具有修飾的種子油組成的蕓苔屬植物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及農(nóng)學(xué)領(lǐng)域。提供通過(guò)以多種方式（包括提供敲除的RODl等位基因或 提供針對(duì)rodl基因的抑制性RNA)調(diào)節(jié)rodl基因表達(dá)，調(diào)節(jié)蕓苔屬植物種子中脂肪酸組成 (如增加蕓苔屬植物種子中不飽和脂肪酸水平）的方法和手段。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 許多植物物種在它們的種子中貯藏三酰甘油（TAG)作為碳儲(chǔ)備。這些TAG是植物 生活早期階段期間支持幼苗發(fā)展的能量和碳原料主要來(lái)源。來(lái)自大豆（Glycine max)、蕓苔 (Brassica)(歐洲油菜（Brassica napus)或憲青（Β· rapa))、向日葵（Helianthus annuus) 和許多其他油料作物的植物油還是用于人類膳食或工業(yè)應(yīng)用的油的重要來(lái)源，所述工業(yè)應(yīng) 用包括但不限于生物燃料、生物潤(rùn)滑劑、尼龍前體和洗滌劑原料。就食品或非食品產(chǎn)業(yè)中的 油用途而言，植物油的多不飽和脂肪酸的程度和/或量是特征性和決定性屬性。更具體地， 植物油的特征性屬性和用途主要由TAG中其脂?；M成決定。
[0004] 大部分植物油主要由棕櫚酸酸（16:0)、硬脂酸（18:0)、油酸（18: IcisA9)、亞油酸 (18:2(^八9'12)、和（!-亞麻酸（18 :3(^八9'12'15或(：18:3)組成。棕櫚酸和硬脂酸分別地是 具有16碳長(zhǎng)度和18碳長(zhǎng)度的飽和脂肪酸。油酸、亞油酸和亞麻酸是具有18碳長(zhǎng)度的分別 含有一個(gè)、兩個(gè)和三個(gè)雙鍵的不飽和脂肪酸。油酸稱作單不飽和脂肪酸，而亞油酸和亞麻酸 稱作多不飽和脂肪酸。已經(jīng)尋求對(duì)脂肪酸組成的修飾至少一個(gè)世紀(jì)，以提供最佳油產(chǎn)品用 于人類營(yíng)養(yǎng)用途和化學(xué)用途（例如，油料化學(xué)）（611118丨〇116，1998，？1'(^1^?丨(11^837 :277; Broun 等人，1999, Annu Rev Nutr 19:107; Jaworski 等人，2003, Curr Opin Plant Biol 6:178)。特別地，多不飽和脂肪酸（18:2和18:3)已經(jīng)受到密切關(guān)注，因?yàn)樗鼈兪怯绊憼I(yíng)養(yǎng) 價(jià)值和油穩(wěn)定性的主要因素。然而，盡管這兩種脂肪酸為人和動(dòng)物提供必需養(yǎng)分，但是它們 增加油不穩(wěn)定性，因?yàn)樗鼈儼赡茉诩庸ず蛢?chǔ)存期間輕易氧化的多個(gè)雙鍵。
[0005] 18:1去飽和成18:2是合成多不飽和脂肪酸的關(guān)鍵步驟。在貯藏脂質(zhì)生物合成 期間，已知這種反應(yīng)由脂肪酸去飽和酶FAD2( -種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER)上的膜結(jié)合酶）催化 (Browse和 Somerville，1991，Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 42:467)OFAD2底 物18:1必須在作為植物細(xì)胞的主要膜磷脂的磷脂酰膽堿（PC)的sn-2位置上酯化（Miquel 和 Browse, 1992, J Biol Chem 267:1502 ;0kuley 等人，1994, Plant Cell 6:147)。因此， 不令人驚訝，下調(diào)FAD2 (和FAD3)基因已經(jīng)變成一項(xiàng)優(yōu)選策略以避免需要?dú)浠参镉秃屯?時(shí)產(chǎn)生不希望的反式脂肪酸。例如，大豆具有種子特異性和組成型FAD2去飽和酶，從而對(duì) 種子特異性同工型的基因沉默已經(jīng)允許產(chǎn)生高油酸酯栽培品種（油中>88% 18:1)，其中 膜不飽和度和植物性能大多不受影響。然而顯而易見，這類FAD2基因沉默策略是基本上 有限的，因?yàn)槔缈ㄖZ拉油菜和其他油籽植物僅具有組成型FAD2酶。因此，在卡諾拉油菜 和其他這類組成型FAD2作物中，沉默或下調(diào)FAD2不僅改變種子中貯藏三酰甘油（TAG)的 脂肪酸組成，還改變細(xì)胞膜的脂肪酸組成，這嚴(yán)重破壞植物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量。例如，擬南芥屬 (Arabidopsis)突變體fad2中的缺陷性FAD2改變種子以及營(yíng)養(yǎng)組織的脂肪酸組成，并嚴(yán)重 破壞植物生長(zhǎng)（Browse和Somerville，上文）。產(chǎn)生油中最高18:1水平的FAD2突變和沉 默還減少營(yíng)養(yǎng)組織和種子組織中的膜不飽和度，產(chǎn)生萌發(fā)和生長(zhǎng)低劣的植物。因此，僅部分 下調(diào)FAD2表達(dá)是可能的，在商業(yè)栽培品種如Nexera/Natreon(Dow AgroSciences)和Clear Valley 75(Cargill)的油中產(chǎn)生大約 70-75% 18:1。
