專利名稱：含有抑制或延遲孢子萌發(fā)的化合物的培養(yǎng)基的制作方法
含有抑制或延遲孢子萌發(fā)的化合物的培養(yǎng)基本發(fā)明 屬于臨床或工業(yè)微生物測試領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明主要涉及培養(yǎng)靶微生 物的培養(yǎng)基，該靶微生物可以存在于樣品中，特別是存在于食品或者環(huán)境樣品中，所述培養(yǎng) 基含有至少一種抑制或延遲孢子萌發(fā)的化合物。下文將參照脫水產(chǎn)品來具體地描述本發(fā)明，但是這并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。質(zhì)量和安全是世界范圍內(nèi)食品加工工業(yè)最為關(guān)注的問題。必須能夠檢測、鑒定 并定量原材料和終產(chǎn)品中的微生物菌群，從而保證從它們的生產(chǎn)到它們的消費(fèi)中的產(chǎn)品 價值。因此，利用改造的菌群來分析產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)從而反映整體污染水平，所述改造的菌 群中有諸如大腸桿菌(Escherichia coli)的腸細(xì)菌、凝固酶陽性的葡萄球菌、假單胞菌 (Pseudomonas)、芽孢桿菌(Bacillus)、酵母、霉菌等。特別地，尋找奶粉中凝固酶陽性的葡 萄球菌當(dāng)今已經(jīng)變得非常迫切。在凝固酶陽性的葡萄球菌中，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)盡管與 人類共生，卻是葡萄球菌屬中最致病的物種。特別地，它可以導(dǎo)致食物中毒、化膿性局部感 染，并且在某些極端情況下，它可以導(dǎo)致經(jīng)歷過移植或心臟修復(fù)的患者的敗血病。開發(fā)允許特異性計(jì)數(shù)凝固酶陽性的葡萄球菌的培養(yǎng)基的難點(diǎn)在于 不僅要求該培養(yǎng)基有良好的靈敏性，以允許檢測所述培養(yǎng)基中存在的很低的凝 固酶陽性的葡萄球菌污染(約10菌落形成單位(CFU)/g)；而且 要求能夠抑制有時大量存在的其他微生物，最特別是在表型上與凝固酶陽性的 葡萄球菌接近的諸如芽孢桿菌微生物的微生物。這是因?yàn)?，由于芽孢桿菌微生物的實(shí)際特點(diǎn)，通過選擇劑來區(qū)分凝固酶陽性的葡 萄球菌與芽孢桿菌據(jù)發(fā)現(xiàn)是非常困難的；大部分對于這些細(xì)菌中的一種有效的抑制劑通常 也會影響其他細(xì)菌。因此，據(jù)發(fā)現(xiàn)Baird-Parker-RPF型(兔血漿+牛血纖蛋白原)常規(guī)培 養(yǎng)基不能有效且系統(tǒng)地抑制芽孢桿菌。而且，在食品加工領(lǐng)域，生產(chǎn)商經(jīng)常借助脫水來加工產(chǎn)品，其條件通?？梢猿ゴ?部分微生物，特別是營養(yǎng)體型的微生物。然而，芽孢桿菌屬的細(xì)菌由于它們形成孢子的能力 而能夠經(jīng)受住極端條件，如脫水期間所用的那些。于是，它們已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)存在于脫水產(chǎn)品 中。因此，據(jù)發(fā)現(xiàn)奶粉中芽孢桿菌污染的水平可以達(dá)到很高。而且，制備培養(yǎng)基所需的大部分原材料本身也通常為脫水(粉狀)形式。如上文所解釋的，這些干原材料也經(jīng)常被經(jīng)受脫水條件的這些芽孢桿菌微生物所 污染。因此，在諸如奶粉的脫水產(chǎn)品的微生物測試中經(jīng)常觀察到假陽性結(jié)果，這是由于 這樣的事實(shí)，即芽孢桿菌屬的細(xì)菌被錯誤地分析為凝固酶陽性的葡萄球菌。