專利名稱：確定腫瘤分化等級(jí)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及確定腫瘤分化等級(jí)的方法。更特別的，本發(fā)明涉及通過(guò)篩選其表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌(HCC)的各個(gè)分化等級(jí)相關(guān)的基因和/或蛋白，測(cè)定各個(gè)分化等級(jí)中人腫瘤組織的基因和/或蛋白的表達(dá)從而確定腫瘤分化等級(jí)的方法。本發(fā)明還涉及使用這些基因和/或蛋白在診斷HCC的分化等級(jí)和篩選用于HCC治療的抗癌劑中的用途。
本發(fā)明還涉及用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒，其包括DNA微陣列、寡核苷酸微陣列、蛋白陣列、RNA印跡法(northern blotting)、原位雜交、RNase保護(hù)試驗(yàn)、蛋白質(zhì)印跡法(western blotting)、ELISA試驗(yàn)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(下文表示為RT-PCR)所必需的DNA芯片、寡核苷酸芯片、蛋白芯片、多肽、抗體、探針和引物，以測(cè)定表達(dá)水平與腫瘤分化等級(jí)相關(guān)的基因和/或蛋白的表達(dá)。
背景技術(shù)：
癌癥是世界上主要的死亡原因。特別的，肝細(xì)胞癌(HCC)是世界范圍內(nèi)最常見的癌癥之一，其由于在許多國(guó)家增長(zhǎng)的發(fā)病率而成為一個(gè)主要的國(guó)際性健康問(wèn)題(Schafer，D.F.and Sorrell，M.F.Hepatocellular carcinoma，Lancet353，1253-1257(1999)，Colombo，M.Hepatitis C virus and hepatocellularcarcinoma，Semin.Liver Dis.19，263-269(1999)，和Okuda，K.Hepatocellularcarcinoma，J.Hepatol.32，225-237(2000))。慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染與乙型肝炎病毒(HBV)感染、酒精消耗(alcohol consumption)以及幾種致癌物質(zhì)如黃曲霉毒素B1一樣是主要的HCC危險(xiǎn)因子之一(Okuda，K.Hepatocellularcarcinoma，J.Hepatol.32，225-237(2000))。已經(jīng)有幾種治療方法被用于HCC的治療。這些方法包括外科切除、放射性療法、化學(xué)療法和包括激素和基因治療在內(nèi)的生物療法。然而，這些治療方法均無(wú)法治愈該疾病。HCC治療的主要問(wèn)題之一是在該疾病的發(fā)展和進(jìn)展期間癌細(xì)胞特性的變化。特別的，腫瘤細(xì)胞分化等級(jí)的變化是明顯而且頻繁的。該變化改變了腫瘤細(xì)胞侵害(invade)和轉(zhuǎn)移的能力以及癌細(xì)胞對(duì)不同治療的敏感性，其導(dǎo)致對(duì)抗癌劑(agents)的抗性。如果準(zhǔn)確診斷和控制癌細(xì)胞特性的變化，癌癥治療將會(huì)更加的有效。
先前的研究表明在肝癌發(fā)生中涉及腫瘤抑制基因和致癌基因如p53、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)和AXIN1基因(Okabe，H.，Satoh，S.，Kato，T.，Kitahara，O.，Yanagawa，R.，Yamaoka，Y.，Tsunoda，T.，F(xiàn)urukawa，Y.，and Nakamura，Y.Genome-wide analysis of gene expression in human hepatocellular carcinomasusing cDNA microarrayidentification of genes involved in viral carcinogenesisand tumor progression，Cancer Res.61，2129-2137(2001))。人們還認(rèn)為，HCV相關(guān)HCC的發(fā)展可以表示為從早期到進(jìn)展期腫瘤的病理進(jìn)展，其與癌細(xì)胞的去分化相關(guān)聯(lián)(Kojiro，M.Pathological evolution of early hepatocellularcarcinoma，Oncology 62，43-47(2002))。特別是將DNA微陣列技術(shù)引入醫(yī)學(xué)后(Schena，M.，Shalon，D.，Davis，R.W.，and Brown，P.O.Quantitativemonitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray，Science 270，467-470(1995)，DeRisi，J.，Penland，L.，Brown，P.O.，Bittner，M.L.，Meltzer，P.S.，Ray，M.，Chen，Y.，Su，Y.A.，and Trent，J.M.Use of a cDNAmicroarray to analyse gene expression pattems in human cancer，Nat.Genet.14，457-460(1996))，許多研究顯示了涉及HCC某些方面的基因表達(dá)譜(gene-expression patterns)(Lau，W.Y.，Lai，P.B.，Leung，M.F.，Leung，B.C.，Wong，N.，Chen，G.，Leung，T.W.，and Liew，C.T.Differential gene expression ofhepatocellular carcinoma using cDNA microarray analysis，Oncol.Res.12，59-69(2000)，Tackels-Horne，D.，Goodman，M.D.，Williams，A.J.，Wilson，D.J.，Eskandari，T.，Vogt，L.M.，Boland，J.F.，Scherf，U.，and Vockley，J.G.Identification of differentially expressed genes in hepatocellular carcinoma andmetastatic liver tumors by oligonucleotide expression profiling，Cancer92，395-405(2001)，Xu，L.，Hui，L.，Wang，S.，Gong，J.，Jin，Y.，Wang，Y.，Ji，Y.，Wu，X.，Han，Z.，and Hu，G.Expression profiling suggested a regulatory role ofliver-enriched transcription factors in human hepatocellular carcinoma，CancerRes.61，3176-3681(2001)，Xu，X.R.，Huang，J.，Xu，Z.G.，Qian，B.Z.，Zhu，Z.D.，Yan，Q.，Cai，T.，Zhang，X.，Xiao，H.S.，Qu，J.，Liu，F(xiàn).，Huang，Q.H.，Cheng，Z.H.，Li，N.G.，Du，J.J.，Hu，W.，Shen，K.T.，Lu，G.，F(xiàn)u，G.，Zhong，M.，Xu，S.H.，Gu，W.Y，Huang，W.，Zhao，X.T.，Hu，G.X.，Gu，J.R.，Chen，Z.，and Han，Z.G.Insightinto hepatocellular carcinogenesis at transcriptome level by comparing geneexpression profiles of hepatocellular carcinoma with those of correspondingnon-cancerous liver，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98，15098-15094(2001)，Okabe，H.，Satoh，S.，Kato，T.，Kitahara，O.，Yanagawa，R.，Yamaoka，Y.，Tsunoda，T.，F(xiàn)urukawa，Y.，and Nakamura，Y.Genome-wide analysis of gene expression inhuman hepatocellular carcinomas using cDAN microarrayidentification ofgenes involved in viral carcinogenesis and tumor progression，Cancer Res.61，2129-2137(2001)，Shirota，Y.，Kaneko，S.，Honda，M.，Kawai，H.F.，andKobayashi，K.Identification of differentially expressed genes in hepatocellularcarcinoma with cDNA microarrays，Hepatology 33，832-840(2001)，Delpuech，O.，Trabut，J.B.，Carnot，F(xiàn).，F(xiàn)euillard，J.，Brechot，C.，and Kremsdorf，D.Identification，using cDNA macroarray analysis，of distinct gene expressionprofiles associated with pathological and virological features of hepatocellularcarcinoma，Oncogene 21，2926-2937(2002)，Iizuka，N.，Oka，M.，Yamada-Okabe，H.，Mori，N.，Tamesa，T.，Okada，T.，Takemoto，T.，Tangoku，A.，Hamada，K.，Nakayama，H.，Miyamoto，T.，Uchimura，S.，and Hamamoto，Y.Comparison ofgene expression profiles between hepatitis B virus-and hepatitis C virus-infectedhepatocellular carcinoma by oligonucleotide microarray data based on asupervised learning method，Cancer Res.62，3939-3944(2002)，and Midorikawa，Y.，Tsutsumi，S.