[0006] Lu 等人（2009,Proc Natl Acad Sci USA 106:18837)和 WO 2009/111587 描述了 鑒定來(lái)自擬南芥的磷脂酰膽堿：二酰甘油膽堿磷酸轉(zhuǎn)移酶（PDCT)，所述轉(zhuǎn)移酶由rodl基因 編碼，參與18:1轉(zhuǎn)移至磷脂酰膽堿中用于去飽和并且還用于18:2和18:3逆轉(zhuǎn)移至三酰甘 油合成路線中。H)CT酶催化18:2和18:3轉(zhuǎn)移至三酰甘油合成路線中。相對(duì)于野生型，擬 南芥rodl突變體的種子具有下降的18:2和18:3多不飽和脂肪酸和同時(shí)增加的18:1，同時(shí) 不影響擬南芥中鑒定的葉組織或根組織的脂肪酸組成。WO 2009/111587還描述了來(lái)自歐洲 油菜、憲青（Brassica rapa)和甘藍(lán)的RODl同源物。
[0007] 為了在蕓苔屬植物中利用rodl基因增加18:1水平并減少18:2和18:3水平，仍 需要了解蕓苔屬植物基因組中的全部rodl基因序列和所編碼蛋白質(zhì)的功能性。對(duì)經(jīng)濟(jì)上 重要的十字花科（Brassicaceae)植物如菜籽油菜中與rodl相對(duì)應(yīng)的突變等位基因的分離 可能因菜籽油菜中的雙二倍體和因而所致的相應(yīng)基因功能冗余而復(fù)雜化。
[0008] 因此，現(xiàn)有技術(shù)缺少蕓苔屬植物中存在多少rodl基因和哪種rodl基因編碼有功 能的蛋白質(zhì)或需要失活以增加種子中18:1水平的教導(dǎo)。如本文所述，已經(jīng)解決這個(gè)問(wèn)題， 從而允許調(diào)節(jié)H)CT表達(dá)，目的在于調(diào)節(jié)蕓苔屬植物種子中的18:1水平，如將從不同實(shí)施方 案和權(quán)利要求書變得顯而易見。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 本發(fā)明的第一實(shí)施方案是提供一種包含至少一種rodl基因的蕓苔屬植物或其植 物細(xì)胞、部分、種子或子代，特征在于至少一種rodl基因是失活或敲除的rodl基因。在又 一個(gè)實(shí)施方案中，所述蕓苔屬植物是蕪青，并且所述失活或敲除的rodl基因是編碼與SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 21 或 SEQ ID No. 24 具有至少 90%序列同一性的蛋白 質(zhì)的rodl基因的敲除等位基因。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述蕓苔屬植物是甘藍(lán)（Brassica oleracea)，并且所述敲除的 rodl 基因是編碼與 SEQ ID No. 27、SEQ ID No. 30、SEQ ID No. 33或SEQ ID No. 36具有至少90%序列同一性的蛋白質(zhì)的rodl基因的敲除等位基因。 在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述蕓苔植物是歐洲油菜，并且所述敲除的rodl基因是編碼與SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 6具有至少90%序列同一性的蛋白質(zhì)的rodl基因的敲除等位基因， 如從選自以下的種子可獲得的歐洲油菜：已經(jīng)按檢索號(hào)NCMB 41995保藏在NCMB的包含 HI0L306的種子、已經(jīng)按檢索號(hào)NCMB 42000保藏在NCMB的包含HI0L307的種子、已經(jīng)按 檢索號(hào)NCMB 41996保藏在NCMB的包含HI0L310的種子、已經(jīng)按檢索號(hào)NCMB 42001保藏 在NCMB的包含HI0L313的種子、已經(jīng)按檢索號(hào)NCMB 41997保藏在NCMB的包含HI0L316 的種子、已經(jīng)按檢索號(hào)NCMB 41998保藏在NCMB的包含HI0L318的種子和已經(jīng)按檢索號(hào) NCMB 41999保藏在NCMB的包含HI0L319的種子，或如包含兩個(gè)敲除RODl等位基因的歐 洲油菜，所述敲除等位基因之一是編碼與SEQ ID No. 3具有至少90%序列同一性的蛋白質(zhì) 的rodl基因的敲除等位基因，并且所述敲除等位基因之一是編碼與SEQ ID No. 6具有至少 90%序列同一性的蛋白質(zhì)的rodl基因的敲除等位基因。
[0011] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述蕓苔屬植物對(duì)所述敲除的rodl基因純合。
[0012] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，提供包含嵌合基因的轉(zhuǎn)基因蕓苔屬植物，所述嵌合基因包 含以下有效連接的DNA片段：植物可表達(dá)啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生抑制至少一種rodl基因的 RNA分子的DNA區(qū)域和任選地在植物細(xì)胞中有功能的轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷化區(qū)。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因蕓苔屬植物是歐洲油菜，并且所述RNA分子對(duì)編碼與SEQ ID No. 3 或SEQ ID No. 6具有至少90%序列同一性的蛋白質(zhì)的rodl基因是抑制的。
[0013] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，提供來(lái)自本發(fā)明植物（即包含敲除的rodl基因或抑制rodl 基因的RNA的植物）的種子。在又一個(gè)實(shí)施方案中，提供來(lái)自本發(fā)明植物的種子的油。