相反地，由于經(jīng)常存在大量的芽孢桿菌，其總是遠(yuǎn)高于凝固酶陽性的葡萄球菌的 量，所以經(jīng)常掩蓋了后者的存在，從而使得假陰性的風(fēng)險較高。因此，應(yīng)當(dāng)很容易地理解，大量的芽孢桿菌對于開發(fā)意圖用于鑒定或甚至用于計(jì) 數(shù)諸如凝固酶陽性的葡萄球菌的靶細(xì)菌的培養(yǎng)基來說是主要障礙并且可以導(dǎo)致對存在于 諸如食物樣品的分析樣品中的這些微生物的存在的較差估計(jì)。所述樣品定義為分離自分析實(shí)體的小部分或者少量。 盡管已經(jīng)測試了開發(fā)用于凝固酶陽性的葡萄球菌的特異性計(jì)數(shù)的培養(yǎng)基的各種 方法，但由于芽孢桿菌影響的限制，這些方法還沒有達(dá)到預(yù)期的成功。因此，諸如抗生素的選擇劑不能組合對芽孢桿菌微生物的良好選擇性與保持對凝 固酶陽性的葡萄球菌微生物的良好靈敏性。幾十年前發(fā)表的兩篇文章提及了 D-丙氨酸對于孢子萌發(fā)的作用。從M. Halmann,A. Keynan于 1962年發(fā)表的"Stages in germination ofspores of Bacillus Licheniformis，，，J. Bacteriol. 84 :1187_1193 已知:L_ 丙氨酸脫氫酶對于地衣 芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)孢子萌發(fā)的第一生化步驟是必需的，而且該第一步驟 可被D-丙氨酸、各種鹽、丙酮酸乙酯和辛醇所抑制。Yoko Yasusa-Yasaki 等于 1978 年發(fā)表的 “Inhibition of Bacillus subtilisSpore Germination by Various Hydrophobic Compounds !Demonstration ofHydrophobic Character of L-alanine Receptor Site，，，Journal of Bacteriology, Vol. 136, No2, P. 484-490也提到了負(fù)責(zé)孢子形成起始的L-丙氨酸的抑制劑是-作用于地衣芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)的辛醇，-作用于巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)的苯乙醇，-作用于巨大芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的 8-羥基喹啉，-作用于蠟狀芽孢桿菌的乙醇和二環(huán)己基碳二亞胺。后來發(fā)表的研究主要集中在表征孢子形式微生物的萌發(fā)機(jī)制，芽孢桿菌屬就是一 個實(shí)例。所述研究實(shí)際上描述了涉及萌發(fā)過程的各個步驟。迄今為止對于萌發(fā)機(jī)制的了解主要用于促進(jìn)微生物孢子的萌發(fā)，特別是芽孢桿菌 孢子的萌發(fā)，有以下幾方面的目的-加速萌發(fā)從而改進(jìn)在培養(yǎng)基中的生長/檢測；-促進(jìn)萌發(fā)以消除營養(yǎng)體型的微生物，其然后對培養(yǎng)基中以抗生素形式存在或某 些工業(yè)清潔過程中以去垢劑或消毒劑形式存在的抑制劑更加敏感，其他過程基于高溫處理。本發(fā)明意圖通過提供與已確認(rèn)的那些解決辦法相反的技術(shù)方案來彌補(bǔ)上述缺陷， 該技術(shù)方案不在于促進(jìn)孢子萌發(fā)，而是與之相反，阻斷孢子萌發(fā)，或者至少是使之延遲。而且，所述技術(shù)方案提供了使用抗生素的完全有利的替代選擇，抗生素作用譜通 常并不與區(qū)分諸如凝固酶陽性的葡萄球菌的靶微生物與諸如芽孢桿菌的能夠干擾所述靶 微生物的檢測、鑒定或甚至計(jì)數(shù)的微生物的需求相容。