光束光源，該光束包括具有至少一種波長的電磁輻射波；一熒光探測子系統(tǒng)，用于檢測由該微陣列的預定部位發(fā)出的熒光； 一流體循環(huán)子系統(tǒng)，包括一定義有一微陣列腔的微陣列盒，該微陣列盒包括一流體入口和一流體出口 ； 一泵，用于從流體池中抽出流體，并使流體流入與該流體入口連接的流體供應管中；一流體返回管，與該流體出口連接；以及，一溫度控制套件，包括一溫度控制器，該溫度控制器用于調(diào)整流體循環(huán)子系統(tǒng)中流體 的溫度；一微陣列定位件，包括一基架，可移動地連接于一基座上，該基架用于容納該微陣列盒； 一連接于該基座上的第一基架定位件，用于沿著第一軸方向移動該基架；以及， 一連接于該基座上的第二基架定位件，用于沿著與第一軸基本垂直的第二軸方向移動 該基架。
24.通過微陣列閱讀儀對位于微陣列載體上的核酸進行解鏈曲線分析的方法包括如下 步驟初始化該微陣列閱讀儀； 初始化該微陣列載體； 獲取數(shù)據(jù)； 處理數(shù)據(jù)；以及， 分析數(shù)據(jù)。
25.根據(jù)權利要求M的方法，其中，初始化該微陣列閱讀儀的步驟還包括如下步驟 對該微陣列閱讀儀中的掃描頭進行調(diào)焦；進行預覽掃描；以及， 確定掃描部位。
26.根據(jù)權利要求M的方法，其中，初始化該微陣列載體的步驟進一步包括如下步驟 對溶液進行脫氣；以及，沖洗該微陣列載體。
27.根據(jù)權利要求M的方法，其中，獲取數(shù)據(jù)的步驟進一步包括如下步驟 將該微陣列載體加熱至預定溫度；控制該微陣列在該預定溫度上保持預定時間； 通過預定體積的流體沖洗該微陣列載體；以及， 對該微陣列載體進行掃描。
28.根據(jù)權利要求27的方法，其中，通過被加熱流體的連續(xù)流動對該微陣列載體進行 加熱，其中，在沖洗期間，該被加熱流體的流速增加。
29.根據(jù)權利要求觀的方法，其中，該流體的溫度在沖洗期間升高。
30.根據(jù)權利要求27的方法，還包括以下步驟 使該微陣列載體升溫；控制微陣列載體在升高的溫度上保持預定時間； 通過預定體積的流體沖洗該微陣列載體； 對該微陣列載體進行掃描；以及， 重復進行升溫、保持溫度、沖洗和掃描步驟。
31.根據(jù)權利要求27的方法，其中，獲取數(shù)據(jù)的步驟進一步包括增加探測器信號增益 的步驟，以對掃描期間存在的熒光減弱問題進行補償。
32.根據(jù)權利要求M的方法，其中，處理數(shù)據(jù)的步驟進一步包括如下步驟 打開一首次掃描的數(shù)據(jù)文件；打開一通用特征列表文件；使該通用特征列表與首次掃描的數(shù)據(jù)文件的相對應部分對準； 為微陣列載體上的每個微陣列點指定唯一的特征形狀；以及， 保存該定制特征列表文件。
33.根據(jù)權利要求32的方法，其中，該分析數(shù)據(jù)的步驟進一步包括如下步驟 打開一定制特征列表文件；創(chuàng)建一綜合結果文件； 打開一掃描的圖像文件；使該通用特征列表與掃描的圖像的相對應部分對準；檢測每個特征的強度；創(chuàng)建一保存特征數(shù)據(jù)的文件；對特征強度值進行歸一化；以及，保存該綜合結果。
34.根據(jù)權利要求33的方法，其中，對特征強度值進行歸一化的步驟進一步包括如下 步驟為微陣列載體上的每個探針點設定一定制特征的初始標線；以及， 基于該初始的標線比較每個特征的強度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種對微陣列上的核酸進行解鏈曲線分析的方法和裝置。本發(fā)明的方法包括通過改變微陣列中流體的溫度分離和移除靶DNA，掃描該微陣列觀察熒光，收集從該微陣列中移除的靶DNA，以及重復利用該收集到的靶DNA和微陣列。本發(fā)明的裝置包括一微陣列工作臺，一光源和探測器，以及一溫度控制器，其中，該溫度控制器用于調(diào)整微陣列樣品腔中的流體的溫度，使該流體的溫度在分析期間發(fā)生變化，從而使靶DNA與該微陣列分離。該光源照射至該微陣列上激發(fā)出的熒光由該探測器采集。
文檔編號C12Q1/68GK102076870SQ200980124390
公開日2011年5月25日 申請日期2009年6月25日 優(yōu)先權日2008年6月25日
發(fā)明者布魯斯·J·理查森, 邁克爾·D·大倉 申請人:實時基因組有限公司