用于測(cè)定核苷酸序列的方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 根據(jù)35U. S.C. § 119(e)，本申請(qǐng)要求2012年5月10日提交的U. S.臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?61/645, 364和2012年8月3日提交的U.S.臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/679, 302的優(yōu)先權(quán)，以引用的方 式將其內(nèi)容全部并入本文。
[0003] 序列表
[0004] 本申請(qǐng)包含序列表，所述序列表已通過(guò)EFS-Web以ASCII形式提交，并以引用的方 式將其全部并入本文。所述ASCII副本于2013年3月8日創(chuàng)建，命名為030258-074962-PCT_ SL. txt，大小為41，722字節(jié)。
[0005] 政府支持
[0006] 本發(fā)明是在由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研宄院（National Institutes of Health)授予的基 金號(hào)5R21CA161590的聯(lián)邦資助下完成的。美國(guó)政府對(duì)本發(fā)明享有一定權(quán)利。
技術(shù)領(lǐng)域
[0007] 本文所述的技術(shù)涉及測(cè)定寡核苷酸序列的方法。
【背景技術(shù)】
[0008] 相比全基因組、全外顯子組以及全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，下一代測(cè)序（next-generation sequencing)前的革El富集更具成本效益，因此更適于在研宄發(fā)現(xiàn)和臨床應(yīng)用中廣泛實(shí)施。例 如，由革E富集方法提供的高覆蓋深度（high coverage depth)能夠?qū)崿F(xiàn)較寬動(dòng)態(tài)范圍的等 位基因計(jì)數(shù)（在基因表達(dá)和拷貝數(shù)評(píng)估中）以及對(duì)低頻突變的檢測(cè)（用于評(píng)價(jià)癌癥中的 體細(xì)胞突變的關(guān)鍵特征）。目前用于下一代測(cè)序的富集方案的實(shí)例包括：基于雜交的捕獲 分析（TruSeq Capture，Illumina ;SureSelect Hybrid Capture，Agilent)和基于聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)的分析（HaloPlex，Agilent ;AmpliSeq，Ion Torrent ；TruSeq Amp I icon, Illumina ;乳液/數(shù)字PCR，Raindance)?；陔s交的方法不僅捕獲到被捕獲探針覆蓋的靶 向序列，還捕獲到了消耗測(cè)序能力的附近的脫祀堿基（near off-target bases)。此外，這 些方法都比較費(fèi)時(shí)、勞動(dòng)密集、并且特異性水平較低?；赑CR擴(kuò)增的方法較簡(jiǎn)單且較快 速，但根據(jù)常規(guī)設(shè)計(jì)需要使用位于靶基因座兩翼的正向引物和反向引物。特別地，對(duì)于檢測(cè) 具有未知融合伴侶（fusion partner)的基因組重排（genomic rearrangements)來(lái)說(shuō)，PCR 是不適用的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本文所述的技術(shù)針對(duì)測(cè)定寡核苷酸序列的方法。在一些實(shí)施方式中，本文所述的 方法涉及在對(duì)序列進(jìn)行測(cè)序前對(duì)靶序列進(jìn)行富集。