本發(fā)明還具有不改變培養(yǎng)基的營養(yǎng)品質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)，因而使得可以避免上述特異性的 問題，從而使開發(fā)的培養(yǎng)基更加特別地適用于分析芽孢桿菌水平高的產(chǎn)品如脫水產(chǎn)品。因此，本發(fā)明重要目的之一在于使用培養(yǎng)靶微生物，特別是細(xì)菌的培養(yǎng)基，該培養(yǎng) 基能夠阻斷，或者至少是延遲要分析的樣品中可能含有的孢子的萌發(fā)，而這并不對所述靶 微生物的生長產(chǎn)生影響。因此本發(fā)明的第一方面由用于培養(yǎng)和檢測靶微生物的培養(yǎng)基組成，該培養(yǎng)基包含

至少一種天然或合成的特異性底物，其允許檢測所述靶微生物的至少一種酶活 性或代謝活性， 至少一種化合物，其抑制或延遲除所述靶微生物以外的能夠干擾所述靶微生物 的培養(yǎng)和檢測的微生物的孢子的萌發(fā)。優(yōu)選地，所述靶微生物是細(xì)菌，例如包括金黃色葡萄球菌在內(nèi)的凝固酶陽性的葡 萄球菌。對于本發(fā)明的目的，底物可以是諸如碳或氮源的代謝底物，該底物的降解產(chǎn)物導(dǎo) 致PH值變化，所述變化可以通過PH指示劑進(jìn)行檢測。PH指示劑是顏色隨與微生物生長有 關(guān)的PH值變化而改變的化學(xué)物質(zhì)。提及的例子是生色團(tuán)、中性紅、苯胺藍(lán)和溴甲酚藍(lán)。在 另一實(shí)施方案中，PH指示劑是熒光團(tuán)(如4-甲基傘形酮(4-methylumbelliferone)、氨基 香豆素衍生物或試鹵靈衍生物)。底物還可以選自可以被水解以產(chǎn)生允許直接或間接檢測對所關(guān)注的微生物特異 性的酶活性的產(chǎn)物的任何底物。在直接檢測的情況下，底物包含對酶活性特異的第一部分 以及作為標(biāo)記的第二部分，其可以是生色或熒光的。本發(fā)明的培養(yǎng)基可以是即用的粉末形式、凝膠形式或液體形式，即可直接用于接 種試管、燒瓶或培養(yǎng)皿。在凝膠培養(yǎng)基的情況下，瓊脂是微生物學(xué)中用于培養(yǎng)微生物的常規(guī) 膠凝劑，但可以使用明膠或瓊脂糖。最后，培養(yǎng)基可裝入專用于自動細(xì)菌學(xué)裝置的瓶、筒或 卡內(nèi)(例如將要提及的是本申請人出售的vitek 卡、Tempo 卡和BacT/ m^RT 瓶)。 在這種情況下，延遲或抑制化合物可以為意圖在使用前加入培養(yǎng)基的獨(dú)立溶液形式。在食物來源的樣品中，會非窮舉地提及的是脫水產(chǎn)品的樣品，如奶粉、谷類、湯粉 或蛋糕制品。糕點(diǎn)也是一個例子。最后，食物樣品可來源于動物飼料，如特別是動物食物 (animal meal)0也會提及與環(huán)境相關(guān)的樣品，如表面樣本，水樣本或空氣樣本。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抑制或延遲化合物抑制或延遲芽孢桿菌孢 子的萌發(fā)。抑制或延遲孢子萌發(fā)的化合物有利地選自包括D-丙氨酸；二苯胺；通式為 CnH2n+20H的醇，其中η為6至12，優(yōu)選辛醇、壬醇或癸醇；胰蛋白酶類型酶的抑制劑；和/或 它們的混合物的組中。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，所述培養(yǎng)基中抑制或延遲孢子萌發(fā)的化合物的 濃度在0. 01和lmol/1之間，優(yōu)選在0. 05和0. lmol/1之間。培養(yǎng)基也可以含有pH指示劑以顯示底物的消耗，所述pH指示劑優(yōu)選為生色團(tuán)或 熒光團(tuán)。通常，底物可包含對要揭示的酶活性或代謝活性特異的第一部分以及作為熒光標(biāo) 記的第二部分?；蛘?，底物可包含對要揭示的酶活性或代謝活性特異的第一部分以及作為生色標(biāo) 記的第二部分。本發(fā)明的第二方面涉及檢測可能存在于樣品中的靶微生物的方法，該方法包括以 下步驟