，Taniguchi，H.，Ishii，M.，Kobune，Y.，Kodama，T.，Makuuchi，M.，and Aburatani，H.Identification of genes associated with dedifferentiation ofhepatocellular carcinoma with expression profiling analysis，Jpn.J.Cancer Res.93，636-643(2002))。它們中，兩個(gè)研究表明HCC的基因表達(dá)與其發(fā)展相關(guān)(Okabe，H.，Satoh，S.，Kato，T.，Kitahara，O.，Yanagawa，R.，Yamaoka，Y.，Tsunoda，T.，F(xiàn)urukawa，Y.，and Nakamura，Y.Genome-wide analysis of geneexpression in human hepatocellular carcinomas using cDNA microarrayidentification of genes involved in viral carcinogenesis and tumor progression，Cancer Res.61，2129-2137(2001)and Midorikawa，Y.，Tsutsumi，S.，Taniguchi，H.，Ishii，M.，Kobune，Y.，Kodama，T.，Makuuchi，M.，and Aburatani，H.Identification of genes associated with dedifferentiation of hepatocellularcarcinoma with expression profiling analysis，Jpn.J.Cancer Res.93，636-643(2002))。然而，不清楚在與HCV相關(guān)的HCC的腫瘤形成和發(fā)展過(guò)程中表征和/或調(diào)控HCC各個(gè)分化等級(jí)的基因和/或蛋白。調(diào)控HCC分化等級(jí)的基因和/或蛋白可以用于診斷HCC的分化等級(jí)和篩選用于治療由慢性HCV感染所引起的HCC的抗癌劑。
在本發(fā)明中，發(fā)明人描述了一種診斷腫瘤分化等級(jí)和篩選用于其治療的抗癌物質(zhì)的方法。特別的，發(fā)明人描述了一種識(shí)別40個(gè)或更多其表達(dá)與HCC分化等級(jí)相關(guān)的基因和/或蛋白，并且應(yīng)用這些基因和/或蛋白診斷HCC的分化等級(jí)和篩選用于不同等級(jí)HCC治療的抗癌物質(zhì)的方法。更特別的，發(fā)明人描述了一種用40個(gè)基因和/或蛋白預(yù)測(cè)非癌肝臟(non-cancerousliver)，癌前肝臟(pre-cancerons liver)以及HCC每個(gè)分化等級(jí)的方法。
發(fā)明的公開發(fā)明概述肝細(xì)胞癌(HCC)是世界范圍內(nèi)最常見的癌癥之一。然而，還沒有能夠治愈該疾病的治療方法。這估計(jì)是由于在疾病的發(fā)展和進(jìn)展過(guò)程中癌細(xì)胞的特性連續(xù)改變。特別地，癌癥的進(jìn)展通常與腫瘤細(xì)胞分化等級(jí)的變化相關(guān)。診斷和控制癌細(xì)胞的這種變化可以使得癌癥治療更加有效。在本發(fā)明中，通過(guò)代表來(lái)自50個(gè)丙型肝炎病毒(HCV)相關(guān)的HCC組織和11個(gè)無(wú)腫瘤(非癌和癌前)肝臟組織的大約11,000個(gè)基因的寡核苷酸微陣列來(lái)識(shí)別其表達(dá)與HCC的腫瘤的生成和發(fā)展相關(guān)的基因。
分化狀態(tài)劃分為5個(gè)等級(jí)。
非癌肝臟(L0)是組織學(xué)上正常并且對(duì)乙型肝炎病毒表面抗原和HCV抗體均呈血清反應(yīng)陰性的肝臟。癌前肝臟(L1)是HCV感染并且組織病理學(xué)診斷為慢性肝炎或肝硬化的肝臟。良好(well)分化的HCC(G1)是由癌細(xì)胞組成的HCC，癌細(xì)胞的特征為細(xì)胞密度增長(zhǎng)，以及與正常肝細(xì)胞相比具有升高的細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)比率，但是顯示與正常肝細(xì)胞類似的形態(tài)學(xué)。中等(moderately)分化的HCC(G2)是由大并且含染色質(zhì)多的(hyperchromatic)癌細(xì)胞組成的HCC。在G2等級(jí)的癌細(xì)胞巢中具有小梁(trabecular-)或腺(gland-)樣的結(jié)構(gòu)。不良(poorly)分化的HCC(G3)是由多形的或多核的癌細(xì)胞組成的HCC。在G3等級(jí)腫瘤生長(zhǎng)為缺乏有序排列的實(shí)體或細(xì)胞巢。G1、G2和G3腫瘤分別對(duì)應(yīng)于Edmondson和Steiner分類的類型I、II和III(Edmondson，H.A.and Steiner，P.E.Primary carcinoma of the livera study of 100 cases among48，900necropsies，Cancer7，462-504(1954))。
一種有監(jiān)督的學(xué)習(xí)方法(supervised learning method)，并隨后進(jìn)行寡核苷酸微陣列數(shù)據(jù)的隨機(jī)排列檢驗(yàn)被用于篩選在從沒有HCV感染的非癌肝臟(L0)到有HCV感染的癌前肝臟(L1)、從L1到良好分化的HCC(G1)、從G1到中等分化的HCC(G2)和從G2到不良分化的HCC(G3)的轉(zhuǎn)變期間其表達(dá)明顯變化的基因。具有所有篩選出的40個(gè)其表達(dá)在各個(gè)轉(zhuǎn)變階段明顯改變的基因的自編圖譜(self-organizing map)能夠正確地預(yù)測(cè)腫瘤組織的分化等級(jí)。因此，這些基因能夠用于診斷HCC的分化等級(jí)和篩選用于在每個(gè)分化等級(jí)治療HCC的抗癌劑。
發(fā)明詳述在本發(fā)明中，利用了人肝細(xì)胞癌(HCC)組織和非腫瘤(非癌或癌前)肝臟組織。利用有HCV感染的HCCs分析HCCs。HCV和/或HBV感染的存在可以通過(guò)針對(duì)抗HCV抗體和抗HBV抗體的免疫反應(yīng)性或通過(guò)用PCR擴(kuò)增HCV和/或HBV基因組進(jìn)行檢測(cè)。HCC的分化等級(jí)可以通過(guò)組織病理學(xué)檢查進(jìn)行檢測(cè)，HCCs被劃分為良好分化HCC(G1)、中等分化HCC(G2)和不良分化HCC(G3)。非腫瘤肝臟樣本可以從因良性的或轉(zhuǎn)移的肝臟腫瘤而進(jìn)行肝臟切除的患者中獲得。沒有HCV感染的肝臟樣本被分類為非癌肝臟(L0)，有HCV感染的肝臟樣本被分類為癌前肝臟(L1)。在外科手術(shù)中切除肝臟組織后，優(yōu)選立刻將組織在液氮或含有干冰的丙酮中冰凍并且保存于-70和-80℃之間直至使用。該組織可以或可以不包埋于O.C.T化合物中(Sakura-Seiki，Tokyo，Japan，目錄號(hào)4583)。
HCC組織和非腫瘤肝臟組織的基因和/或蛋白的表達(dá)可以通過(guò)測(cè)量RNA和/或蛋白的水平進(jìn)行分析。在大多數(shù)情況下，通過(guò)測(cè)量來(lái)自包括熒光素和若丹明(rhodamine)在內(nèi)的物質(zhì)的熒光、來(lái)自魯米諾(luminole)的化學(xué)發(fā)光、包括3H、14C、35S、33P、32P和125I在內(nèi)的放射性物質(zhì)的放射性和光密度來(lái)檢測(cè)RNA和/或蛋白水平。例如，通過(guò)已知的方法包括DNA微陣列(Schena，M.et al.Quantitative monitoring of gene expression patterns with acomplementary DNA microarray，Science270，467-470(1995)and Lipshutz，R.J.et al.High density synthetic oligonucleotide arrays，Nat.Genet.21，20-24(1999))、RT-PCR(Weis，J.H.et al.Detection of rare mRNAs viaquantitative RT-PCR，Trends Genet.8，263-264(1992)and Bustin，S.A.Absolutequantification of m RNA using real-time reverse transcription polymerase chainreaction assays，J.Mol.Endocrinol.25，169-193(2000))、RNA印跡法(northernblotting)和原位雜交(Parker，R.M.and Barnes，N.M.mRNAdetection in situand northern hybridization，Methods Mol.Biol.106，247-283(1999))、RNase保護(hù)試驗(yàn)(Hod，Y.A.Simplified ribonuclease protection assay，Bio Techniques 13，852-854(1992)and Saccomanno，C.F.et al.A faster ribonuclease protectionassay，Bio Techniques 13，846-850(1992))、蛋白質(zhì)印跡法(westernblotting)(Towbin，H.et al.Electrophoretic transfer of proteins frompolyacrylamide gels to nitrocellulose sheets，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76，4350-4354(1979)and Burnette，W.N.Western blottingElectrophoretic transferof proteins form sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodifiednitrocellulose and radioiodinated protein A，Anal.Biochem.112，195-203(1981))、ELISA試驗(yàn)(Engvall，E.and Perlman，P.Enzyme-linkedimmunosorbent assay(ELISA)Quantitative assay of immunoglobulin G，Immunochemistry 8，871-879(1971))和蛋白陣列(Merchant，M.and Weinberger，S.R.ReviewRecent advancements in surface-enhanced laserdesorption/ionization-time of flight-mass spectrometry，Electrophoresis 21，1164-1177(2000)and Paweletz，C.P.et al.Rapid protein display profiling ofcancer progression directly from human tissue using a protein biochip，Drug Dev.Res.49，34-42(2000))來(lái)檢測(cè)RNA和/或蛋白的表達(dá)水平。
