細(xì)胞外的二萜生產(chǎn)的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】細(xì)胞外的二萜生產(chǎn) 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及使用重組微生物生產(chǎn)二萜和/或糖基化二萜的方法。本發(fā)明還涉及一 種發(fā)酵液，其中所述發(fā)酵液包括通過(guò)這種方法可獲得的二萜和/或糖基化二萜。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 世界各地對(duì)高效甜味劑的需求不斷增長(zhǎng)，而且混合不同的人工甜味劑正在逐漸變 成一種常規(guī)做法。然而，對(duì)甜味劑替代品的需求預(yù)計(jì)將會(huì)增加。多年生草本植物一甜葉菊 (SteviarebaudianaBert.)一的葉子中積聚了大量極甜的化合物，它們被稱(chēng)為甜菊糖苷。 雖然這些化合物的生物學(xué)功能還不明確，但由于甜葉菊甜味劑是天然植物產(chǎn)品這一附加優(yōu) 勢(shì)，它們作為備選的高效甜味劑具有商業(yè)意義。
[0004] 這些甜的甜菊糖苷顯示出優(yōu)于許多高強(qiáng)度甜味劑的功能特性和感官性狀。此外， 研究表明甜菊苷（stevioside)能降低II型糖尿病人的血糖水平和中度高血壓患者的血 壓。
[0005] 甜菊糖苷積聚于甜菊葉中，它們可以占甜菊葉干重的5-20%。甜菊苷和萊苞迪苷 (rebaudioside)A都具有熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，因此適合用于飲料和許多其它食物中。甜 菊苷比蔗糖甜110-270倍，萊苞迪苷A比蔗糖甜150-320倍。此外，具有更好味道的萊苞迪 苷D也是積聚于甜菊葉的高效二萜糖苷甜味劑，它可能比蔗糖甜約200倍。
[0006] 目前，甜菊糖苷是從甜菊植物中提取的。在甜菊中，（-)_貝殼杉稀酸（kaurenoic acid，赤霉素（GA)生物合成的中間物）被轉(zhuǎn)換為四環(huán)的二萜一甜菊醇，然后甜菊醇繼續(xù)通 過(guò)多步驟的葡糖基化途徑形成各種甜菊糖苷。然而，產(chǎn)率是可變的并受農(nóng)業(yè)和環(huán)境條件的 影響。而且，種植甜菊需要大量陸地面積、收獲前的長(zhǎng)久時(shí)間、密集的勞動(dòng)力以及提取和純 化糖苷的額外費(fèi)用。
[0007] 為了滿足對(duì)高效、天然甜味劑日益增長(zhǎng)的商業(yè)需求，需要新的、更標(biāo)準(zhǔn)的、完全單 一成分的、沒(méi)有后味的糖苷來(lái)源。
[0008] 發(fā)明概沐
[0009] 在甜菊中，通過(guò)脫氧木酮糖磷酸酯途徑（deoxyxylulose5-phosphatepathway) 形成香葉基香葉基焦磷酸（GGPP)，甜菊醇就是從GGPP合成的。（-)-柯巴基二磷酸合酶 (copalyldiphosphatesynthase,CPS)和卜）-貝殼杉烯?合酶（kaurenesynthase,KS)這 兩個(gè)二萜環(huán)化酶的活性導(dǎo)致（-)_貝殼杉烯的形成，然后在一個(gè)三步驟的反應(yīng)中，（-)-貝殼 杉稀被貝殼杉稀氧化酶（kaureneoxidase，K0)氧化形成（-)-貝殼杉稀酸。
[0010] 在甜菊葉中，（-)_貝殼杉烯酸接著被內(nèi)根-貝殼杉烯酸13-羥化酶（KAH)羥基化 以形成甜菊醇。然后，甜菊醇被一系列UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶（UGTs)葡糖基化。
[0011] 本發(fā)明涉及使用微生物在細(xì)胞外生產(chǎn)二萜或糖基化二萜的方法，所述微生物能夠 產(chǎn)生二萜（例如甜菊醇）或糖基化二萜（即二萜糖苷，例如甜菊單糖苷、甜菊雙糖苷、甜菊 苷、萊苞迪苷A、萊苞迪苷B、萊苞迪苷C、萊苞迪苷D、萊苞迪苷E、萊苞迪苷F、甜葉懸鉤子苷 或杜克苷A)。
[0012]因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了生產(chǎn)二萜或糖基化二萜的方法，所述方法包括：
[0013]a.在合適的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵重組微生物，
[0014] 其中所述微生物包含編碼：具有內(nèi)根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽；具有內(nèi) 根-貝殼杉烯合酶活性的多肽；具有內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶活性的多肽；和具有貝殼杉烯 酸13-羥化酶活性的多肽的一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列，并且其中所述核苷酸序列的表達(dá)賦予 所述微生物生產(chǎn)至少甜菊醇的能力，