a)使所述樣品與本發(fā)明的培養(yǎng)基接觸，b)將所述培養(yǎng)基在適合微生物細(xì)胞增殖的條件下保溫，c)檢測 所述靶微生物的存在。根據(jù)另一具體實(shí)施方案，本發(fā)明的方法可以包括步驟a)之前的步驟，其包括向所 述培養(yǎng)基中加入含有至少一種化合物的溶液，該化合物抑制或延遲除所述靶微生物以外的 能夠干擾所述靶微生物的培養(yǎng)和檢測的微生物的孢子的萌發(fā)。本發(fā)明方法的步驟C)可以包括利用熒光讀數(shù)器測量培養(yǎng)基中熒光水平的變化， 例如這種變化相應(yīng)于所述培養(yǎng)基中的PH變化。或者，步驟C)可以包括鑒定菌落。在這種情況下，本發(fā)明的培養(yǎng)基通常是固體形 式，特別是培養(yǎng)皿中的瓊脂培養(yǎng)基的形式。由于孢子萌發(fā)被延遲，所以在培養(yǎng)基中感興趣的 細(xì)菌的生長優(yōu)先于其他細(xì)菌并且先于其他細(xì)菌。因此，在早期讀取培養(yǎng)皿時(如接種后16 小時)的情況下，只能看到感興趣的細(xì)菌的菌落。在較晚讀取(如接種后24小時)的情況 下，所述讀取包括區(qū)分大菌落與小菌落。通過孢子萌發(fā)所獲得的細(xì)菌的菌落大小小于自身 正常發(fā)育的靶細(xì)菌的菌落。因此容易區(qū)分靶細(xì)菌與其他細(xì)菌。根據(jù)一個具體實(shí)施方案，本發(fā)明的方法可以包括計(jì)數(shù)靶微生物的額外步驟。這樣 的計(jì)數(shù)步驟優(yōu)選根據(jù)最大可能數(shù)(MPN)法進(jìn)行。在本申請人的專利EP1105457中解釋了該方法。本發(fā)明的另一方面涉及至少一種延遲或抑制微生物孢子萌發(fā)的化合物在制備培 養(yǎng)基中的用途。完全優(yōu)選地，本發(fā)明涉及D-丙氨酸在制備用于鑒定諸如金黃色葡萄球菌的凝固 酶陽性的葡萄球菌的培養(yǎng)基中的用途。本發(fā)明的最后一方面涉及培養(yǎng)基在檢測、鑒定或甚至計(jì)數(shù)凝固酶陽性的葡萄球菌 中的用途。與抗生素不同，考慮到抑制或延遲孢子萌發(fā)的化合物通常在寬溫度范圍內(nèi)保持穩(wěn) 定，因此本發(fā)明培養(yǎng)基的制備具有與生產(chǎn)培養(yǎng)基的方法的常規(guī)條件完全相容的優(yōu)點(diǎn)。而且， 這些化合物通常價格較低。根據(jù)下面實(shí)施例和附圖會更清楚了解本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)，其中

圖1的直方圖顯示了相對于熒光水平的CV分布，該熒光水平是在含有和不含 D-丙氨酸的培養(yǎng)基中用測試的樣品保溫后獲得的。
實(shí)施例以下的實(shí)例描述了 D-丙氨酸對芽孢桿菌類微生物(如地衣芽孢桿菌、蘇云金芽孢 桿菌(Bacillus thuringiensis)/蠟狀芽孢桿菌)孢子形成的抑制作用。為此，對59份易含芽孢桿菌微生物且未被金黃色葡萄球菌污染的奶粉樣品進(jìn)行 了測試。為了研究D-丙氨酸的抑制作用，測試了兩種培養(yǎng)基-培養(yǎng)基1不含D-丙氨酸的培養(yǎng)基，-培養(yǎng)基2培養(yǎng)基中存在終濃度為0. 05和0. lmol/1 (培養(yǎng)基中的終濃度)之間 的D-丙氨酸的培養(yǎng)基。