通過(guò)比較各個(gè)分化等級(jí)的HCC組織和非腫瘤肝臟組織中基因和/或蛋白的表達(dá)水平篩選出在HCC各個(gè)分化等級(jí)和非腫瘤(非癌和癌前)肝臟中加以有差別地表達(dá)的基因和/或蛋白。通過(guò)比較非癌肝臟組織和癌前肝臟組織之間各個(gè)基因和/或蛋白的表達(dá)水平，來(lái)識(shí)別非癌肝臟(L0)和感染有HCV的癌前肝臟(L1)之間區(qū)別表達(dá)的基因和/或蛋白。通過(guò)比較癌前肝臟組織和良好分化的HCC組織(HCC(G1))之間各個(gè)基因和/或蛋白的表達(dá)水平，來(lái)識(shí)別癌前肝臟(L1)和良好分化的HCC(G1)之間區(qū)別表達(dá)的基因和/或蛋白。通過(guò)比較HCC(G1)和中等分化的HCC組織(HCC(G2))之間各個(gè)基因和/或蛋白的表達(dá)水平，來(lái)識(shí)別良好分化的HCC(G1)和中等分化的HCC(G2)之間區(qū)別表達(dá)的基因和/或蛋白。類似的，通過(guò)比較HCC(G2)和不良分化的HCC組織(HCC(G3))之間各個(gè)基因和/或蛋白的表達(dá)水平，來(lái)識(shí)別中等分化的HCC(G2)和不良分化的HCC(G3)之間區(qū)別表達(dá)的基因和/或蛋白。
可以通過(guò)已知的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法分析和檢測(cè)非癌肝臟、癌前肝臟、良好分化HCC、中等分化HCC和不良分化HCC的基因和/或蛋白在表達(dá)水平上的差異。在所有比較選自L0、L1、G1、G2和G3的兩個(gè)等級(jí)之間的基因和/或蛋白表達(dá)水平的實(shí)驗(yàn)中，均采用下述步驟。
第一步，篩選出在所有HCC樣本和在非癌和癌前肝臟樣本中具有一定表達(dá)水平的基因和/或蛋白(例如根據(jù)Affymetrix基因芯片結(jié)果的規(guī)定單位判斷表達(dá)水平大于40的基因)。該篩選獲得了一定數(shù)量的基因和/或蛋白。而后，通過(guò)Fisher比率測(cè)定各個(gè)基因和/或蛋白從L1中區(qū)分L0、從G1中區(qū)分Ll、從G2中區(qū)分G1以及從G3中區(qū)分G2的分辨能力。基因j的Fisher比率通過(guò)下式給出F(j)=(μj(A)-μj(B))2σ2j(A)+σ2j(B)]]>其中μj(i)為等級(jí)i的樣本中基因j表達(dá)水平的樣本平均值，σ2j(i)為等級(jí)i的樣本中基因j表達(dá)水平的樣本方差。
第二步，篩選出的基因和/或蛋白根據(jù)Fisher比率數(shù)值遞減的順序排序。還進(jìn)行隨機(jī)排列檢驗(yàn)以決定確定HCC分化等級(jí)的基因和/或蛋白的數(shù)量。在排列檢驗(yàn)中，樣本標(biāo)簽隨機(jī)排列于要被比較的兩個(gè)等級(jí)之間，并重新計(jì)算每個(gè)基因和/或蛋白的Fisher比率。樣本標(biāo)簽的隨機(jī)排列重復(fù)進(jìn)行1,000次。從實(shí)際數(shù)據(jù)中獲得的Fisher比率被設(shè)定為基于隨機(jī)數(shù)據(jù)的Fisher比率分布的Ps。從基于隨機(jī)數(shù)據(jù)的Fisher比率的分布，篩選通過(guò)隨機(jī)排列檢驗(yàn)測(cè)定的在兩個(gè)等級(jí)之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的基因和/或蛋白。更特別的，篩選隨機(jī)排列檢驗(yàn)中兩個(gè)等級(jí)之間P值小于0.005的基因和/或蛋白。在這些篩選出的基因和/或蛋白中，進(jìn)一步篩選出在非癌肝臟(L0)和癌前肝臟(L1)、癌前肝臟(L1)和良好分化HCC(G1)、良好分化HCC(G1)和中等分化HCC(G2)、中等分化HCC(G2)和不良分化HCC(G3)之間的每個(gè)比較中具有最高Fisher比率的40個(gè)基因和/或蛋白。
利用最小距離分類法(minimum distance classifier)和自編圖譜(SOM)驗(yàn)證篩選獲得的40個(gè)基因和/或蛋白從癌前肝臟(L1)中區(qū)分非癌肝臟(L0)、從良好分化HCC(G1)中區(qū)分癌前肝臟(L1)、從中等分化HCC(G2)中區(qū)分良好分化HCC(G1)、從不良分化HCC(G3)中區(qū)分中等分化HCC(G2)的能力。
使用每個(gè)轉(zhuǎn)變階段中上述40個(gè)篩選獲得的基因和/或蛋白來(lái)設(shè)計(jì)最小距離分類法使用來(lái)自兩個(gè)等級(jí)的全部訓(xùn)練樣本正規(guī)化每個(gè)基因和/或蛋白的表達(dá)水平以使得具有零平均值和單位方差。測(cè)量樣本和每個(gè)均值向量之間的歐幾理得距離(Euclidean distance)后，樣本指定至最近的均值向量的等級(jí)。用在每個(gè)轉(zhuǎn)化階段中上述篩選獲得的40個(gè)基因和/或蛋白創(chuàng)建的最小距離分類法也可用于預(yù)測(cè)分化等級(jí)尚未測(cè)定的HCC樣本的分化等級(jí)。為了診斷HCCs的分化等級(jí)，使用上文所述的μj(A)和μj(B)，由等級(jí)A和B組成的混合集合中基因j的樣本均值μj由下式獲得μj=NANA+NBμj(A)+NBNA+NBμj(B)]]>其中Nj為來(lái)自等級(jí)i的樣本數(shù)量。接下來(lái)，由等級(jí)A和B組成的混合集合中基因j的樣本方差σ2j由下式獲得σ=1NA+NB-1[(NA-1)σ2j(A)+(NB-1)σ2j(B)+NANBNA+NB(μj(A)-μj(B))2]]]>使用μj和σ2j，μ和v定義為μ＝[μ1，μ2，...，μ40]T1σ1---0]]>V=1σ2]]>0---1σ40]]>
而后，樣本x正規(guī)化為x＝VT(x-μ)其中x為正規(guī)化的樣本。使用正規(guī)化樣本，獲得每個(gè)等級(jí)的樣本均值向量。在最小距離分類法中，分值通過(guò)下式計(jì)算T1(x)＝‖x-μL0‖2-‖x-μL1‖2T2(x)＝‖x-μL1‖2-‖x-μG1‖2T3(x)＝‖x-μG1‖2-‖x-μG2‖2T4(x)＝‖x-μG2‖2-‖x-μG3‖2使用四個(gè)最小距離分類法，HCCs的分化等級(jí)可以如下進(jìn)行診斷(i)如果T1(x)＜0、T2(x)＜0、T3(x)＜0且T4(x)＜0，那么將正規(guī)化樣本x分類到等級(jí)L0。
(ii)如果T1(x)＞0、T2(x)＜0、T3(x)＜0且T4(x)＜0，那么將正規(guī)化樣本x分類到等級(jí)L1。
(III)如果T1(x)＞0、T2(x)＞0、T3(x)＜0且T4(x)＜0，那么將正規(guī)化樣本x分類到等級(jí)G1。
(iv)如果T1(x)＞0、T2(x)＞0、T3(x)＞0且T4(x)＜0，那么將正規(guī)化樣本x分類到等級(jí)G2。
(v)如果T1(x)＞0、T2(x)＞0、T3(x)＞0且T4(x)＞0，那么將正規(guī)化樣本x分類到等級(jí)G3。
SOM為一種廣泛應(yīng)用于聚類的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法，其公知為進(jìn)行多維數(shù)據(jù)可視化的有效工具(Tamayo，P.et al.Interpreting patterns of gene expressionwith self-organizing mapsmethods and application to hematopoieticdifferentiation，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96，2907-2912(1999)and Sultan，M.et al.Binary tree-structured vector quantization approach to clustering andvisualizing microarray data，Bioinformatics Suppl1，S111-S119(2002))。根據(jù)含有SOM工具箱(toolbox)的MATLAB R13的方法實(shí)現(xiàn)具有全部上述篩選獲得的40個(gè)基因和/或蛋白的SOM，該工具箱可以從網(wǎng)址http//www.cis.hut.fi//projects/somtoolbox/獲得(Kohonen，2001)。
其表達(dá)在從非癌肝臟(L0)到癌前肝臟(L1)、從癌前肝臟到良好分化HCC(G1)、從良好分化HCC(G1)到中等分化HCC(G2)、從中等分化HCC(G2)到不良分化HCC(G3)的轉(zhuǎn)變期間明顯改變的每組四十個(gè)基因和/或蛋白被用于診斷HCC的肝癌發(fā)生等級(jí)，并且還被用于篩選用于各個(gè)等級(jí)HCC治療的抗癌劑。
其表達(dá)在從非癌肝臟(L0)到癌前肝臟(L1)、從癌前肝臟到良好分化HCC(G1)、從良好分化HCC(G1)到中等分化HCC(G2)、從中等分化HCC(G2)到不良分化HCC(G3)的轉(zhuǎn)變期間明顯改變的每組四十個(gè)基因和/或蛋白在細(xì)菌、真核細(xì)胞和無(wú)細(xì)胞體系(cell-free systems)中加以表達(dá)。通過(guò)監(jiān)測(cè)表達(dá)和/或功能來(lái)篩選出影響基因和/或蛋白表達(dá)和/或功能的藥劑。還獲得蛋白的單克隆抗體并將其用于治療不同等級(jí)的HCC。如同單克隆抗體一樣，還可以獲得純化蛋白的完整小鼠單克隆抗體(whole mouse monoclonal antibodies)、人源抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、二價(jià)單鏈抗體和/或雙特異性抗體，并且它們被用于診斷HCC等級(jí)及其治療。
還構(gòu)建了檢測(cè)基因和/或蛋白表達(dá)的試劑盒。該試劑盒由包括用于RNA提取的試劑、用于合成cDNA和cRNA的酶、DNA芯片、寡核苷酸芯片、蛋白芯片、用于基因的探針和引物、對(duì)照基因的DNA片段和蛋白的抗體的成分組成。試劑盒的組成成分可以容易的從市場(chǎng)上購(gòu)得。