[0010] 在一個(gè)方面，本文所述的技術(shù)涉及測(cè)定與已知祀核苷酸序列鄰接（contiguous to)的核苷酸序列的方法，所述方法包括：(a)將包含已知靶核苷酸序列的靶核酸與通用 寡核苷酸尾部接頭（adaptor)連接；(b)用第一接頭引物和第一革巴特異性引物擴(kuò)增所述革巴 核酸的一部分和所述通用寡核苷酸尾部接頭的擴(kuò)增鏈；(C)用第二接頭引物和第二靶特異 性引物擴(kuò)增由步驟（b)產(chǎn)生的擴(kuò)增子的一部分；（d)使用第一測(cè)序引物和第二測(cè)序引物 對(duì)由步驟（C)產(chǎn)生的擴(kuò)增部分進(jìn)行測(cè)序；其中，所述通用寡核苷酸尾部接頭包含第一可連 接雙鏈末端和第二未配對(duì)末端；其中，所述通用寡核苷酸尾部接頭包含封閉鏈（blocking strand)和擴(kuò)增鏈（amplification strand);其中，所述封閉鏈包含5'雙鏈部分；其中，所 述擴(kuò)增鏈包含未配對(duì)5'部分、3'雙鏈部分和3'T突出（overhang);其中，所述擴(kuò)增鏈包含與 第一測(cè)序引物和第二測(cè)序引物相同的核酸序列；其中，所述封閉鏈和所述擴(kuò)增鏈的雙鏈部 分基本上（substantially)互補(bǔ)，并形成包含3'T突出的第一可連接雙鏈末端；其中，所述 雙鏈部分足夠長(zhǎng)，以在連接溫度下維持雙鏈形式；其中，所述第一靶特異性引物包含能在退 火溫度下特異性退火至所述靶核酸的已知靶核苷酸序列的核酸序列；其中，所述第二靶特 異性引物包含3'部分和5'部分，所述3'部分含有能夠特異性退火至由步驟（b)產(chǎn)生的擴(kuò) 增子所包含的已知靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5'部分含有與第二測(cè)序引物相 同的核酸序列，并且所述第二靶特異性引物相對(duì)于所述第一靶特異性引物嵌套（nested); 其中，所述第一接頭引物包含與所述第一測(cè)序引物的5'部分相同的核酸序列；以及其中， 所述第二接頭引物包含與所述第一測(cè)序引物的一部分相同的核酸序列，并且相對(duì)于所述第 一接頭引物嵌套。
[0011] 在一些實(shí)施方式中，通用寡核苷酸尾部接頭的封閉鏈可進(jìn)一步包含3'未配對(duì)部 分，所述3'未配對(duì)部分基本上不與擴(kuò)增鏈的5'未配對(duì)部分互補(bǔ)；以及其中，封閉鏈的3'未 配對(duì)部分基本上不與任何引物互補(bǔ)，或基本上不同于任何引物。在一些實(shí)施方式中，第二接 頭引物可通過(guò)至少3個(gè)核苷酸相對(duì)于第一接頭引物嵌套。在一些實(shí)施方式中，含有與第一 測(cè)序引物和第二測(cè)序引物相同的核酸序列的擴(kuò)增鏈的部分可至少部分包含于擴(kuò)增鏈的5' 未配對(duì)部分中。
[0012] 在一些實(shí)施方式中，第一靶特異性引物可進(jìn)一步包含5'標(biāo)簽序列部分，所述5'標(biāo) 簽序列部分包含基本上不與任何引物的任何其它部分互補(bǔ)或基本上不同于任何引物的任 何其它部分的高GC含量的核酸序列。在一些實(shí)施方式中，第一靶特異性引物可進(jìn)一步包含 5'標(biāo)簽序列部分，所述5'標(biāo)簽序列部分包含在退火溫度下不會(huì)特異性退火至任何引物或其 互補(bǔ)物的任何其它部分的高GC含量的核酸序列。在一些實(shí)施方式中，第二接頭引物可與全 長(zhǎng)第一測(cè)序引物相同。在一些實(shí)施方式中，特異性退火至已知靶的靶特異性引物的部分可 在PCR緩沖液中在約65°C的溫度下特異性退火。
[0013] 在一些實(shí)施方式中，所述方法可進(jìn)一步在步驟（a)之前包括如下步驟：對(duì)核酸 進(jìn)行機(jī)械剪切；使所述核酸經(jīng)歷末端修復(fù)；使所述核酸經(jīng)歷磷酸化；以及使所述核酸經(jīng)歷 腺苷酸化。在一些實(shí)施方式中，樣品可包括基因組DNA。在一些實(shí)施方式中，樣品可包括 RNA，并且所述方法可進(jìn)一步包括使所述樣品經(jīng)歷逆轉(zhuǎn)錄酶方案（reverse transcriptase regimen)的第一步驟。在一些實(shí)施方式中，所述逆轉(zhuǎn)錄酶方案可包括使用隨機(jī)六聚體 (random hexamers)〇