[0014] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種用于增加種子油中C18:l水平的方法，所述方法 包括調(diào)節(jié)rodl基因的表達(dá)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種用于增加種子油中C18:l水平 的方法，所述方法包括步驟引入或提供嵌合基因至蕓苔屬植物細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，所 述嵌合基因包含以下有效連接的DNA片段：植物可表達(dá)啟動(dòng)子；轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生抑制至少一種 rodl基因的RNA分子的DNA區(qū)域和任選地在植物細(xì)胞中有功能的轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷化 區(qū)；并且從所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物。
[0015] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種用于增加種子油中C18:l水平的方法，所述方法 包括步驟：用致突變化學(xué)物質(zhì)或用電離輻射處理種子或植物材料；鑒定rodl基因突變的植 物，其中rodl基因，在經(jīng)突變之前，編碼與SEQ ID No. 3或與SEQ ID No. 6具有至少90%序 列同一性的多肽；并且與其中rodl基因未突變的植物相比，選擇種子中C18:l水平升高的 植物。
[0016] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種用于獲得種子中具有增加的C18:l水平的蕓苔屬 植物的方法，所述方法包括步驟：在所述蕓苔屬植物中引入rodl基因的敲除等位基因并且 通過(guò)以下方式針對(duì)所述rodl基因的敲除等位基因的存在，選擇種子中具有增加的C18:l水 平的所述蕓苔屬植物：對(duì)來(lái)自所述植物的基因組DNA分析至少一種分子標(biāo)記的存在，其中 所述至少一種分子標(biāo)記與所述rodl基因的敲除等位基因連鎖。
[0017] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種確定rodl基因的敲除等位基因在生物樣品中存 在或不存在的方法，所述方法包括提供來(lái)自所述生物樣品的基因組DNA并且對(duì)所述DNA分 析至少一種分子標(biāo)記的存在，其中至少一種分子標(biāo)記與所述rodl基因的敲除等位基因連 鎖。
[0018] 又一個(gè)實(shí)施方案，提供一種用于檢測(cè)蕓苔屬DNA樣品中rodl基因的敲除等位基因 的試劑盒，其中所述試劑盒包含一個(gè)或多個(gè)PCR引物對(duì)，所述PCR引物對(duì)能夠擴(kuò)增與所述 rodl基因的敲除等位基因連鎖的DNA標(biāo)記。
[0019] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種確定植物或其細(xì)胞、部分、種子或子代中突變RODl 等位基因的接合性狀態(tài)的方法，所述方法包括確定所述植物或其細(xì)胞、部分、種子或子代的 基因組DNA中突變體和/或相應(yīng)野生型RODl特異性區(qū)域的存在。
[0020] 然而，又一個(gè)實(shí)施方案提供一種用于轉(zhuǎn)移來(lái)自一個(gè)植物的至少一種敲除的RODl 等位基因至另一個(gè)植物的方法，所述方法包括步驟：鑒定包含至少一種敲除的RODl等位基 因的第一植物；將第一植物與不包含所述至少一種敲除的RODl等位基因的第二植物雜交 并從雜種收集Fl雜交種子；任選地，鑒定包含至少一種敲除的RODl等位基因的Fl植物；將 包含至少一種敲除的RODl等位基因的Fl植物與不包含至少一種敲除的RODl等位基因的 第二植物回交至少一個(gè)世代（X)并且從雜種收集BCx種子；在每個(gè)世代中通過(guò)對(duì)所述BCx 植物的基因組DNA分析至少一種分子標(biāo)記的存在，鑒定包含至少一種敲除的RODl等位基因 的BCx植物，其中至少一種分子標(biāo)記與所述敲除的RODl等位基因連鎖。
[0021] 另一個(gè)實(shí)施方案提供包含以下有效相連的元件的嵌合基因：植物可表達(dá)啟動(dòng)子； DNA區(qū)域，其轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生抑制至少一種rodl基因的RNA分子；和任選地在植物細(xì)胞中有功 能的轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷化區(qū)。
[0022] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，提供rodl基因的敲除等位基因，其中敲除的RODl等位基因 是選自以下的天然rodl基因的突變形式：包含與SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 7、 SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 13,SEQ ID No. 16,SEQ