圖1圖解了152個(gè)在從L0到L1的轉(zhuǎn)變期間其表達(dá)明顯改變的基因(a)、191個(gè)在從L1到G1的轉(zhuǎn)變期間其表達(dá)明顯改變的基因(b)、54個(gè)在從G1到G2的轉(zhuǎn)變期間其表達(dá)明顯改變的基因(c)和40個(gè)在從G2到G3的轉(zhuǎn)變期間其表達(dá)明顯改變的基因(d)表達(dá)的彩色顯示。圖板e(cuò)、f、g和h圖示了所有樣本中所選的40個(gè)基因在每個(gè)轉(zhuǎn)變階段的表達(dá)。顯示出所選的在從L0到L1(e)、從L1到G1(f)、從G1到G2(g)、從G2到G3(h)轉(zhuǎn)變期間其表達(dá)明顯改變的40個(gè)基因的表達(dá)。在每個(gè)轉(zhuǎn)變階段中所選的40個(gè)基因?qū)D(zhuǎn)變之前和之后的樣本加以區(qū)分。基因以Fisher比率的降序顯示并且用GenBank登記號(hào)標(biāo)示。
每個(gè)樣本的名稱標(biāo)示在每個(gè)照片(e-h)的頂部；從左起為NL-64，NL-65，NL-66，NL-67，NL-68，NL-69，IL-49，IL-58，IL-59，IL-60，IL-62，G1-26T，G1-42T，G1-85T，G1-86T，G1-87T，G1-147T，G1-165T，G2-1T，G2-2T，G2-6T，G2-8T，G2-10T，G2-12T，G2-16T，G2-18T，G2-20T，G2-22T，G2-23T，G2-27T，G2-28T，G2-29T，G2-31T，G2-34T，G2-37T，G2-43T，G2-45T，G2-46T，G2-49T，G2-58T，G2-59T，G2-60T，G2-62T，G2-89T，G2-90T，G2-105T，G2-151T，G2-155T，G2-161T，G2-162T，G2-163T，G2-171T，G2-182T，G3-19T，G3-21T，G3-25T，G3-35T，G3-80T，G3-81T，G3-107T，G3-174T。
每個(gè)基因的名稱標(biāo)示在照片的右側(cè)。在圖板e(cuò)中，從頂部起為M18533，AF035316，AL049942，L27479，“纖連蛋白，(Fibronectin)，Alt.剪接(Splice)1”，U19765，X55503，AL046394，AB007886，AL050139，AF012086，AI539439，M19828，U92315，D76444，X02761，AF001891，AI400326，AI362017，L13977，D32053，AF038962，AL008726，J03909，Z69043，AL080080，M63138，L09159，AF017115，M13560，M36035，U47101，U81554，M21186，D32129，AL022723，M83664，U50523，M81757，AF102803。在圖板f中，從頂部起為M93221，AF079221，V01512，D88587 U12022，AF055376，R93527，R92331，U83460，AF052113，H68340，M10943，M13485，U75744，X02544，M93311，Z24725，U22961，M62403，M35878，U84011，AF055030，L13977，D13891，M63175，AB023157，U20982，M14058，AL049650，U61232，AI991040，U64444，D63997，X55503，AL080181，X76228，AB018330，D76444，U70660，U10323。在圖板g中，從頂部起為M87434，M12963，AI625844，M97936，Z99129，L07633，D50312，U07364，AA883502，M97935，AF061258，AB007447，M97935，W28281，M97935，Y00281，D28118，AF104913，AA675900，L27706，D32050，M63573，AF014398，X70944，U70671，AA447263，AB014569，M23115，D38521，X00351，L11672，X82834，AB007963，U76247，X68560，AB015344，AB018327，AF004430，D14697，AB028449。在圖板h中，從頂部起為AA976838，Z11793，AB002311，Y18004，AL031230，AF002697，AB014596，U49897，AF070570，M80482，AI263099，U22961，Z24725，U77594，L34081，M88458，U68723，X92098，D10040，AB023194，AF001903，X96752，AB006202，M75106，Y12711，D14662，S87759，Z48199，AF088219，AA453183，D31767，AB000095，AB006782，M21186，AB002312，U44772，AI541308，Z49107，U77735，M38449。
圖2圖示了所選的40個(gè)基因在每個(gè)轉(zhuǎn)變階段區(qū)分HCC分化等級(jí)的有效性(validation)。
在每個(gè)轉(zhuǎn)變中，從L0到L1(a)，從L1到L2(b)，從G1到G2(c)，從G2到G3(d)，用顯示為紅色條狀的連續(xù)兩個(gè)分化等級(jí)中的樣本(訓(xùn)練樣本)構(gòu)建最小距離分類法，并且應(yīng)用于顯示為黑色條狀的余下分化等級(jí)中的樣本(測(cè)試樣本)。獲得的分類法以92％(a)、98％(b)、84％(c)和100％(d)的準(zhǔn)確率分類測(cè)試樣本。
圖3圖示了在從非癌肝臟(L0)到癌前肝臟(L1)、從癌前肝臟到良好分化HCC(G1)、從良好分化HCC(G1)到中等分化HCC(G2)、從中等分化HCC(G2)到不良分化HCC(G3)的轉(zhuǎn)變期間其表達(dá)改變的基因的自編圖譜(SOM)算法分析結(jié)果。
圖3a圖示了樣本的聚類(表1)。
SOM柵格中每個(gè)單元對(duì)應(yīng)一個(gè)聚類。相鄰單元的向量通常位于互相靠近的位置。
(m，n)，位于第m行第n列的單元的位標(biāo)。
NL-XX，來(lái)自沒有HCV感染的非癌肝臟(L0)的樣本；IL-XX，來(lái)自HCV感染的癌前肝臟(L1)的樣本；G1-XxT，來(lái)自良好分化HCC(G1)的樣本；G2-XXT，來(lái)自中等分化HCC(G2)的樣本；G3-XXT，來(lái)自中等分化HCC(G3)的樣本。
圖譜顯示樣本按照L0、L1、G1、G2和G3的順序清晰地形成S形曲線(sigmoid curve)。沒有血管纏繞(vessel involvement)的G2樣本(藍(lán)色字母)位于接近G1樣本的位置，具有血管纏繞的G2樣本(紅色字母)位于接近G3樣本的位置。
圖3b圖示了相鄰聚類間的距離。
(m，n)，位于第m行第n列的單元的位標(biāo)。
單元的顏色顯示了相鄰聚類間的距離；紅色表示長(zhǎng)距離。上部區(qū)域的紅色單元清楚地表示非腫瘤(非癌和癌前)肝臟樣本與HCC樣本之間在所有所選的40個(gè)基因中相隔相對(duì)較遠(yuǎn)。
表1顯示樣本的聚類，其表示如圖3a所示的L0、L1、G1、G2和G3。
表2顯示本發(fā)明使用的HCC的臨床病理學(xué)因素。
表3顯示在L0和L1中最優(yōu)的40個(gè)具辨別力基因。
表4顯示在L1和G1中最優(yōu)的40個(gè)具辨別力基因。
表5顯示在G1和G2中最優(yōu)的40個(gè)具辨別力基因。
表6顯示在G2和G3中最優(yōu)的40個(gè)具辨別力基因。
實(shí)施本發(fā)明的最佳模式下列實(shí)施例僅顯示識(shí)別和使用在非癌肝臟、癌前肝臟、良好分化HCC、中等分化HCC和不良分化HCC中區(qū)別表達(dá)的基因和/或蛋白的優(yōu)選方法。
在下文，本發(fā)明將使用實(shí)施例進(jìn)行特別的描述，但是，其并不構(gòu)成任何限定作用。
實(shí)施例1人組織的制備五十名患者于1997年5月至2000年8月間在Yamaguchi大學(xué)醫(yī)院進(jìn)行針對(duì)HCC的外科手術(shù)治療(surgical treatment)。手術(shù)前已經(jīng)獲得所有患者的書面同意。研究協(xié)議通過(guò)了Yamaguchi大學(xué)醫(yī)學(xué)院的“使用人類個(gè)體制度評(píng)審委員會(huì)”的批準(zhǔn)。所有50個(gè)患者對(duì)HCV抗體(HCVAb)血清反應(yīng)呈陽(yáng)性，對(duì)乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)血清反應(yīng)呈陰性。手術(shù)后對(duì)所有病例進(jìn)行HCC的組織病理學(xué)診斷。該組織病理學(xué)檢查顯示七名患者具有良好分化的HCC(G1)、35名具有中等分化的HCC(G2)、余下的八名具有不良分化的HCC(G3)。根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟TNM分類法檢測(cè)臨床病理學(xué)因子。使用Fisher′s精確檢驗(yàn)(Fisher′s exact test)、Student′s t檢驗(yàn)和Mann-Whitney′s U檢驗(yàn)來(lái)闡明在三個(gè)等級(jí)G1、G2和G3的HCC之間臨床病理特征的差異。P＜0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義的。
六個(gè)非癌肝臟樣本是從六名患者中獲得，這六名患者因良性或轉(zhuǎn)移的肝臟腫瘤進(jìn)行肝臟切除，并被證實(shí)具有組織學(xué)上正常的肝臟。他們?nèi)繉?duì)HbsAg和HCVAb血清反應(yīng)呈陰性。五個(gè)HCV感染的肝臟樣本也是從五名患有HCC的患者的非腫瘤區(qū)域制備得到的。所有的五個(gè)肝臟樣本被組織病理學(xué)診斷為慢性肝炎或肝硬化。手術(shù)前已獲得所有患者的書面同意。
實(shí)施例2HCCs的臨床病理特征組織學(xué)檢測(cè)顯示，在本研究使用的50個(gè)HCV相關(guān)的HCCs中，七個(gè)為良好分化的HCC(G1)、35個(gè)為中等分化的HCC(G2)、余下的八個(gè)為不良分化的HCC(G3)(表2)。G2和G3HCCs的腫瘤大小明顯大于G1HCC的腫瘤大小(Mann-Whitney′s U檢驗(yàn)中分別為p＝0.0007和p＝0.028)。在G2和G3HCCs中血管纏繞的發(fā)生率明顯高于G1HCC中的發(fā)生率(Fisher′s精確檢驗(yàn)中p＝0.038)。平行于從G1到G3的去分化，腫瘤階段更為進(jìn)展(Fisher′s精確檢驗(yàn)中p＝0.066)。因此，正如Kojiro所提出的一樣，本研究中使用的G1、G2和G3HCCs的每個(gè)類型均顯示相應(yīng)于去分化的特征，即腫瘤大小、遷移可能和腫瘤階段(Kojiro，M.Pathological evolution of early hepatocellularcarcinoma，Oncology 62，43-47(2002))。
實(shí)施例3從組織中提取RNA組織塊(大約125mm3)懸浮于TRIZOL(Life Technologies，Gaithersburg，USA，目錄號(hào)15596-018)或Sepasol-RNAI(Nacalai tesque，Kyoto，Japan，目錄號(hào)306-55)中，用Polytron(Kinematica，Littau，Switzerland)勻漿兩次(用最快速度進(jìn)行五秒)。加入氯仿后，組織勻漿以15,000xg離心10分鐘，收集含有RNA的水相。總的細(xì)胞RNA用異丙醇沉淀，用70％乙醇洗一次，懸浮于DEPC處理過(guò)的水(Life Technologies，Gaithersburg，USA，目錄號(hào)10813-012)中。用1.5單位的DNase I(Life Technologies，Gaithersburg，USA，目錄號(hào)18068-015)處理后，RNA用TRIZOL/氯仿再次提取，用乙醇沉淀，并溶解于DEPC處理過(guò)的水中。其后，根據(jù)廠商提供的用法指南使用RNeasy MiniKit(QIAGEN，Hilden，Germany，目錄號(hào)74104)去除小分子量核苷酸?？俁NA的品質(zhì)根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳后28S和18S核糖體RNA的比率進(jìn)行判斷。純化的總RNA于-80℃保存在70％的乙醇溶液中直至使用。
