使用拼裝序列擴(kuò)增片段化的目標(biāo)核酸的方法
【專利說明】使用拼裝序列擴(kuò)增片段化的目標(biāo)核酸的方法
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請是申請日為2013年3月15日、申請?zhí)枮?1/789，984的臨時專利申請的非臨時專利申請。
[0003]關(guān)于聯(lián)邦研究或發(fā)展資助的申明
[0004]無
[0005]以光盤形式提交的相關(guān)參考資料
[0006]無
[0007]發(fā)明背景
[0008](1)本發(fā)明的領(lǐng)域
[0009]本發(fā)明涉及擴(kuò)增一含有短核酸片段的片段化的目標(biāo)核酸的方法。具體地，使用一拼裝模板拼裝和延伸這些短核酸以產(chǎn)生用于進(jìn)一步操作的更大的擴(kuò)增子。
[0010](2)【背景技術(shù)】描述
[0011]有許多樣本類型的目標(biāo)核酸被嚴(yán)重降解，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)分子的診斷試驗(yàn)難以檢測目標(biāo)核酸。更具體地，這些目標(biāo)核酸比所述用于檢測它們的試驗(yàn)的“足跡”更短。譬如，為了檢測一拷貝數(shù)非常低的目標(biāo)，一般會擴(kuò)增所述目標(biāo)。另外，在許多情況下，會期望高度特異地檢測所述目標(biāo)。這一檢測常常在一單核苷酸變化的分辨率上。實(shí)行擴(kuò)增時，如PCR反應(yīng)，存在一正向引物、一反向引物和一檢測探針。通常地，這些引物和所述檢測探針至少在長度上約為20個核苷酸。假設(shè)所述引物和探針不存在部分重疊，那么要求所述目標(biāo)至少在長度上為60個核苷酸以容納這三個原件(即所述試驗(yàn)的足跡)的結(jié)合。而且，所述將被檢測的期望的單核苷酸變化(SNV)可發(fā)生于所述目標(biāo)核酸序列的任何位置。為了可靠地檢測，所述單核酸變化必須定位在所述擴(kuò)增的目標(biāo)核酸之中(即在所述引物結(jié)合位點(diǎn)之內(nèi)的所述擴(kuò)增子的一區(qū)域之內(nèi))以使所述探針選擇性地與該區(qū)域雜交。這有效地增加所述試驗(yàn)的所述潛在足跡到至少約100核苷酸的長度以用于該種檢測。
[0012]在很多情況下，檢測一在所述目標(biāo)序列中的已知或未知的SNV要求進(jìn)行所述檢測的片段長達(dá)160個核苷酸。這在很大程度上歸因于探針、引物和封閉探針在所述擴(kuò)增子上的排列。
[0013]這一需求的挑戰(zhàn)在于許多樣本類型含有短至20-50個核苷酸長度的片段，通常歸因于所述目標(biāo)DNA或RNA的部分降解。這在RNA序列中是典型的，因?yàn)樗鼈兏菀捉到?。這也常見于特殊的樣本類型，如尿液、血液樣本，和進(jìn)行甲醛固定石蠟包埋(FFPE)的、細(xì)針抽吸(FNA)的樣本，其中交聯(lián)的核酸隨著儲存變得降解程度更大。在尿液的情況下，由于通過腎臟的處理，核酸天生的以小片段的形式進(jìn)入尿液。通常地，穿過所述腎臟的核酸片段的大小約為20-50個核苷酸或更小。
[0014]因此，需要延伸短目標(biāo)片段的長度以進(jìn)行更為有效率和準(zhǔn)確的檢測。這需要所述被擴(kuò)大的目標(biāo)短片段具有與所述短片段原始來源的序列具有相同的序列背景以使得進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚沓蔀榭赡?。本發(fā)明提供了方法以實(shí)現(xiàn)這一需要。發(fā)明概要
[0015]本發(fā)明提供了使用拼裝模板擴(kuò)增一片段化的目標(biāo)核酸的方法，所述拼裝模板結(jié)合并延伸一目標(biāo)核酸的短核酸片段以產(chǎn)生更大的擴(kuò)增子來進(jìn)行進(jìn)一步操作。本發(fā)明的一方面是一擴(kuò)增一含有短目標(biāo)核酸片段的片段化的目標(biāo)核酸的方法，因?yàn)槠溟L度原因難以使用現(xiàn)有的技術(shù)擴(kuò)增。在一實(shí)施方案中，所述片段化的目標(biāo)核酸與一含有一與所述目標(biāo)核酸基本上互補(bǔ)、卻有顯著不同的序列的拼裝序列混合。一群短目標(biāo)核酸片段退火與所述拼裝序列結(jié)合，所述短目標(biāo)核酸片段通過聚合酶在3’方向延伸以產(chǎn)生一群含有一群第一核酸和所述拼裝序列的第一雙重核酸。
