單鏈多核苷酸擴(kuò)增方法
【專利說(shuō)明】單鏈多核苷酸擴(kuò)増方法
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求于2012年12月3日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)N0.61/732，826的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，其通過(guò)引用以其整體并入。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003]本申請(qǐng)一般性地涉及核酸樣品制備和測(cè)序領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0004]核酸序列分析工具是鑒定基因改變的基礎(chǔ)，其進(jìn)而可用于診斷遺傳疾病、預(yù)測(cè)對(duì)藥物治療的響應(yīng)性以及分析藥物的藥物基因組學(xué)。由于序列分析經(jīng)常涉及在有限量的樣品中確定稀有的遺傳改變，因此靈敏度是一個(gè)大的挑戰(zhàn)。在分析組織樣品(如癌癥樣品)中的體細(xì)胞突變時(shí)尤其如此，所述組織樣品經(jīng)常包含與具有突變之細(xì)胞混合的正常細(xì)胞。
[0005]為了增加靈敏度，使用了多種核酸擴(kuò)增方法。最常用的擴(kuò)增方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(“PCR”)，其涉及使用Taq聚合酶來(lái)進(jìn)行多個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增。因?yàn)門aq聚合酶固有的保真性(fidelity)問(wèn)題，所以PCR方法經(jīng)常產(chǎn)生可掩蓋待分析之真正突變的人工突變，使得極難檢測(cè)樣品中的稀有突變。因此，可能降低核酸方法的精確度。
[0006]人基因組DNA很復(fù)雜并且具有很多重復(fù)序列。這為序列分析帶來(lái)了另外的挑戰(zhàn)。首先，目的多核苷酸在多核苷酸混合物中的代表性可能顯著不足。其次，分析復(fù)雜DNA樣品的成本可能極其昂貴，特別是在分析基因組DNA和檢測(cè)多個(gè)遺傳突變的情況下。雖然已開(kāi)發(fā)了多種下一代測(cè)序方法，但是仍然需要靈敏、精確且有效的核酸樣品制備和測(cè)序分析方法。
[0007]本文引用的所有參考文獻(xiàn)(包括專利申請(qǐng)和出版物)均通過(guò)引用以其整體并入。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]在一個(gè)方面中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝擞砂卸嗪塑账岙a(chǎn)生單鏈多核苷酸群的方法。所述方法的第一步包括在復(fù)合體中延伸RNA引物，所述復(fù)合體包含RNA引物和含有與所述靶多核苷酸互補(bǔ)之序列的DNA模板，其中所述RNA引物與所述DNA模板雜交。所述方法的第二步包括用從RNA/DNA雜合體切割RNA的酶切割RNA引物，以使得另一 RNA引物與所述DNA模板雜交并通過(guò)鏈置換來(lái)重復(fù)引物延伸。所述方法產(chǎn)生了單鏈多核苷酸群。
[0009]本申請(qǐng)還提供了分析靶多核苷酸的方法。所述方法的第一步包括在復(fù)合體中延伸RNA引物，所述復(fù)合體包含RNA引物和含有與所述靶多核苷酸互補(bǔ)之序列的DNA模板，其中所述RNA引物與所述DNA模板雜交。所述方法的第二步包括用從RNA/DNA雜合體切割RNA的酶切割所述RNA引物，以使得另一 RNA引物與DNA模板雜交并通過(guò)鏈置換來(lái)重復(fù)引物延伸，從而產(chǎn)生單鏈多核苷酸群。在第三步中包括分析所述單鏈多核苷酸。