[0014] 在一些實(shí)施方式中，已知革巴序列可包含于基因重排（gene rearrangement)中。 在一些實(shí)施方式中，基因重排可存在于選自于由如下核酸所組成的組中的核酸中：基因組 DNA、RNA和cDNA。在一些實(shí)施方式中，基因重排可包含癌基因（oncogene)。在一些實(shí)施方 式中，基因重排可包含融合癌基因。
[0015] 在一些實(shí)施方式中，可通過(guò)下一代測(cè)序法對(duì)核酸產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。在一些實(shí)施方式 中，下一代測(cè)序法可包括選自于由以下方法所組成的組中的方法：I〇n Torrent、Illumina、 S0LiD、454、大規(guī)模平行簽名測(cè)序（Massively Parallel Signature Sequencing)、固相可 逆染料終止物測(cè)序（reversible dye-terminator sequencing)以及DNA納米球測(cè)序（DNA nanoball sequencing)。在一些實(shí)施方式中，第一測(cè)序引物和第二測(cè)序引物兼容所選的下 一代測(cè)序法。
[0016] 在一些實(shí)施方式中，所述方法可包括將樣品或樣品的單獨(dú)部分與多組第一靶特異 性引物和第二靶特異性引物接觸。在一些實(shí)施方式中，所述方法可包括將包含樣品的單一 反應(yīng)混合物與多組第一靶特異性引物和第二靶特異性引物接觸。在一些實(shí)施方式中，多組 第一靶特異性引物和第二靶特異性引物可特異性退火至由不同基因所包含的已知靶核苷 酸序列。在一些實(shí)施方式中，至少兩組第一靶特異性引物和第二靶特異性引物可特異性退 火至已知靶核苷酸序列的不同部分。在一些實(shí)施方式中，至少兩組第一靶特異性引物和第 二靶特異性引物可特異性退火至含有已知靶核苷酸序列的單個(gè)基因的不同部分。在一些 實(shí)施方式中，至少兩組第一靶特異性引物和第二靶特異性引物可特異性退火至含有已知靶 核苷酸序列的基因的不同外顯子。在一些實(shí)施方式中，多個(gè)第一靶特異性引物可包含相同 的5'標(biāo)簽序列部分。在一些實(shí)施方式中，通用寡核苷酸尾部接頭可進(jìn)一步包含條形碼部分 (barcode portion)。在一些實(shí)施方式中，可將多種樣品各自與具有獨(dú)特（unique)條形碼 部分的通用寡核苷酸尾部接頭接觸，其中，在步驟（a)后將所述樣品合并（pooled)。
[0017] 在一些實(shí)施方式中，各個(gè)擴(kuò)增步驟可包括長(zhǎng)度為5個(gè)循環(huán)-20個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增 方案循環(huán)組。在一些實(shí)施方式中，可將靶特異性引物和接頭引物設(shè)計(jì)成在約61-72?的退火 溫度下會(huì)特異性退火至它們的互補(bǔ)序列。在一些實(shí)施方式中，可將靶特異性引物和接頭引 物設(shè)計(jì)成在約65°C的退火溫度下會(huì)特異性退火至它們的互補(bǔ)序列。
[0018] 在一些實(shí)施方式中，樣品可包括獲得自受試者的生物樣品。在一些實(shí)施方式中，樣 品可獲得自需要治療與遺傳改變（genetic alteration)相關(guān)的疾病的受試者。在一些實(shí)施 方式中，疾病可為癌癥。在一些實(shí)施方式中，樣品可包括腫瘤細(xì)胞群。在一些實(shí)施方式中， 樣品可包括腫瘤活組織切片（biopsy)。在一些實(shí)施方式中，癌癥可為肺癌。
[0019] 在一些實(shí)施方式中，已知靶序列可包含于疾病相關(guān)基因中。在一些實(shí)施方式中，已 知靶序列可包含于樣品中的基因重排產(chǎn)物中。在一些實(shí)施方式中，基因重排產(chǎn)物可為癌基 因。