[0016]所述一群第一雙重核酸從所述拼裝序列解離，所述一群第一核酸退火與一含有一與所述拼裝引物的一區(qū)域相同的序列的第一引物結(jié)合，所述第一引物位于待檢目標(biāo)區(qū)域的5’端(拼裝序列的同義鏈)。在一些情況下，所述引物位點(diǎn)恰好位于所述拼裝序列的5’末端。所述引物向其3’端方向衍生一產(chǎn)生一群第二核酸。所述第一和第二核酸解離并又退火與所述拼裝序列及自身之間相結(jié)合，并通過聚合酶分別向其3’端延伸。重復(fù)該步驟，從而在由所述拼裝序列的5’端的所述第一引物與同所述拼裝序列最接近3’端的大部分區(qū)域互補(bǔ)的所述目標(biāo)核酸片段所產(chǎn)生的邊界內(nèi)延伸并線性擴(kuò)增所述短片段化的目標(biāo)核酸。
[0017]在第二方面，一旦實(shí)現(xiàn)了拼裝，所述方法進(jìn)一步包括，在所述拼裝序列存在時通過使用能夠檢測罕見的遺傳事件實(shí)驗(yàn)方法對所述目標(biāo)序列特異性的基因變體的檢測。
[0018]在一實(shí)施方案中所述拼裝序列是一野生型拼裝序列。
[0019]在第二實(shí)施方案中，所述拼裝序列是基因組DNA或其特異于所述所關(guān)注的目標(biāo)的一部分。在一些實(shí)施方案中，所述基因組DNA或其部分是人基因組DNA。在另一些實(shí)施方案中，所述基因組DNA或其部分與特定的生物體如病毒、細(xì)菌、寄生蟲和真菌有關(guān)。
[0020]在第三實(shí)施方案中，所述拼裝序列可為所述目標(biāo)核酸序列的一片段和/或其他任意的但是已知的序列。
[0021]在第四實(shí)施方案中，所述拼裝序列含有突變體和野生型序列的基因變異。在該應(yīng)用中，一旦經(jīng)過拼裝，突變體(遺傳變異序列)或野生型序列就可以用下游的分析方法在一相對于所述拼裝序列的野生型序列與一相對于所述拼裝序列的基因變異存在時被確定。同樣，在平行反應(yīng)中野生型和基因變異的拷貝的普遍程度和/或拷貝數(shù)能夠被確定。
[0022]在所有情況下，所述拼裝序列被設(shè)計為通過3’端延伸擴(kuò)大所述目標(biāo)核酸的短核酸片段以檢測一目標(biāo)核酸的一區(qū)域。
[0023]在第六實(shí)施方案中，所述拼裝序列是雙鏈的。
[0024]在第七實(shí)施方案中，同時使用正向引物和反向引物在PCR條件下進(jìn)行所述拼裝。
[0025]在第八實(shí)施方案中，多重線性擴(kuò)增循環(huán)被用于線性地拼裝短核酸片段，而不會發(fā)生在同時存在正向引物和反向引物時，所述拼裝序列在指數(shù)擴(kuò)增條件下擴(kuò)增。
[0026]在第九實(shí)施方案中，拼裝在更低的溫度下進(jìn)行以幫助短核酸與所述拼裝序列雜交，一旦發(fā)生拼裝，所述擴(kuò)增溫度可被升高，并可添加其他試劑以支持指數(shù)擴(kuò)增。
[0027]在第十實(shí)施方案中，進(jìn)行兩個拼裝反應(yīng)，一個反應(yīng)使用一所關(guān)注的檢測區(qū)域3’端的引物，另一個則使用一所關(guān)注的檢測區(qū)域的5’端的引物。一旦在所述兩個分開的反應(yīng)混合物中發(fā)生拼裝，可以將它們結(jié)合用正向和反向引物進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增。
[0028]在第十一實(shí)施方案中，當(dāng)所述片段化的核酸濃度更高時，所述拼裝反應(yīng)可與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)同時進(jìn)行。
[0029]在另一實(shí)施方案中，所述拼裝序列超過所述用于拼裝的核酸片段預(yù)期濃度的10、100、1000、10000 或 100000 倍。
[0030]本發(fā)明的其他方面參見于所述說明書的全文中。
[0031]圖片簡述
[0032]圖1是本發(fā)明中一個方面的示意圖。
[0033]除非另有說明，此處所用的所有術(shù)語都與本發(fā)明所屬的本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義相同。此處公開全文所引用的所有專利、專利申請和出版物都以它們?nèi)牡男问奖灰?。若此處的某一術(shù)語含有多重的定義，則以本部分最通常的定義為準(zhǔn)。
[0034]此處所用術(shù)語“寡核苷酸”指核苷酸的一聚合物形式，核糖核苷酸或脫氧核糖核酸，含有天然或非天然的核苷酸，長度至少為2，通常在約5至約200，或者更常見地至約100。因此，該術(shù)語包含雙鏈和單鏈DNA和RNA。此外，寡核苷酸可抗核酸酶，包括但不限于2’ -0-甲基核糖核苷酸、硫代核苷酸、二硫代核苷酸、磷酰胺核苷酸和甲基膦酸酯核苷酸。
[0035]此處所用術(shù)語“目標(biāo)”、“目標(biāo)序列”或者“目標(biāo)核苷酸”指一含有一所關(guān)注的多聚核苷酸的核酸，需要對其進(jìn)行純