所述培養(yǎng)基的組成如下(含有或不含D-丙氨酸的培養(yǎng)基中的g/Ι，終濃度)動物(牛和豬)和植物蛋白胨12.5糖和生長補(bǔ)充劑11緩沖體系10選擇劑(抗生素、鹽)10.25熒光pH指示劑0. 06消泡劑0. 4樣品根據(jù)ISO 8261 2001標(biāo)準(zhǔn)(關(guān)于奶和奶制品并涉及“制備測試樣品、儲備懸 液和微生物檢查所用十倍稀釋液的常規(guī)指南(general guidelinesfor the preparation of test samples, of the stock suspension and of the decimal dilutions for the purpose of microbiological examination)，，)按如下步驟制備a)稱取10克樣品并置于Stomacher 袋中，b)加入預(yù)熱至45°C的90ml胰蛋白胨鹽稀釋劑以獲得樣品的初始1/10稀釋液，c)利用Stomacher 機(jī)器研磨1分鐘，d)將Stomacher 袋置于水浴中并于45°C攪拌5分鐘，e)取Iml樣品(稀釋至1/10)并置于3ml培養(yǎng)基中以獲得1/40稀釋液，f)于37 °C保溫24至27小時，g)對培養(yǎng)基進(jìn)行熒光讀取并通過最大可能數(shù)技術(shù)確定樣品中微生物的污染水平。讀取由保溫后所獲得的培養(yǎng)基中熒光測量組成。熒光值的大變化表明培養(yǎng)基酸 化，所述酸化本身是由一或多種微生物的生長所致的?；跍y試的樣品(未被金黃色葡萄球菌污染)計(jì)算CV熒光值。CV越高，則培養(yǎng)基的酸化就越高，從而表明該培養(yǎng)基中存在微生物生長。反之，CV 越低，則培養(yǎng)基酸化就越低，從而反映出較少的微生物生長。因此，培養(yǎng)基的特異性較好并 且假陽性的風(fēng)險較低(假陽性結(jié)果與除金黃色葡萄球菌以外的微生物的細(xì)菌引起的培養(yǎng) 基酸化有關(guān))。由于本實(shí)施例中測試樣品未被金黃色葡萄球菌污染，所以觀察到的酸化與除金黃 色葡萄球菌以外的各種微生物的非特異性生長有關(guān)，經(jīng)鑒定屬于芽孢桿菌屬(地衣芽孢桿 菌、蘇云金芽孢桿菌/蠟狀芽孢桿菌)。如圖1所示，獲得的并以直方圖形式表示的譜(profile)表明兩種培養(yǎng)基之間CV 分布的顯著差異用培養(yǎng)基1 (不含D-丙氨酸)獲得的CV分布在0和24之間的值，而用培養(yǎng)基2 (含 D-丙氨酸)獲得的所有值低于6且絕大多數(shù)低于3 (非常輕微的酸化)。在培養(yǎng)基中使用D-丙氨酸可以顯著地降低培養(yǎng)基保溫后所獲得的CV值。由于在 研究的情況下，CV與非特異性酸化有關(guān)，所以向培養(yǎng)基中加入D-丙氨酸使得所述培養(yǎng)基對 這類樣品中以孢子形式存在的芽孢桿菌具有更好的特異性。下面的表1概括了含有或不含D-丙氨酸的培養(yǎng)基中獲得的計(jì)數(shù)。表 權(quán)利要求
1.用于培養(yǎng)和檢測靶微生物的培養(yǎng)基，包含 至少一種天然或合成的特異性底物，其允許檢測所述靶微生物的至少一種酶活性或 代謝活性， 至少一種化合物，其抑制或延遲除所述靶微生物以外的能夠干擾培養(yǎng)和檢測所述靶 微生物的微生物的孢子的萌發(fā)。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其中所述抑制或延遲孢子萌發(fā)的化合物選自包括D-丙 氨酸；二苯胺；通式為CnH2n+20H的醇，其中η為6至12，優(yōu)選辛醇、壬醇或癸醇；胰蛋白酶類 型酶的抑制劑；和/或它們的混合物的組。
3.如前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基，其中所述抑制或延遲孢子萌發(fā)的化合物 在所述培養(yǎng)基中的量在0. 01至lmol/1之間，優(yōu)選在0. 05和0. lmol/1之間。
4.如前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基，還含有顯示所述底物消耗的PH指示劑， 所述PH指示劑優(yōu)選為生色團(tuán)或熒光團(tuán)。