[0010]在上述方法中，所述復(fù)合體還可包含與所述DNA模板上的區(qū)域雜交的終止多核苷酸序列，所述區(qū)域在所述RNA引物所雜交之區(qū)域的5’。上述方法中使用的DNA模板可由RNA多核苷酸序列產(chǎn)生。任選地，如下產(chǎn)生所述方法中使用的DNA模板:在復(fù)合體中延伸RNA引物，所述復(fù)合體包含DNA分子和RNA引物，其中所述RNA引物與所述DNA分子雜交；以及用從RNA/DNA雜合體切割RNA的酶切割RNA引物，以使得另一 RNA引物與DNA模板雜交并通過(guò)鏈置換來(lái)重復(fù)引物延伸，從而產(chǎn)生DNA模板。
[0011]在一個(gè)相關(guān)方面中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝送ㄟ^(guò)孵育反應(yīng)混合物由靶多核苷酸序列產(chǎn)生單鏈多核苷酸群的方法。所述方法中的反應(yīng)混合物包含含有與所述靶多核苷酸互補(bǔ)之序列的DNA模板、可與所述DNA模板雜交的RNA引物、DNA聚合酶和從RNA/DNA雜合體切割RNA的酶。所述方法的孵育步驟在這樣的條件下進(jìn)行，所述條件允許引物雜交、引物延伸、RNA切割和在從引物延伸產(chǎn)物切割RNA時(shí)從模板置換引物延伸產(chǎn)物從而使另一 RNA引物雜交并通過(guò)鏈置換來(lái)重復(fù)引物延伸，從而產(chǎn)生單鏈多核苷酸的多個(gè)拷貝。
[0012]本申請(qǐng)還提供了通過(guò)產(chǎn)生單鏈多核苷酸群來(lái)分析靶多核苷酸的方法。在第一步中，通過(guò)孵育反應(yīng)混合物來(lái)產(chǎn)生單鏈多核苷酸群，所述反應(yīng)混合物包含含有與所述靶多核苷酸互補(bǔ)之序列的DNA模板、可與所述DNA模板雜交的RNA引物、DNA聚合酶和從RNA/DNA雜合體切割RNA的酶。在該方法中，孵育在這樣的條件下進(jìn)行，所述條件允許引物雜交、弓丨物延伸、RNA切割和在從引物延伸產(chǎn)物切割RNA時(shí)從模板置換引物延伸產(chǎn)物從而使另一 RNA引物雜交并通過(guò)鏈置換來(lái)重復(fù)引物延伸，從而產(chǎn)生單鏈多核苷酸的多個(gè)拷貝。在第二步中，分析所述單鏈多核苷酸群。
[0013]在上述任意方法中，RNA引物可為約6至約20個(gè)核苷酸長(zhǎng)。任選地，RNA引物可包含polyA序列。任選地，RNA引物可包含隨機(jī)引物序列。上述任意方法中所使用的DNA模板可任選地包含接頭(adaptor)序列，并且RNA引物可任選地包含與所述接頭序列雜交的序列。本文所提供的任意方法的延伸步驟可通過(guò)選自以下的DNA聚合酶進(jìn)行:鏈置換DNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、具有校正活性的聚合酶、T7 DNA聚合酶和大腸桿菌(E.coli)DNA聚合酶I。所述方法中從RNA/DNA雜合體切割RNA的酶可以是RNA酶H (RNase H)。所述方法中使用的DNA模板可任選地為基因組DNA。
[0014]在一個(gè)相關(guān)方面中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝擞糜趩捂湺嗪塑账釘U(kuò)增的試劑盒。所述試劑盒包含RNA引物、DNA聚合酶和從RNA/DNA雜合體切割RNA的酶。試劑盒中從RNA/DNA雜合體切割RNA的酶可以是RNase H。試劑盒中的DNA聚合酶可選自鏈置換DNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、具有校正活性的聚合酶、T7 DNA聚合酶和大腸桿菌DNA聚合酶I。試劑盒中的RNA引物可為約6至約20個(gè)核苷酸長(zhǎng)。任選地，RNA引物可包含polyA序列。任選地，RNA引物包含隨機(jī)引物序列。
【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1描繪了單鏈多核苷酸擴(kuò)增的一種示例性方法。