[0020] 在一些實(shí)施方式中，已知靶序列可包含來(lái)自選自以下基因的組中的基因的序列： ALK、ROSl和RET。在一些實(shí)施方式中，至少一組第一靶特異性引物和第二靶特異性引物可 選自于由以下引物所組成的組：SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6;SEQ ID NO :7和SEQ ID NO: 8 ;SEQ ID NO :9 和 SEQ ID NO :10 ;SEQ ID NO :11 和 SEQ ID NO :12 ;SEQ ID NO :13 和 SEQ ID NO :14 ;SEQ ID NO :15 和 SEQ ID NO :16 ;SEQ ID NO :17 和 SEQ ID NO :18 ;SEQ ID NO : 19和 SEQ ID NO :20 ;SEQ ID NO :21 和 SEQ ID NO :22 ;SEQ ID NO :23和 SEQ ID NO :24 ;SEQ ID NO :25 和 SEQ ID NO :26 ;SEQ ID NO :27 和 SEQ ID NO :28 ;SEQ ID NO :29 和 SEQ ID NO : 30 ;SEQ ID NO :31 和 SEQ ID NO :32 ;SEQ ID NO :33和 SEQ ID NO :34 ;SEQ ID NO :35和 SEQ ID NO :36 ;以及 SEQ ID NO :37 和 SEQ ID NO :38。
[0021] 在一些實(shí)施方式中，在從受試者的腫瘤獲得的樣品中，ALK的基因重排的存在可說(shuō) 明腫瘤易受以選自于由如下物質(zhì)組成的組中的治療劑進(jìn)行的治療的影響：ALK抑制劑、克 唑替尼（crizotinib) (PF-02341066)、AP26113、LDK378、3-39、AF802、IPI-504、ASP3026、 AP-26113、X-396、GSK-1838705A、CH5424802 以及 NVP-TAE684。
[0022] 在一些實(shí)施方式中，在從受試者的腫瘤獲得的樣品中，ROSl的基因重排的存在可 說(shuō)明腫瘤易受以選自于由如下物質(zhì)組成的組中的治療劑進(jìn)行的治療的影響：ROS抑制劑、 ALK 抑制劑、克唑替尼（PF-02341066)、AP26113、LDK378、3-39、AF802、IPI-504、ASP3026、 AP-26113、X-396、GSK-1838705A、CH5424802 以及 NVP-TAE684。
[0023] 在一些實(shí)施方式中，在從受試者的腫瘤獲得的樣品中，RET的基因重排的存在可 說(shuō)明腫瘤易受以選自于由如下物質(zhì)組成的組中的治療劑進(jìn)行的治療的影響：RET抑制劑、 DP-2490、DP-3636、SU5416、BAY 43-9006、BAY 73-4506 (瑞格非尼，regorafenib)、ZD6474、 NVP-AST487、索拉非尼（sorafenib)、RPI_1、XL184、凡德他尼（vandetanib)、舒尼替尼 (sunitinib)、伊馬替尼（imatinib)、帕挫帕尼（pazopanib)、阿西替尼（axitinib)、莫特塞 尼（motesanib)、吉非替尼（gefitinib)以及醉前素 A(withaferin A)。
[0024] 在一個(gè)方面，本文所述的技術(shù)涉及治療癌癥的方法，所述方法包括：根據(jù)本文所述 的方法，對(duì)獲得自需要治療癌癥的受試者的腫瘤樣品中一種以上癌基因重排的存在進(jìn)行檢 測(cè)；給予對(duì)于具有任何檢測(cè)到的癌基因重排的腫瘤有效的癌癥治療。在一些實(shí)施方式中， 選自于由以下物質(zhì)組成的組中的治療劑可對(duì)于具有ALK癌基因重排的腫瘤有效：ALK抑制 劑、克唑替尼（PF-02341066)、AP26113、LDK378、3-39、AF802、IPI-504、ASP3026、AP-26113、 X-396、GSK-1838705A、CH5424802以及NVP-TAE684。在一些實(shí)施方式中，選自于由以下物質(zhì) 組成的組中的治療劑可對(duì)于具有ROSl癌基因重排的腫瘤有效：ROSl抑制劑、ALK抑制劑、克 唑替尼（PF-02341066)、AP26113、LDK378、3-39、AF802、IPI-504、ASP3026、AP-26113、X-396、 GSK-1838705A、CH5424802以及NVP-TAE684。在一些實(shí)施方式中，選自于由以下物質(zhì)組成 的組中的治療劑可對(duì)于具有RET癌基因重排的腫瘤有效：RET抑制劑、DP-2490、DP-3636、 SU5416、BAY 43-9006、BAY 73-4506(瑞格非尼）、ZD6474、NVP-AST487、索拉非尼、RPI-1、 XL184、凡德他尼、舒尼替尼、伊馬替尼、帕唑帕尼、阿西替尼、莫特塞尼、吉非替尼以及醉茄 素 A。