5.如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基，其中所述底物包含對要揭示的酶活性或 代謝活性特異的第一部分以及作為生色標(biāo)記的第二部分。
6.如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基，其中所述底物包含對要揭示的酶活性或 代謝活性特異的第一部分以及作為熒光標(biāo)記的第二部分。
7.如前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基，其中所述抑制或延遲化合物抑制或延遲 芽孢桿菌孢子的萌發(fā)。
8.如前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基，其中所述靶微生物是凝固酶陽性的葡萄 球菌，如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
9.檢測可能存在于樣品中的靶微生物的方法，包括以下步驟a)使所述樣品與權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基接觸，b)將所述培養(yǎng)基在適于微生物細(xì)胞增殖的條件下保溫，c)檢測所述靶微生物的存在。
10.如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，包括步驟a)之前的步驟，其包括向所述培養(yǎng) 基中加入含有至少一種化合物的溶液，所述化合物抑制或延遲除所述靶微生物以外的能夠 干擾培養(yǎng)和檢測所述靶微生物的微生物的孢子的萌發(fā)。
11.如權(quán)利要求9和10任意一項(xiàng)所述的方法，其中步驟C)包括用熒光讀數(shù)器測量所述 培養(yǎng)基中熒光水平的變化，所述變化相應(yīng)于所述培養(yǎng)基中的PH變化。
12.如權(quán)利要求9和10任意一項(xiàng)所述的方法，其中步驟c)包括鑒定菌落。
13.如權(quán)利要求9和10任意一項(xiàng)所述的方法，其中步驟c)包括區(qū)分大菌落與小菌落。
14.如權(quán)利要求9至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品是食物或環(huán)境樣品。
15.如權(quán)利要求9至14中任一項(xiàng)所述的方法，包括計(jì)數(shù)靶微生物的額外步驟。
16.至少一種延遲或抑制微生物孢子萌發(fā)的化合物在制備權(quán)利要求1至8中任意一項(xiàng) 所述的培養(yǎng)基中的用途。
17.D-丙氨酸在制備權(quán)利要求1至8中任意一項(xiàng)所述的用于鑒定諸如金黃色葡萄球菌 的凝固酶陽性的葡萄球菌的培養(yǎng)基中的用途。
18.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基在檢測、鑒定或甚至計(jì)數(shù)諸如金黃色葡萄球 菌的凝固酶陽性的葡萄球菌中的用途。
全文摘要
本發(fā)明主要涉及用于培養(yǎng)和檢測靶微生物的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包含至少一種天然或合成的特異性底物，其允許檢測所述靶微生物的至少一種酶活性或代謝活性，至少一種化合物，其抑制或延遲除所述靶微生物以外的能夠干擾所述靶微生物的培養(yǎng)和檢測的微生物的孢子的萌發(fā)。
文檔編號C12Q1/04GK102076868SQ200980124119
公開日2011年5月25日 申請日期2009年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月26日
發(fā)明者A·科斯塔 申請人:生物梅里埃公司