實(shí)施例4合成cDNA和標(biāo)記cRNA探針根據(jù)廠商提供的用法指南使用反向SuperScript Choice System(LifeTechnologies，Gaithersburg，USA，目錄號(hào)18090-019)合成cDNA。五微克純化的總RNA與oligo-dT引物(Sawady Technology，Tokyo，Japan)雜交，所述引物含有T7啟動(dòng)子的序列和200單位的SuperScriptII逆轉(zhuǎn)錄酶，而后于42℃溫育1小時(shí)。獲得的cDNA用苯酚/氯仿提取并用Phase Lock GelTMLight(Eppendor，Hamburg，Germany，目錄號(hào)0032005.101)純化。
根據(jù)廠商提供的用法指南，通過(guò)使用MEGAscript T7試劑盒(Ambion，Austin，USA，目錄號(hào)1334)以cDNA為模板合成cRNA。大約5μg的cDNA在37℃與2μl的酶混合物一起培養(yǎng)6小時(shí)，酶混合物中含有T7聚合酶、腺苷三磷酸(ATP)和鳥苷三磷酸(GTP)各7.5mM、胞苷三磷酸(CTP)和尿苷三磷酸(UTP)各5.625mM以及Bio-11-CTP和Bio-16-UTP各1.875mM(分別為，ENZO Diagnostics，F(xiàn)armingdale，USA，目錄號(hào)42818 and 42814)。通過(guò)使用CHROMA SPIN+STE-100柱(CLONTECH，Palo Alto，USA，目錄號(hào)K1302-2)的柱層析去除單核苷酸和短的寡核苷酸，在洗出液中的cRNA通過(guò)加入乙醇進(jìn)行沉淀。cRNA的品質(zhì)根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳后cRNA的長(zhǎng)度進(jìn)行判斷。純化的cRNA于-80℃保存在70℃的乙醇溶液中直至使用。
實(shí)施例5在不同分化階段HCC的基因表達(dá)分析使用高密度寡核苷酸微陣列(U95A陣列，Affymetrix，Santa Clara，USA，目錄號(hào)510137)檢測(cè)來(lái)自神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的人原發(fā)性腫瘤的基因表達(dá)(Lipshutz，R.L.et al.High density synthetic oligonucleotide arrays，Nat.Genet.21，20-24(1999))。為了在芯片上與寡核苷酸雜交，cRNA于95℃在緩沖液中斷裂35分鐘，該緩沖液中含有40mM Tris(Sigma，St.Louis，USA，目錄號(hào)T1503)-乙酸(Wako，Osaka，Japan，目錄號(hào)017-00256)(pH8.1)、100mM乙酸鉀(Wako，Osaka，Japan，目錄號(hào)160-03175)和30mM乙酸鎂(Wako，Osaka，Japan，目錄號(hào)130-00095)。雜交在200μl緩沖液中于45℃進(jìn)行12小時(shí)，該緩沖液中含有0.1M 2-(N-嗎啉代)甲磺酸(MES)(Sigma，St.Louis，USA，目錄號(hào)M-3885)(pH6.7)、1M NaCl(Nacalai tesque，Kyoto，Japan，目錄號(hào)313-20)、0.01％polyoxylene(10)辛基苯基醚(polyoxylene octylphenyl ether)(Wako，Osaka，Japan，目錄號(hào)168-11805)、20μg鯡魚精DNA(Promega，Madison，USA，目錄號(hào)D181B)、100μg乙酰化牛血清蛋白(Sigma，St.Louis，USA，目錄號(hào)B-8894)、10μgcRNA片段和生物素化的對(duì)照寡核苷酸，生物素-5′-CTGAACGGTAGCATCTTGAC-3′(Sawady technology，Tokyo，Japan)。用含有0.01M MES(pH6.7)、0.1M NaCl和0.001％polyoxylene(10)辛基苯基醚緩沖液的緩沖液洗芯片后，芯片與生物素化的抗鏈霉親和素抗體(Funakoshi，Tokyo，Japan，目錄號(hào)BA0500)共孵育并如用法指南所述用鏈霉親和素R-藻紅蛋白(Molecular Probes，Eugene，USA，目錄號(hào)S-866)染色以增添雜交信號(hào)(Affymetrix，Santa Clara，USA)。用激光掃描儀(Affymetrix，Santa Clara，USA)收集每個(gè)象素水平，每個(gè)cDNA的表達(dá)水平和可靠性(存在/不存在比例)通過(guò)Affymetrix基因芯片3.3型和Affymetrix微陣列組4.0型軟件進(jìn)行計(jì)算。從這些實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)了神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的人原發(fā)性腫瘤中大約11,000個(gè)基因的表達(dá)。
實(shí)施例6寡核苷酸微陣列數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析篩選出在所有50個(gè)HCC樣本和11個(gè)非腫瘤(非癌和癌前)肝臟樣本中平均差額大于40(Affymetrix的規(guī)定單位)的基因。該步驟從大約11,000個(gè)基因中獲得3,559個(gè)基因。然后，測(cè)定Fisher比率(Iizuka，N.，Oka，M.，Yamada-Okabe，H.，Mori，N.，Tamesa，T.，Okada，T.，Takemoto，T.，Tangoku，A.，Hamada，K.，Nakayama，H.，Miyamoto，T.，Uchimura，S.，and Hamamoto，Y.Comparison of gene expression profiles between hepatitis B virus-and hepatitisC virus-infected hepatocellular carcinoma by oligonucleotide microarray databased on a supervised learning method，Cancer Res.62，3939-3944(2002)andLuo，J.，Duggan，D.J.，Chen，Y.，Sauvageot，J.，Ewing，C.M.，Bittner，M.L.，Trent，J.M.，and Isaacs，W.B.Human prostate cancer and benign prostatic hyperplasiamolecular dissection by gene expression profiling，Cancer Res.61，4683-4688(2001))，以將這些基因作為從L1中區(qū)分L0、從G1中區(qū)分L1、從G2中區(qū)分G1以及從G3中區(qū)分G2的辨別物進(jìn)行評(píng)價(jià)。將上述3，559個(gè)基因按照Fisher比率數(shù)值的降序排列。進(jìn)行隨機(jī)排列檢驗(yàn)以決定確定HCC分化等級(jí)的基因數(shù)量。隨機(jī)排列檢驗(yàn)的實(shí)施如前所述(Iizuka，N.，Oka，M.，Yamada-Okabe，H.，Mori，N.，Tamesa，T.，Okada，T.，Takemoto，T.，Tangoku，A.，Hamada，K.，Nakayama，H.，Miyamoto，T.，Uchimura，S.，and Hamamoto，Y.Comparison of gene expression profiles between hepaitis B virus-and hepatitisC virus-infected hepatocellular carcinoma by oligonucleotide microarray databased on a supervised learning method，Cancer Res.62，3939-3944(2002)andLuo，J.，Duggan，D.J.，Chen，Y.，Sauvageot，J.，Ewing，C.M.，Bittner，M.L.，Trent，J.M.，and Isaacs，W.B.Human prostate cancer and benign prostatic hyperplasiamolecular dissection by gene expression profiling，Cancer Res.61，4683-4688(2001))。在該檢驗(yàn)中，樣本標(biāo)簽隨機(jī)排列于兩個(gè)待考慮的等級(jí)間，并重新計(jì)算每個(gè)基因的Fisher比率。該樣本標(biāo)簽的隨機(jī)排列重復(fù)1,000次。從實(shí)際數(shù)據(jù)中獲得的Fisher比率被設(shè)定為基于隨機(jī)數(shù)據(jù)的Fisher比率分布的Ps。從基于隨機(jī)數(shù)據(jù)的Fisher比率的分布，篩選所有可通過(guò)隨機(jī)排列檢驗(yàn)(P＜0.005)的基因。在所有比較兩個(gè)等級(jí)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行該步驟。結(jié)果，152個(gè)Fisher比率高于4.90的基因是L0和L1之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的分辨物。類似的，識(shí)別了191個(gè)從G1中區(qū)分L1的Fisher比率高于4.08的基因，54個(gè)從G2中區(qū)分G1的Fisher比率高于1.52的基因，40個(gè)從G3中區(qū)分G2的Fisher比率高于1.34的基因。
實(shí)施例7篩選其表達(dá)與HCC分化等級(jí)相關(guān)的基因通過(guò)寡核苷酸陣列數(shù)據(jù)，分析腫瘤發(fā)生，即從非癌肝臟(L0)到HCV感染的癌前肝臟(L1)和從L1到良好分化HCC(G1)期間以及HCC去分化(G1到G2和G2到G3)期間基因表達(dá)的變化。通過(guò)有監(jiān)督的學(xué)習(xí)方法并隨后進(jìn)行識(shí)別了152個(gè)其表達(dá)水平在從L0到L1的轉(zhuǎn)變期間明顯變化的基因。在這152個(gè)基因中，在該轉(zhuǎn)變期間有67個(gè)上調(diào)，85個(gè)下調(diào)。用同樣的方式，識(shí)別了191個(gè)表達(dá)水平在從L1到G1HCC的轉(zhuǎn)變期間明顯變化的基因。在這191個(gè)基因中，在該轉(zhuǎn)變期間有95個(gè)上調(diào)，96個(gè)下調(diào)。54個(gè)基因在G1和G2HCCs之間顯示不同的表達(dá)，它們中，在從G1到G2的轉(zhuǎn)變期間36個(gè)基因的表達(dá)增加，18個(gè)基因的表達(dá)減少。40個(gè)基因在G2和G3HCCs之間產(chǎn)生不同的表達(dá)，它們中，在從G2到G3的轉(zhuǎn)變期間10個(gè)基因的表達(dá)增加，30個(gè)基因的表達(dá)減少。
為了檢測(cè)在腫瘤發(fā)生和HCC發(fā)展中每個(gè)等級(jí)所選基因的表現(xiàn)，發(fā)明人將這些基因的數(shù)據(jù)應(yīng)用于所有的樣本。結(jié)果，幾乎所有的在每個(gè)轉(zhuǎn)變階段所選的基因均適用于L0-L1轉(zhuǎn)變、L1-G1轉(zhuǎn)變、G1-G2轉(zhuǎn)變和G2-G3轉(zhuǎn)變。例如，從G1HCC中區(qū)分L1的191個(gè)基因能夠清楚的從HCCs(G1、G2和G3)中區(qū)分非腫瘤肝臟(L0和L1)(圖1)。該結(jié)果顯示所選基因加以變化了的水平在決定每個(gè)HCC病理等級(jí)中行使關(guān)鍵作用。
實(shí)施例8在從非癌癥肝臟(L0)到癌前肝臟(L1)轉(zhuǎn)變期間其表達(dá)變化了的基因在從L0到L1的轉(zhuǎn)變期間，大部分免疫應(yīng)答相關(guān)基因、代謝相關(guān)基因、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因、蛋白水解相關(guān)基因和腫瘤發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)增加，轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因的表達(dá)降低(表3)。
免疫應(yīng)答相關(guān)基因包括I類MHC家族(HLA-A、-C、-E和-F)、II類MHC家族(HLA-DPB1和HLA-DRA)、CD74、NK4、LILRB1、FCGR3B和IFI30。干擾素(IFN)可誘導(dǎo)的基因，如IFI30，的上調(diào)可以代表宿主對(duì)病毒感染的抵抗；然而，需要注意的是如下文章節(jié)所述的，幾種IFN相關(guān)基因在G1到G2的去分化期間是降低的(見實(shí)施例10)。