[0025] 在一個(gè)方面，本文所述的技術(shù)涉及測(cè)定需要治療癌癥的受試者是否會(huì)對(duì)給定治療 作出響應(yīng)的方法，所述方法包括：根據(jù)本文所述的方法，對(duì)獲得自受試者的腫瘤樣品中癌基 因重排的存在進(jìn)行檢測(cè)；其中，如果檢測(cè)到存在癌基因重排，確定所述受試者對(duì)靶向癌基因 重排產(chǎn)物的治療作出響應(yīng)。
[0026] 在一些實(shí)施方式中，當(dāng)檢測(cè)到存在ALK癌基因重排時(shí)，受試者可對(duì)選自于由如下 物質(zhì)所組成的組中的治療劑作出響應(yīng)：ALK抑制劑、克唑替尼（PF-02341066)、AP26113、 LDK378、3-39、AF802、IPI-504、ASP3026、AP-26113、X-396、GSK-1838705A、CH5424802 以 及NVP-TAE684。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)檢測(cè)到存在ROSl癌基因重排時(shí)，受試者可對(duì)選自 于由如下物質(zhì)所組成的組中的治療劑作出響應(yīng)：ALK抑制劑、克唑替尼（PF-02341066)、 AP26113、LDK378、3-39、AF802、IPI-504、ASP3026、AP-26113、X-396、GSK-1838705A、 CH5424802 以及 NVP-TAE684。
[0027] 在一些實(shí)施方式中，當(dāng)檢測(cè)到存在RET癌基因重排時(shí)，受試者會(huì)對(duì)選自于由如 下物質(zhì)所組成的組中的治療劑作出響應(yīng)：RET抑制劑、DP-2490、DP-3636、SU5416、BAY 43-9006、BAY 73-4506(瑞格非尼）、ZD6474、NVP-AST487、索拉非尼、RPI-1、XL184、凡德他 尼、舒尼替尼、伊馬替尼、帕唑帕尼、阿西替尼、莫特塞尼、吉非替尼以及醉茄素 A。
[0028] 在一些實(shí)施方式中，癌癥可為肺癌。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1描繪了用于靶向RNA和DNA測(cè)序的文庫(kù)構(gòu)建實(shí)例的圖示說(shuō)明。1)使用來(lái)自 FFPE樣本的總核酸作為起始材料，應(yīng)用雙鏈cDNA合成的標(biāo)準(zhǔn)程序?；蛘?，起始材料也可為 剪切的gDNA。2)純化（cleanup)后，使雙鏈cDNA或gDNA經(jīng)歷末端修復(fù)和dA加尾，然后直 接連接半截短（half-truncated)Y接頭，其間不需要純化。3)SPRI純化后，使用多重基因特 異性引物（GSPl)和Ion Torrent短長(zhǎng)度正向引物A 5'20-mer(A20)，以65°C的退火溫度使 連接的樣品經(jīng)歷14個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增。4)第二SPRI純化后，使用標(biāo)記有Ion Torrent反 向引物（P1_GSP2)的多重嵌套基因特異性引物（GSPl的3'下游并在同一方向）和正向引 物A (全長(zhǎng)30-mer)，以65°C的退火溫度使樣品經(jīng)歷另外的14個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增。5)最后 的第三SPRI純化后，產(chǎn)物為準(zhǔn)備好進(jìn)行下游乳液PCR和測(cè)序的Ion Torrent文庫(kù)?？稍诓?驟2后進(jìn)行樣品合并。