[0015] 其中二萜或糖基化二萜被排出/分泌/轉(zhuǎn)運(yùn)到所述細(xì)胞之外并且在發(fā)酵培養(yǎng)基中 在細(xì)胞外生產(chǎn)；及
[0016]b.從所述發(fā)酵培養(yǎng)基回收所述二萜或糖基化二萜。
[0017] 換言之，本發(fā)明的方法是細(xì)胞外的二萜或糖基化二萜生產(chǎn)方法。二萜或糖基化二 萜由生產(chǎn)宿主微生物排出到發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后從發(fā)酵培養(yǎng)基中物理和/或化學(xué)回收。因 此，二萜或糖基化二萜的回收被簡(jiǎn)化，并且其與需要從部分或完全在細(xì)胞內(nèi)生成并積累甜 菊醇糖苷的重組微生物本身回收這些化合物的方法相比在經(jīng)濟(jì)上可行。
[0018] 在本發(fā)明的方法中，重組微生物可包含編碼具有UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性（UGT)的 一個(gè)或多個(gè)多肽的一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列，
[0019] 其中所述核苷酸序列的表達(dá)賦予所述微生物生產(chǎn)甜菊單糖苷、甜菊雙糖苷、甜菊 苷、萊苞迪苷A、萊苞迪苷B、萊苞迪苷C、萊苞迪苷D、萊苞迪苷E、萊苞迪苷F、甜葉懸鉤子苷 或杜克苷A中的至少一種的能力。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明，還提供了：
[0021] -包含通過(guò)本發(fā)明的方法能夠獲得的二萜或糖基化二萜的發(fā)酵液；
[0022] -通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的或從本發(fā)明的發(fā)酵液能夠獲得的二萜或糖基化二萜；
[0023]-包含本發(fā)明的二萜或糖基化二萜的食品、飼料或飲料；和
[0024]-以上所定義的重組微生物在細(xì)胞外生產(chǎn)二萜或糖基化二萜的用途。
[0025] 附圖簡(jiǎn)沐
[0026] 圖1展示了質(zhì)粒pUG7_EcoRV的示意圖。
[0027] 圖2展示了設(shè)計(jì)ERG20、tHMGl和BTS1過(guò)表達(dá)盒（A)，并將其整合至酵母基因組（B) 的方法的示意圖。（C)顯示了利用Cre重組酶移除KANMX標(biāo)記后的最終狀態(tài)。
[0028] 圖3展示了ERG9敲低構(gòu)建體的示意圖。所述構(gòu)建體由500bpERG9的3'部分、 98bpTRP1的啟動(dòng)子、TRP1的開(kāi)放閱讀框和終止子以及之后的400bp長(zhǎng)的ERG9的下游序列 組成。由于在ERG9的開(kāi)放閱讀框的終點(diǎn)引入了Xbal位點(diǎn)，因此最后的氨基酸變成了絲氨 酸，終止密碼子變成了精氨酸。新的終止密碼子位于TRP1的啟動(dòng)子中，這導(dǎo)致延長(zhǎng)了 18個(gè) 氨基酸。
[0029] 圖4展示了將UGT2整合至基因組的示意圖。A.轉(zhuǎn)化中使用的不同片段；B.整合 后的狀態(tài)；C.Cre重組酶表達(dá)后的狀態(tài)。
[0030] 圖5展示了將GGPP到RebA的途徑整合至基因組的示意圖。A.轉(zhuǎn)化中使用的不同 片段；B.整合后的狀態(tài)。
[0031] 圖6展示了質(zhì)粒MB6754的示意圖。
[0032] 圖7展示了質(zhì)粒MB6761的示意圖。
[0033] 圖8展示了質(zhì)粒MB6762的示意圖。
[0034] 圖9展示了質(zhì)粒MB6775的示意圖。
[0035] 圖10展示了生物合成甜菊糖苷的潛在途徑的示意圖。
[0036] 圖11展示了從STV040去除UGT2基因的示意圖。
[0037] 序列表說(shuō)明
[0038] 表1展示了序列說(shuō)明。本文描述的序列可以引用序列表或數(shù)據(jù)庫(kù)訪問(wèn)號(hào)（同樣展 示于表1)來(lái)定義。
[0039] 發(fā)明詳沐
[0040] 在本說(shuō)明書(shū)和附屬的權(quán)利要求書(shū)的各個(gè)部分，詞語(yǔ)"包括"、"包含"和"具有"及其 變形應(yīng)被理解為包含性的。也就是說(shuō)，在語(yǔ)境允許的情況下，這些詞語(yǔ)意圖傳達(dá)的意思是： 可以包括其它沒(méi)有明確列舉的元素或整體。