代謝相關(guān)基因包括KARS、ALDOA、ASAH、MPI和GAPD。KARS和ALDOA水平的增加分別增強(qiáng)了蛋白生物合成和糖酵解。ASAH、MPI和GAPD的上調(diào)分別增加了脂肪酸、甘露糖和甘油醛的生物合成。
轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因包括VDAC3、SSR4、BZRP和ATOX1。SSR4負(fù)責(zé)新合成的多肽的有效轉(zhuǎn)運(yùn)。ATOX1為銅轉(zhuǎn)運(yùn)體(copper transporter)，并且其表達(dá)的增強(qiáng)導(dǎo)致各種代謝途徑的激活，因?yàn)樵S多酶需要銅離子作為酶活性的輔助因子。
蛋白水解相關(guān)基因包括CST3和CTSD。CST3涉及血管的形成。在可能發(fā)育出癌前肝小結(jié)(hepatic nodules)的肝硬化患者中觀察到CTSD蛋白血清水平的增加(Leto，G.，Tumminello，F(xiàn).M.，Pizzolanti，G.，Montalto，G.，Soresi，M.，Ruggeri，I.，and Gebbia，N.Cathepsin D serum mass concentrations inpatients with hepatocellular carcinoma and/or liver cirrhosis，Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.34，555-560(1996))。
腫瘤發(fā)生相關(guān)基因包括MBD2、RPS19、RPS3、RPS15和RPS12。DNA甲基化是一種在許多惡性腫瘤中常見的后生(epigenetic)變化，因此，DNA甲基化模式通過(guò)甲基化和去甲基化的酶過(guò)程進(jìn)行檢測(cè)。MBD2的上調(diào)(所述MBD2抑制從甲基化DNA轉(zhuǎn)錄)在下調(diào)在啟動(dòng)子區(qū)域具有甲基化DNA的腫瘤抑制基因中起著重要作用。
在從L0到L1的轉(zhuǎn)變過(guò)程中可以觀察到轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因，RB1CC1的下調(diào)。RB1CC1蛋白是腫瘤抑制基因RB1的主要調(diào)控因子，因此RB1CC1水平的下降能夠通過(guò)降低RB1蛋白的活性促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。
因此，HCV感染的癌前肝臟的特征在于這些基因表達(dá)的改變，這表明肝癌發(fā)生的起始出現(xiàn)在HCV感染期間。在從L0到L1的轉(zhuǎn)變期間其表達(dá)改變的基因中，那些涉及蛋白質(zhì)水解和腫瘤形成的基因可以作為分子目標(biāo)用于化學(xué)預(yù)防HCV相關(guān)的HCC。
實(shí)施例9在從癌前肝臟(L1)至良好分化HCC(G1)轉(zhuǎn)變的過(guò)程中其表達(dá)改變的基因在從L1至G1改變的過(guò)程中其表達(dá)改變的基因包括大部分與腫瘤形成相關(guān)的基因、與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因、與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因、與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因、與解毒作用相關(guān)的基因、以及與免疫應(yīng)答相關(guān)的基因(表4)。
與腫瘤形成相關(guān)的基因，諸如能夠誘導(dǎo)一些癌細(xì)胞凋亡的BNIP3L、FOS、MAF和IGFBP3，以及作為IGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的抑制劑的IGFBP4，其在轉(zhuǎn)變的過(guò)程中被下調(diào)，這表明這些基因的下調(diào)對(duì)肝癌發(fā)生的促進(jìn)也是重要的。之前的報(bào)道也顯示出IGFBP3和IGFBP4在HCC中與非腫瘤肝臟相比表達(dá)降低(Okabe，H.，Satoh，S.，Kato，T.，Kitahara，O.，Yanagawa，R.，Yamaoka，Y.，Tsunoda，T.，F(xiàn)urukawa，Y.，and Nakamura，Y.Genome-wideanalysis of gene expression in human hepatocellular carcinomas using cDNAmicroarrayidentification of genes involved in viral carcinogenesis and tumorprogression，Cancer Res.61，2129-2137(2001)and Delpuech，O.，Trabut，J.B.，Carnot，F(xiàn).，F(xiàn)euillard，J.，Brechot，C.，and Kremsdorf，D.Identification，usingcDNA macroarray analysis，of distinct gene expression profiles associated withpathological and virological features of hepatocellular carcinoma，Oncogene21，2926-2937(2002))。本發(fā)明的數(shù)據(jù)提供了另外的發(fā)現(xiàn)，這兩種基因的下調(diào)在良好分化的HCC中已經(jīng)出現(xiàn)。MAF作為細(xì)胞分化的調(diào)控因子發(fā)揮作用。BNIP3L通過(guò)抑制BCL2的活性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在一些情況下，F(xiàn)OS的表達(dá)似乎與凋亡細(xì)胞死亡相關(guān)。因此，這五種基因的下調(diào)可能在慢性HCV感染之后引發(fā)肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。
與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因諸如CAMKK2、GMFB、RALBP1、CDIPT、ZNF259和RAC1，以及與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因諸如DRAP1、ILF2、BMI1、和PMF1在從L1至G1轉(zhuǎn)變的過(guò)程中被上調(diào)。其它與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因諸如CALM1、RAB14、TYROBP、和MAP2K1在該轉(zhuǎn)變中被下調(diào)。在G1 HCC中TYROBP的下調(diào)可以反映出減弱的免疫應(yīng)答。涉及各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因表達(dá)的改變可以反映出起源于HCV感染的癌前肝臟的良好分化HCC的真實(shí)情況。
在從L1至D1轉(zhuǎn)變的過(guò)程中，與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因諸如TBCE、ATP6V1E、ATOX1和SEC61G被上調(diào)，而那些諸如SLC31A1和DDX19被下調(diào)。細(xì)胞內(nèi)銅轉(zhuǎn)運(yùn)體(copper transporter)ATOX1在從L0至L1轉(zhuǎn)變的過(guò)程中被上調(diào)，在從L1至G1轉(zhuǎn)變的過(guò)程中進(jìn)一步被上調(diào)。由于額外的銅對(duì)肝細(xì)胞而言是有毒的或者甚至是致死的，ATOX1基因的不同的表達(dá)改變了細(xì)胞內(nèi)銅離子的濃度，因此促進(jìn)了DNA損傷和細(xì)胞損傷。事實(shí)上，最近的研究顯示出銅-鰲合劑試劑在鼠HCC異種移植模型中對(duì)腫瘤發(fā)展的預(yù)防作用(Yoshii，J.，Yoshiji，H.，Kuriyama，S.，Ikenaka，Y.，Noguchi，R.，Okuda，H.，Tsujinoue，H.，Nakatani，T.，Kishida，H.，Nakae，D.，Gomez，D.E.，De Lorenzo，M.S.，Tejera，A.M.，和Fukui，H.The copper-chelating agent，trientine，suppresses tumordevelopment and angiogenesis in the murine hepatocellular carcinoma cells，Int.J.Cancer.94，768-773(2001))。
DNA損傷和細(xì)胞損傷可能通過(guò)抗氧化劑基因CAT和與解毒作用相關(guān)的基因諸如MT1H、MT1E、MT1F、MT1B、MT3、和UGT2B7的下調(diào)而增加，從而促進(jìn)HCC的去分化。
使用抗透明質(zhì)烷受體-1抗體，Carreira等顯示出在HCC中的淋巴管的數(shù)量比在非腫瘤肝臟組織諸如肝硬化中的少(Mouta Carreira，C.，Nasser，S.M.，di Tomaso，E.，Padera，T.P.Boucher，Y.，Tomarev，S.I.，and Jain，R.K.LYVE-1isnot restricted to the lymph vesselsexpression in normal liver blood sinusoidsand down-regulation in human liver cancer and cirrhosis，Cancer Res.61，8079-8084(2001))。在本發(fā)明中，與免疫應(yīng)答相關(guān)的基因諸如ORM1、C1R、C6、IL4R、C8B、和C1S的表達(dá)在從L1至G1的轉(zhuǎn)變過(guò)程中降低，表明在從L1至G1的轉(zhuǎn)變過(guò)程中HCC內(nèi)微環(huán)境發(fā)生了變化。如同之前報(bào)道的，編碼補(bǔ)體組分的許多基因在該轉(zhuǎn)變過(guò)程中被下調(diào)(Okabe，H.，Satoh，S.，Kato，T.，Kitahara，O.，Yanagawa，R.，Yamaoka，Y，Tsunoda，T.，F(xiàn)urukawa，Y，andNakamura，Y.Genome-wide analysis of gene expression in human hepatocellularcarcinomas using cDNA microarrayidentification of genes involved in viralcarcinogenesis and tumor progression，Cancer Res.61，2129-2137(2001)andIizuka，N.，Oka，M.，Yamada-Okabe，H.，Mori，N.，Tamesa，T.，Okada，T.，Takemoto，T.，Tangoku，A.，Hamada，K.，Nakayama，H.，Miyamoto，T.，Uchimura，S.，and Hamamoto，Y.Comparison of gene expression profiles between hepatitisB virus-and hepatitis C virus-infected hepatocellular carcinoma byoligonucleotide microarray data based on a supervised learning method，CancerRes.62，3939-3944(2002))。
實(shí)施例10在從良好分化HCC(G1)至中等分化HCC(G2)轉(zhuǎn)變的過(guò)程中其表達(dá)改變的基因在從G1至G2轉(zhuǎn)變的過(guò)程中其表達(dá)變化的基因包括與IFN相關(guān)的基因、與細(xì)胞結(jié)構(gòu)和活動(dòng)性相關(guān)的基因、與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因、以及腫瘤抑制基因(表5)。