[0016]圖2描繪了單鏈多核苷酸擴(kuò)增的另一種示例性方法。
[0017]發(fā)明詳述
[0018]本申請(qǐng)?zhí)峁┝耸褂肦NA引物進(jìn)行單鏈多核苷酸擴(kuò)增的方法。該擴(kuò)增方法使用與DNA模板雜交的RNA引物。使用聚合酶來(lái)實(shí)現(xiàn)沿DNA模板的RNA引物的延伸。然后，使用從RNA/DNA雜合體切割RNA的酶(例如RNase H)從DNA模板切割RNA引物，在模板鏈上留下引物雜交序列，所述引物雜交序列可用于結(jié)合另一 RNA引物并允許起始另一擴(kuò)增循環(huán)。由聚合酶產(chǎn)生另一條鏈，其置換之前復(fù)制的鏈，產(chǎn)生經(jīng)置換的延伸產(chǎn)物。RNA引物的重復(fù)延伸導(dǎo)致產(chǎn)生了單鏈多核苷酸的多個(gè)拷貝。
[0019]因此，在一方面中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝水a(chǎn)生單鏈多核苷酸產(chǎn)物的方法。在另一方面中，提供了分析單鏈多核苷酸產(chǎn)物的方法。還提供了可用于本文所述方法的試劑盒和組合物。
[0020]1.定義
[0021]本文使用的“單鏈多核苷酸擴(kuò)增”是指通過(guò)在包含靶多核苷酸序列的單鏈模板核酸上重復(fù)延伸單個(gè)引物來(lái)合成單鏈子鏈的多個(gè)拷貝。新合成的核酸分子在后續(xù)的引物延伸反應(yīng)期間不能用作產(chǎn)生另外的核酸分子的模板。
[0022]本文使用的“擴(kuò)增”一般是指產(chǎn)生期望序列的兩個(gè)或更多個(gè)拷貝的過(guò)程。
[0023]本文中可互換使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任意長(zhǎng)度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。所述核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經(jīng)修飾的核苷酸或堿基和/或其類似物、或者可通過(guò)DNA聚合酶或RNA聚合酶并入聚合物中的任何底物。多核苷酸可包含經(jīng)修飾的核苷酸，例如甲基化的核苷酸及其類似物。
[0024]本文中使用的“寡核苷酸”一般是指短的、一般為單鏈的、一般為合成的多核苷酸，其長(zhǎng)度一般(但不一定)少于約200個(gè)核苷酸。術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不互相排斥。以上對(duì)于多核苷酸的描述同樣完全適用于寡核苷酸。
[0025]本文使用的使多核苷酸“片段化”是指使多核苷酸斷裂成不同的多核苷酸片段。片段化可例如通過(guò)剪切或通過(guò)酶促反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0026]“引物”一般是短的單鏈多核苷酸，一般具有游離3’ -OH基團(tuán)，其通過(guò)與靶多核苷酸上存在的靶序列雜交而與目的靶多核苷酸結(jié)合，并隨后促進(jìn)與靶多核苷酸互補(bǔ)之多核苷酸的聚合。
[0027]本文使用的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)簽”是指可用于將連接有標(biāo)簽的分子與不包含所述標(biāo)簽的其他分子分開(kāi)的部分。
[0028]本文使用的術(shù)語(yǔ)“末端核苷酸”是指位于核酸分子5’端或3’端的核苷酸。
[0029]“雜交”和“退火”是指其中一個(gè)或更多個(gè)多核苷酸反應(yīng)以形成復(fù)合體的反應(yīng)，所述復(fù)合體通過(guò)核苷酸殘基堿基之間的氫鍵鍵合而穩(wěn)定化。氫鍵鍵合可通過(guò)Watson-Crick堿基配對(duì)、Hoogstein結(jié)合或者以任何其他序列特異性方式發(fā)生。
[0030]本文使用的“接頭”是指可與多核苷酸片段連接的寡核苷酸。