[0030] 圖2描繪了映射（mapping)結(jié)果，證明在ROSl序列的一個(gè)測(cè)序運(yùn)行中的不同引 物（點(diǎn)）延伸產(chǎn)物，所述結(jié)果包括對(duì)應(yīng)于基因組DNA (跨內(nèi)含子-外顯子邊界）、cDNA (跨 外顯子）和融合cDNA(在外顯子34上，融合伴侶SLC34A2上的映射在此處未示出）的讀段 (reads)。達(dá)到了 91. 8% 的特異性（127, 446/138, 787)。
[0031] 圖3A以ROSl為例描繪了嵌套引物靶向策略的圖解展示。關(guān)于R0SUALK和RET， 分析靶組（assay target panel)包括總共17對(duì)GSPl和GSP2。圖3B描繪了使用gDNA和 cDNA模板的代表性延伸產(chǎn)物的可能類型。
[0032] 圖4A描繪了使用Integrative Genomics Viewer的可視化讀段映射。圖4B描繪 了兩個(gè)可變剪接融合序列的序列。圖4C描繪了報(bào)告所涉及的基因（注釋有外顯子、讀碼框 和融合讀段覆蓋度詳情）中的融合轉(zhuǎn)錄本的總結(jié)表。
[0033] 圖5描繪了示例性測(cè)序運(yùn)行的結(jié)果。
[0034] 圖6和圖7分別描繪了 ALK序列和RET序列的測(cè)序運(yùn)行結(jié)果的實(shí)例。
[0035] 圖8描繪了本文所述的靶向測(cè)序方法的圖解展示。
[0036] 圖9描繪了說(shuō)明性的通用寡核苷酸尾部接頭的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 本文所述技術(shù)的實(shí)施方式涉及對(duì)寡核苷酸序列進(jìn)行測(cè)定（即，測(cè)序）的方法。在 一些實(shí)施方式中，本文所述的方法涉及在測(cè)序步驟前富集靶序列的方法。在一些實(shí)施方式 中，在測(cè)序步驟之前，待富集的靶序列的一個(gè)末端的序列是未知的。
[0038] 為方便起見(jiàn)，下文提供了在說(shuō)明書、實(shí)施例以及所附權(quán)利要求中使用的一些術(shù)語(yǔ) 和短語(yǔ)的含義。除非另有說(shuō)明或在上下文中有所暗示，下列術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)包括下文提供的含 義。提供所述定義以輔助描述【具體實(shí)施方式】，而由于本發(fā)明的范圍僅受權(quán)利要求所限，因此 并不意味著限制所請(qǐng)求保護(hù)的發(fā)明。除非另有定義，本文所使用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù) 語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。如果在本領(lǐng)域 中術(shù)語(yǔ)的使用和本文所提供的術(shù)語(yǔ)定義之間存在明顯不一致，應(yīng)以本說(shuō)明書中所提供的定 義為準(zhǔn)。
[0039] 為方便起見(jiàn)，在此收集了在說(shuō)明書、實(shí)施例和所附權(quán)利要求中采用的某些術(shù)語(yǔ)。
[0040] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"降低（decrease) "、"減少（reduced/reduction) "或"抑制 (inhibit)"通常都意味著統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著量的降低。然而，為避免疑義，"減少（reduced/ reduction) "、"降低（decrease)"或"抑制（inhibit)"表示相比參比水平降低至少10%， 例如降低至少約20%、或至少約30%、或至少約40%、或至少約50%、或至少約60%、或至 少約70%、或至少約80%、或至少約90%、或上至并包括降低100% (如，相比參比樣品的 缺失水平或不可檢測(cè)水平）、或相比參比水平降低在10%到100%之間的任意量。在標(biāo)志 物（marker)或癥狀（symptom)的情況下，意味著這種水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著降低。例如，所述 降低可為至少10 %、至少20 %、至少30 %、至少40 %或更多，并優(yōu)選降至被認(rèn)為是未患此種 病癥的個(gè)體的正常范圍內(nèi)的水平。