在從G1至G2的轉(zhuǎn)變過(guò)程中，最顯著的遺傳學(xué)的改變似乎是與IFN相關(guān)的基因諸如OAS2、STAT1、PSME1、ISGF3G、和PSMB9的下調(diào)。在前列腺癌細(xì)胞中也觀察到了類似的遺傳學(xué)的改變(Shou，J.，Soriano，R.，Hayward，S.W.，Cunha，G.R.，Williams，P.M.，and Gao，W.Q.Expressionprofiling of a human cell line model of prostatic cancer reveals a directinvolvement of interferon signaling in prostate tumor progression，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99，2830-2835(2002))。IFN不僅作為抗病毒試劑還作為抗癌試劑；然而，某種類型的HCC對(duì)IFN沒有應(yīng)答。與IFN相關(guān)的基因的下調(diào)可以減弱腫瘤細(xì)胞對(duì)IFN的應(yīng)答，這暗示在從G1至G2的轉(zhuǎn)變的過(guò)程中利用了HCC對(duì)IFN的抗藥性。在與IFN相關(guān)的基因中，STAT1在我們的從G2中區(qū)分G1的辨別物列表中出現(xiàn)了四次(表5)。與相同家族的其它基因不同，STAT1功能為腫瘤抑制基因(Bromberg，J.F.Activation of STAT proteinsand growth control，Bioessays 23，161-169(2001))。有趣的是，IFN治療增加了在肝細(xì)胞中STAT1以及許多IFN相關(guān)基因的表達(dá)(Radaeva，S.，Jaruga，B.，Hong，F(xiàn).，Kim，W.H.，F(xiàn)an，S.，Cai，H.，Strom，S.，Liu，Y，El-Assal，O.，and Gao，B.Interferon-alpha activates multiple STAT signals and down-regulates c-Met inprimary human hepatocytes，Gastroenterology 122，1020-1034(2002))。在由丁酸鈉誘導(dǎo)的分化中可觀察到HCC細(xì)胞系內(nèi)STAT1的上調(diào)(Hung，W.C.andChuang，L.Y Sodium butyrate enhances STAT 1 expression in PLC/PRF/5hepatoma cells and augments their responsiveness to interferon-alpha，Br.J.Cancer 80，705-710(1999))。STAT1為IGFBP3的IGF-獨(dú)立凋亡作用的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)(Spagnoli，A.，Torello，M.，Nagalla，S.R.，Horton，W.A.，Pattee，P.，Hwa，V.，Chiarelli，F(xiàn)，Roberts，C.T.Jr.，and Rosenfeld，R.G.Identification of STAT-1 as amolecular target of IGFBP-3 in the process of chondrogenesis，J.Biol.Chem.277，18860-18867(2002))，而IGFBP3在從L1至G1的轉(zhuǎn)變過(guò)程中被下調(diào)，這些事實(shí)有力地表明在從G1至G2HCC的轉(zhuǎn)變過(guò)程中STAT1的表達(dá)降低促進(jìn)了HCC的進(jìn)一步去分化。
涉及各種生物學(xué)過(guò)程包括細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和致病的轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因TRIM16以及促進(jìn)細(xì)胞增殖的腫瘤抑制基因TPD52L2在從G1至G2的轉(zhuǎn)變過(guò)程中也被上調(diào)。在G2HCC中這些基因的上調(diào)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵入。
實(shí)施例11在從中等分化HCC(G2)至不良分化HCC(G3)轉(zhuǎn)變的過(guò)程中其表達(dá)改變的基因在從G2至G3轉(zhuǎn)變的過(guò)程中其表達(dá)改變的基因包括與蛋白水解作用相關(guān)的基因、與BCL2相關(guān)的基因、以及與新陳代謝和能量產(chǎn)生相關(guān)的基因(表6)。
SPINT1和LGALS9在從G2至G3的轉(zhuǎn)變過(guò)程中出現(xiàn)上調(diào)。SPINT1涉及受損的組織中肝細(xì)胞增長(zhǎng)因子(HGF)蛋白水解活性的調(diào)節(jié)。之前，Nagata等指出反義SPINT1(HAI-1)的轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制了人類肝細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，這表明SPINT1在HCC的發(fā)展過(guò)程中起到重要的作用(Nagata，K.，Hirono，S.，Ido，A.，Kataoka，H.，Moriuchi，A.，Shimomura，T.，Hori，T.，Hayashi，K.，Koono，M.，Kitamura，N.，and Tsubouchi，H.Expressi on of hepatocyte growth factoractivator and hepatocyte growth factor activator inhibitor type 1 in humanhepatocellular carcinoma，Biochem.Biophys.Res.Commun.289，205-211(2001)).LGALS9屬于植物凝血素家族，其涉及細(xì)胞粘著、細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、炎癥、免疫調(diào)節(jié)、凋亡和轉(zhuǎn)移。幾種半乳凝集素(galectins)被認(rèn)為與癌細(xì)胞粘著相關(guān)(Ohannesian，D.W.，Lotan，D.，Thomas，P.，Jessup，J.M.，F(xiàn)ukuda，M.，Gabius，H.J.，and Lotan，R.Carcinoembryonic antigen and otherglycoconjugates act as ligands for galectin-3in human colon carcinoma cells，Cancer Res.55，2191-2199(1995))。
BINP3，一種與BCL2相關(guān)的基因，其在從G2至G3的轉(zhuǎn)變過(guò)程中被下調(diào)。BNIP3與BNIP3L有56％的氨基酸序列同一性。如上文所提到的，BNIP3L的表達(dá)在從L1至G1的轉(zhuǎn)變過(guò)程中降低。由于BCL2的功能為抗凋亡因子，BNIP3L和BNIP3的下調(diào)促進(jìn)了腫瘤發(fā)生，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的去分化。
很多與新陳代謝和能量產(chǎn)生相關(guān)的基因在該轉(zhuǎn)變過(guò)程中也被下調(diào)。此外，PGRMC1的表達(dá)在從G2至G3的轉(zhuǎn)變過(guò)程中也降低了，PGRMC1編碼結(jié)合至孕酮和RARRES2的在肝臟中含量豐富的蛋白。RARRES2表達(dá)的降低可能導(dǎo)致G3HCC對(duì)視黃酸應(yīng)答不良。
實(shí)施例12在每個(gè)轉(zhuǎn)變階段中所選基因表達(dá)的彩色顯示在L0至L1轉(zhuǎn)變的過(guò)程中其表達(dá)顯著改變的152個(gè)基因(圖1a)、在從L1至G1轉(zhuǎn)變的過(guò)程中其表達(dá)顯著改變的191個(gè)基因(圖1b)、在從G1至G2轉(zhuǎn)變的過(guò)程中其表達(dá)顯著改變的54個(gè)基因(圖1c)、以及在從G2至G3轉(zhuǎn)變的過(guò)程中其表達(dá)顯著改變的40個(gè)基因(圖1d)的表達(dá)通過(guò)彩色顯示表示。這些基因清楚地區(qū)分了兩個(gè)連續(xù)分化等級(jí)中的樣本。圖1e-h表明在所有的樣本中每個(gè)轉(zhuǎn)變階段中所選的40個(gè)基因的表達(dá)。所選的在從L0至L1(圖1e)、從L1至G1(圖1f)、從G1至G2(圖1g)、和從G2至G3(圖1h)轉(zhuǎn)變的過(guò)程中表達(dá)顯著改變的40個(gè)基因的表達(dá)也通過(guò)彩色顯示表示。每個(gè)轉(zhuǎn)變階段中所選的40個(gè)基因區(qū)分了轉(zhuǎn)變之前和之后的樣本。
實(shí)施例13確認(rèn)每個(gè)轉(zhuǎn)變階段中所選的用于區(qū)分HCC分化等級(jí)的40個(gè)基因?yàn)榱舜_認(rèn)在每個(gè)轉(zhuǎn)變階段所選的40個(gè)基因的辨別性能，創(chuàng)建了每個(gè)轉(zhuǎn)變階段中所選40個(gè)基因的最小距離分類法。在每個(gè)轉(zhuǎn)變中，根據(jù)以紅色條狀顯示的連續(xù)兩個(gè)分化等級(jí)中的樣本(訓(xùn)練樣本)構(gòu)建最小距離分類法，并將其應(yīng)用于以黑色條狀顯示的余下的分化等級(jí)中的樣本(測(cè)試樣本)(圖2)。所獲得的分類法以92％(圖2a)、98％(圖2b)、84％(圖2c)、和100％(圖2d)的精確率分類測(cè)試樣本。
實(shí)施例14利用在從非癌肝臟(L0)至癌前肝臟(L1)、從癌前肝臟(L1)至良好分化HCC(G1)、從良好分化HCC(G1)至中等分化HCC(G2)、以及從中等分化HCC(G2)至不良分化HCC(G3)轉(zhuǎn)變過(guò)程中其表達(dá)改變的基因的自編圖譜(SOM)算法進(jìn)行的分析在非癌肝臟(L0)和癌前肝臟(L1)、癌前肝臟(L1)和良好分化HCC(G1)、良好分化HCC(G1)和中等分化HCC(G2)、以及中等分化HCC(G2)和不良分化HCC(G3)之間其表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著不同的基因的表達(dá)根據(jù)帶有SOM工具箱的MATLAB R13的方法進(jìn)行分析，該工具箱可在網(wǎng)址http//www.cis.hut.fi/projects/somtoolbox/中獲得(Kohonen，2001)。在非癌肝臟(L0)和癌前肝臟(L1)、癌前肝臟(L1)和良好分化HCC(G1)、良好分化HCC(G1)和中等分化HCC(G2)、以及中等分化HCC(G2)和不良分化HCC(G3)之間的每個(gè)對(duì)比中使用40個(gè)基因。相鄰單元的向量在155維(dimentional)基因空間中位置彼此靠近(圖3a)，其中(m，n)表示該單元位于在第m行和第n列，NL-XX表明無(wú)HCV感染的非癌肝臟(L0)中獲得的樣本，IL-XX表示從HCV感染的癌前肝臟(L1)中獲得的樣本，G1-XXT表示從良好分化HCC(G1)中獲得的樣本，G2-XXT表示從中等分化HCC(G2)中獲得的樣本，G3-XXT表示從中等分化HCC(G3)中獲得的樣本。圖譜顯示出樣本按照L0、L1、G1、G2和G3的順序清晰地形成S狀曲線。無(wú)血管纏繞的G2樣本(藍(lán)色字母)位于靠近G1樣本的位置而有血管纏繞的G2樣本(紅色字母)位于靠近G3樣本的位置(圖3a)。無(wú)靜脈侵害(venous invasion)的G2樣本位于靠近G1樣本的位置而有靜脈侵害的G2樣本位于靠近G3樣本的位置。因此，SOM將G2樣本按照去分化等級(jí)分為兩種亞型，即，具有靜脈侵害的腫瘤和不具有靜脈侵害的腫瘤。鄰近的聚類之間的距離通過(guò)彩色顯示，其中紅色表示長(zhǎng)距離，在上部的區(qū)域中紅色單元清楚地證明了非腫瘤(非癌和癌前)肝臟和HCC樣本在155維(dimentional)基因空間中相隔相對(duì)較遠(yuǎn)(圖3b)。
工業(yè)實(shí)用性肝細(xì)胞癌(HCC)是世界范圍內(nèi)最常見的癌癥之一。然而，還沒有能夠治愈該疾病的治療方法。這大概是由于在疾病的發(fā)展和進(jìn)展中癌細(xì)胞的特征連續(xù)改變。特別地，癌的進(jìn)展通常與腫瘤細(xì)胞的分化等級(jí)的變化相關(guān)。對(duì)癌細(xì)胞這種變化的診斷和控制將使得癌癥的治療更加有效。在本發(fā)明中，確定了其表達(dá)與HCC的腫瘤形成和發(fā)展相關(guān)的基因。采用有監(jiān)督的學(xué)習(xí)方法并隨后進(jìn)行隨機(jī)排列檢驗(yàn)來(lái)篩選在從無(wú)HCV感染的非癌肝臟(L0)至帶有HCV感染的癌前肝臟(L1)、從L1至良好分化HCC(G1)、從G1至中等分化HCC(G2)、以及從G2至不良分化HCC(G3)轉(zhuǎn)變過(guò)程中其表達(dá)顯著變化的基因。用所選的在每個(gè)轉(zhuǎn)變階段中其表達(dá)顯著改變的40個(gè)基因進(jìn)行的最小距離分類法和自編圖譜(SOM)可以正確地預(yù)測(cè)腫瘤組織的分化等級(jí)。因此，這些基因可以用于診斷HCC的分化等級(jí)和篩選用于每個(gè)分化等級(jí)中HCCs治療的抗癌劑。
表1.表示L0、L1、G1、G2和G3樣品的聚類.