[0031]本文關(guān)于兩個(gè)多核苷酸(如接頭和多核苷酸片段)使用的術(shù)語(yǔ)“連接”是指兩個(gè)單獨(dú)的多核苷酸共價(jià)連接以產(chǎn)生具有連續(xù)骨架的單個(gè)更大的多核苷酸。
[0032]術(shù)語(yǔ)“3’” 一般是指多核苷酸或寡核苷酸中位于同一多核苷酸或寡核苷酸中另一區(qū)域或位置下游的區(qū)域或位置。
[0033]術(shù)語(yǔ)“5’” 一般是指多核苷酸或寡核苷酸中位于同一多核苷酸或寡核苷酸中另一區(qū)域或位置上游的區(qū)域或位置。
[0034]“5’突出端”是延伸超過(guò)雙鏈核酸分子5’端的一段(stretch)未配對(duì)核苷酸。例如，5’突出端可以是單個(gè)未配對(duì)核苷酸，或者其可以為至少5、10、15或超過(guò)15個(gè)核苷酸長(zhǎng)。例如，引物可包含，例如5至25個(gè)不與例如模板鏈中存在的序列和/或靶多核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸。換言之，在引物的其他部分與靶多核苷酸雜交的情況下，5’突出端的核苷酸不與靶多核苷酸序列雜交。
[0035]“3’突出端”是延伸超過(guò)雙鏈核酸分子3’端的一段未配對(duì)核苷酸。例如，3’突出端可以是單個(gè)未配對(duì)核苷酸，或者其可以為至少5、10、15或超過(guò)15個(gè)核苷酸長(zhǎng)。例如，弓丨物可包含，例如5至25個(gè)不與例如模板鏈中存在的序列和/或靶多核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸。換言之，在引物的其他部分與靶多核苷酸雜交的情況下，3’突出端的核苷酸不與靶多核苷酸序列雜交。
[0036]本文使用的術(shù)語(yǔ)“靶多核苷酸”是指包含一個(gè)或更多個(gè)目的序列和正在研究的序列的多核苷酸。
[0037]本文使用的“陣列”包括具有空間或光學(xué)可尋址(addressable)區(qū)域之核酸或其他分子的排列。當(dāng)陣列是核酸陣列時(shí)，核酸可在沿核酸鏈的任意點(diǎn)被物理吸附、化學(xué)吸附或共價(jià)連接至所述陣列。
[0038]術(shù)語(yǔ)“確定”、“測(cè)量”、“評(píng)價(jià)”、“評(píng)估”、“測(cè)定”和“分析”在本文中可互換使用，是指任意形式的測(cè)量并且包括確定要素是否存在。這些術(shù)語(yǔ)包括定量確定和/定性確定二者。
評(píng)估可以是相對(duì)的或絕對(duì)的?！霸u(píng)估......的存在”包括確定物質(zhì)存在的量以及確定其是否存在。
[0039]本文使用的術(shù)語(yǔ)“單核苷酸多態(tài)性”或簡(jiǎn)稱“SNP”是指基因組序列中特定位點(diǎn)處的單個(gè)核苷酸的改變，導(dǎo)致在群體中以可感知頻率(例如，群體中至少1% )出現(xiàn)的兩個(gè)或更多個(gè)替代等位基因。
[0040]本文使用的術(shù)語(yǔ)“變性”是指使核酸雙鏈體分為兩條單鏈。
[0041]術(shù)語(yǔ)“富集”是指使樣品中特定核酸序列的相對(duì)豐度相對(duì)于處理前所述樣品中最初存在的整體核酸序列水平提高的過(guò)程。因此，富集步驟提供了相對(duì)百分比或分?jǐn)?shù)提高，而不是直接提高(例如目的核酸序列的絕對(duì)拷貝數(shù))。在富集步驟之后，待分析樣品可稱為富集的多核苷酸或經(jīng)選擇的多核苷酸。
[0042]本文使用的核酸樣品的“復(fù)雜性(complexity) ”是指所述樣品中存在的不同的獨(dú)特序列的數(shù)目。如果樣品不如其所來(lái)源的核酸樣品復(fù)雜，則認(rèn)為該樣品具有“降低的復(fù)雜性”。
[0043]本文使用的“固體支持物”是指具有與標(biāo)簽結(jié)合之特性的固體或半固體材料，所述特性是固有的或者通過(guò)連接一些賦予所述特性的組分(例如，抗體、鏈霉親和素