[0041] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"增加（increased/increase) "、"增強(qiáng)（enhance) "或"活化 (activate) "通常都意味著統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著量的增加；為避免疑義，術(shù)語(yǔ)"增加（increased/ increase)"、"增強(qiáng)（enhance)"或"活化（activate)"表示相比參比水平增加至少10%，例 如增加至少約20%、或至少約30%、或至少約40%、或至少約50%、或至少約60%、或至少 約70%、或至少約80%、或至少約90%、或上至并包括增加100%、或相比參比水平增加在 10%到100%之間的任意量；或相比參比水平至少約2倍、或至少約3倍、或至少約4倍、或 至少約5倍、或至少約10倍的增加、或在2倍和10倍之間的任意量的增加、或是更大量的 增加。
[0042] 本文所使用的術(shù)語(yǔ)"受試者"是指人或動(dòng)物。通常，所述動(dòng)物為脊椎動(dòng)物，如靈長(zhǎng)類 動(dòng)物、嗤齒動(dòng)物、家畜或狩獵動(dòng)物（game animal)。靈長(zhǎng)類動(dòng)物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴 和獼猴（如恒河猴）。嚙齒動(dòng)物包括小鼠、大鼠、旱獺（woodchucks)、雪貂（ferrets)、兔和 倉(cāng)鼠。家畜和狩獵動(dòng)物包括牛（cows)、馬、豬、鹿、野牛、水牛、貓科物種（如，家貓）、犬科物 種（如，狗、狐貍、狼）、鳥(niǎo)類物種（如，雞、鴯鹋（emu)、鴕鳥(niǎo)）和魚類（如，鱒魚（trout)、鯰 魚和鮭魚）。在一些實(shí)施方式中，受試者為哺乳動(dòng)物，例如，靈長(zhǎng)類動(dòng)物、如人類。術(shù)語(yǔ)"個(gè) 體"、"患者"和"受試者"在本文中可互換使用。
[0043] 優(yōu)選地，受試者為哺乳動(dòng)物。所述哺乳動(dòng)物可為人、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、小鼠、大鼠、 狗、貓、馬或牛，但不限于這些實(shí)例。除人以外的哺乳動(dòng)物可有利于用作代表例如肺癌動(dòng)物 模型的受試者。受試者可以為雄性或雌性。
[0044] 受試者可為先前已被診斷患有或鑒定為遭受或患有需要治療的病癥（例如，癌 癥）、或與此種病癥相關(guān)的一種以上并發(fā)癥的受試者，并且所述受試者任選已接受對(duì)所述病 癥或與所述病癥相關(guān)的一種以上并發(fā)癥的治療?；蛘?，受試者還可為先前未曾被診斷為患 有所述病癥（例如，癌癥）或與所述病癥相關(guān)的一種以上并發(fā)癥的受試者。例如，受試者可 為表現(xiàn)出針對(duì)所述病癥或與所述病癥相關(guān)的一種以上并發(fā)癥的一種以上風(fēng)險(xiǎn)因素的受試 者，或者可為并未表現(xiàn)出風(fēng)險(xiǎn)因素的受試者。
[0045] 對(duì)于特定病癥的治療"有需要的受試者"可為患有該病癥、被診斷為患有該病癥、 或處于發(fā)展為該病癥的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者。
[0046] 本文所使用的"與遺傳改變相關(guān)的疾病"指的是至少部分由相對(duì)于健康野生型受 試者而言受試者的遺傳物質(zhì)的改變（例如，刪除、插入、SNP、基因重排）引起的任何疾病。 如果改變?cè)黾邮茉囌甙l(fā)展成疾病的風(fēng)險(xiǎn)、增加受試者對(duì)疾病（包括傳染性疾