表2.每個(gè)研究組的臨床病理學(xué)特征.

*，腫瘤分化、階段、和靜脈侵害在UICC的TNM分類的基礎(chǔ)上確定。
Fisher′s精確檢驗(yàn)，Student′s t檢驗(yàn)，和Mann-Whitney′s U檢驗(yàn)用于說(shuō)明在背景中在每個(gè)分化等級(jí)之間的區(qū)別.
N.S.，不顯著.
表3.在L0和L1中最佳的40個(gè)辨別基因.
在L1中與在L0中相比下調(diào)的18個(gè)基因


表3.在L0和L1中最佳的40個(gè)辨別基因.(續(xù))

在L1中與在L0中相比上調(diào)的22個(gè)基因

表3.在L0和L1中最佳的40個(gè)辨別基因.(續(xù))

表3.在L0和L1中最佳的40個(gè)辨別基因.(續(xù))

表4.在L1和G1中最優(yōu)選的40個(gè)辨別基因.
在G1中與在L1中相比下調(diào)的28個(gè)基因

表4.在L1和G1中最優(yōu)的40個(gè)辨別基因.(續(xù))

表4.在L1和G1中最佳的40個(gè)辨別基因.(續(xù))

在G1中與在L1中相比上調(diào)的12個(gè)基因

表4.在L1和G1中最佳的40個(gè)辨別基因.(續(xù))

表5.在G1和G2中最佳的40個(gè)辨別基因.
在G2中與在G1中相比下調(diào)的15個(gè)基因

表5.在G1和G2中最佳的40個(gè)辨別基因.(續(xù))

在G2中與在G1中相比上調(diào)的25個(gè)基因

表5.在G1和G2中最佳的40個(gè)辨別基因.(續(xù))

表5.在G1和G2中最佳的40個(gè)辨別基因.(續(xù))

表6.在G2和G3中最佳的40個(gè)辨別基因.
在G3中與在G2中相比下調(diào)的30個(gè)基因

表6.在G2和G3中最佳的40個(gè)辨別基因.(續(xù))

表6.在G2和G3中最佳的40個(gè)辨別基因.(續(xù))

在G3中與在G2中相比上調(diào)的10個(gè)基因

表6.在G2和G3中最優(yōu)選的40個(gè)辨別基因.(續(xù)前)

權(quán)利要求
1.確定腫瘤分化等級(jí)的方法，所述方法使用通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析而加以選擇的基因和/或蛋白，所述統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以可取自癌癥患者的人類腫瘤組織的基因和/或蛋白的表達(dá)水平或模式為基礎(chǔ)。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中人類組織為人類肝臟組織。
3.按照權(quán)利要求2的方法，其中腫瘤的分化等級(jí)選自非癌肝臟、癌前肝臟、良好分化的肝細(xì)胞癌(HCC)、中等分化的HCC、或不良分化的HCC。
4.按照權(quán)利要求3的方法，其中基因和/或蛋白在非癌肝臟和癌前肝臟、癌前肝臟和良好分化的肝細(xì)胞癌(HCC)、良好分化的HCC和中等分化的HCC、或者中等分化的HCC和不良分化的HCC之間表達(dá)不同。
5.按照權(quán)利要求1至4中任一的方法，其中基因和/或蛋白的表達(dá)水平或模式通過(guò)DNA微陣列、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)或者蛋白陣列的方法進(jìn)行檢測(cè)。
6.按照權(quán)利要求5的方法，其中基因和/或蛋白以Fisher比率遞減的順序進(jìn)行選擇。
7.按照權(quán)利要求5或者6的方法，其中基因和/或蛋白的數(shù)量在40和100之間。
8.按照權(quán)利要求5或者6的方法，其中基因和/或蛋白的數(shù)量在35和45之間。
9.按照權(quán)利要求8的方法，其中基因和/或蛋白的數(shù)量為40。
10.確定腫瘤的分化等級(jí)的方法，該方法包括以下步驟(a)選擇在非癌肝臟和癌前肝臟、癌前肝臟和良好分化的肝細(xì)胞癌(HCC)、良好分化的HCC和中等分化的HCC、或者中等分化的HCC和不良分化的HCC之間比較具有最高Fisher比率的基因和/或蛋白；(b)通過(guò)使用所述基因和/或蛋白確定腫瘤的分化等級(jí)。
11.確定腫瘤的分化等級(jí)的方法，該方法包括以下步驟(a)決定用來(lái)確定腫瘤分化等級(jí)的基因和/或蛋白的數(shù)量；(b)選擇多個(gè)在步驟(a)中決定的在非癌肝臟和癌前肝臟、癌前肝臟和良好分化的肝細(xì)胞癌(HCC)、良好分化的HCC和中等分化的HCC、或者中等分化的HCC和不良分化的HCC之間比較具有最高Fisher比率的基因和/或蛋白；(c)將在步驟(b)中選擇的基因和/或蛋白的數(shù)據(jù)應(yīng)用于所有樣本；以及(d)確定腫瘤的分化等級(jí)。
12.確定腫瘤的分化等級(jí)的方法，該方法包括以下步驟(a)決定用來(lái)確定腫瘤的分化等級(jí)的基因和/或蛋白的數(shù)量；(b)選擇多個(gè)在步驟(a)中決定的在非癌肝臟和癌前肝臟、癌前肝臟和良好分化的肝細(xì)胞癌(HCC)、良好分化的HCC和中等分化的HCC、或者中等分化的HCC和不良分化的HCC之間比較具有最高Fisher比率的基因和/或蛋白；(c)將在步驟(b)中選擇的基因和/或蛋白的數(shù)據(jù)應(yīng)用至所有樣本；(d)用在步驟(b)中選擇的基因和/或蛋白的數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)最小距離分類法；(e)將在步驟(d)中設(shè)計(jì)的最小距離分類法應(yīng)用至所有樣本；(f)用在步驟(b)中選擇的所有基因和/或蛋白的數(shù)據(jù)產(chǎn)生自編圖譜；(g)將在步驟(f)中產(chǎn)生的自編圖譜應(yīng)用至所有樣本；以及(h)確定腫瘤的分化等級(jí)。
13.實(shí)施按照權(quán)利要求1至12中的任一方法的試劑盒，該試劑盒中包含進(jìn)行DNA微陣列、寡核苷酸微陣列、蛋白陣列、RNA印跡法、RNase保護(hù)試驗(yàn)、蛋白質(zhì)印跡法和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)所必需的DNA芯片、寡核苷酸芯片、蛋白芯片、探針或引物，以檢測(cè)通過(guò)權(quán)利要求1至12中的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所選擇的基因和/或蛋白的表達(dá)。
14.權(quán)利要求1至12中的任一的基因和/或蛋白用于篩選抗癌劑的用途。
15.特異于權(quán)利要求1至12中任一的基因和/或蛋白的抗體用于治療不同等級(jí)腫瘤的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過(guò)篩選其表達(dá)水平與腫瘤的各個(gè)分化等級(jí)相關(guān)的基因和/或蛋白，測(cè)定各個(gè)分化等級(jí)中人腫瘤組織中基因和/或蛋白的表達(dá)從而確定腫瘤分化等級(jí)的方法。本發(fā)明還涉及使用上述基因和/或蛋白診斷腫瘤的分化等級(jí)和篩選用于腫瘤治療的抗癌劑。
文檔編號(hào)G01N33/574GK1764727SQ0382633
公開日2006年4月26日 申請(qǐng)日期2003年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月8日
發(fā)明者岡正朗, 浜本義彥, 飯塚德男, 岡部尚文, 浜田健嗣 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司