[0041] 本文中不使用數(shù)量詞修飾時(shí)指的是一個(gè)或多于一個(gè)（即一個(gè)或至少一個(gè)）對(duì)象。 例如，"要素"可能意味著一個(gè)要素或多于一個(gè)要素。
[0042] 我們已經(jīng)證實(shí)本文所述的重組微生物能夠生產(chǎn)二萜或糖基化二萜，優(yōu)先在細(xì)胞外 生產(chǎn)所述二萜或糖基化二萜。因此，本發(fā)明涉及一種在細(xì)胞外生產(chǎn)二萜或糖基化二萜的方 法，所述方法包括使用重組微生物。本發(fā)明的方法通常為發(fā)酵方法，其中重組微生物在細(xì)胞 外生產(chǎn)二萜或糖基化二萜，即二萜或糖基化二萜被生產(chǎn)并被排出并且存在于發(fā)酵液中?？?直接從發(fā)酵液回收這種二萜或糖基化二萜，從而沒(méi)有從重組微生物（細(xì)胞內(nèi)）本身回收此 類(lèi)化合物的昂貴必要性。所述方法中使用的重組微生物是能夠生產(chǎn)二萜或糖基化二萜，通 常分別為甜菊醇或甜菊醇糖苷的重組微生物。
[0043] 產(chǎn)生和/或選擇在細(xì)胞外生產(chǎn)甜菊醇糖苷的重組微生物相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)有特別 優(yōu)勢(shì)，例如i)產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)上可行的產(chǎn)品，ii)產(chǎn)生更簡(jiǎn)單并且可調(diào)整規(guī)模的制備方法，iii)不 從細(xì)胞內(nèi)材料（包括DNA和可影響產(chǎn)品感官性質(zhì)的蛋白質(zhì)）中純化產(chǎn)品。需要強(qiáng)調(diào)的是，相 比于已知的生產(chǎn)方法，本發(fā)明的教導(dǎo)使得發(fā)酵性二萜如甜菊醇糖苷的生產(chǎn)成為商業(yè)現(xiàn)實(shí)。 特別地，重組微生物可為Yarrowia或Candida屬的微生物。
[0044] 為了本發(fā)明的目的，二萜通常意味著由4個(gè)異戊二烯單元組成的有機(jī)物。這種化 合物可來(lái)源于香葉基香葉基焦磷酸。糖基化二萜或二萜糖苷是一種結(jié)合有糖的二萜，其 中糖通常與非碳水化合物部分相結(jié)合。通常，在二萜糖苷中，糖基通過(guò)其異頭碳（anomric carbon)經(jīng)由糖苷鍵與另外一個(gè)基團(tuán)結(jié)合。優(yōu)選的二萜和二萜糖苷分別是甜菊醇和甜菊糖 苷。因此，特別地，本發(fā)明涉及能夠產(chǎn)生甜菊醇和甜菊糖苷的重組微生物。
[0045] 根據(jù)本發(fā)明，提供了一種在細(xì)胞外生產(chǎn)二萜或糖基化二萜的方法，所述方法包 括：
[0046]a.在合適的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵重組微生物，
[0047] 其中所述微生物包含編碼：
[0048] 具有內(nèi)根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽；
[0049] 具有內(nèi)根-貝殼杉烯合酶活性的多肽；
[0050] 具有內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶活性的多肽；和
[0051] 具有貝殼杉烯酸13-羥化酶活性的多肽的一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列，并且其中所述 核苷酸序列的表達(dá)賦予所述微生物生產(chǎn)至少甜菊醇的能力，
[0052] 其中在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中在細(xì)胞外生產(chǎn)二萜或糖基化二萜；以及
[0053] b.從所述發(fā)酵培養(yǎng)基回收所述二萜或糖基化二萜。
[0054] 用于本發(fā)明的重組微生物可為Yarrowia屬之一，例如Yarrowialipolytica， 或Candida屬之一，例如Candialipolytica。當(dāng)重組微生物為Yarrowia例如Yarrowia lipolytica時(shí)，糖基化二踏可優(yōu)先為萊茜迪苷A或萊茜迪苷D。用于本發(fā)明的重組微 生物可為Saccharomyces屬之一，例如Saccharomycescerevisiae。當(dāng)重組微生物為 Saccharomyces例如Saccharomycescerevisiae時(shí)，糖基化二踏可優(yōu)先為甜葉懸鉤子苷或 萊苞迪苷D。
[0055] 用于本發(fā)明的重組微生物包含編碼：
[0056] 具有內(nèi)根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽；
[0057] 具有內(nèi)根-貝殼杉烯合酶活性的多肽；
[0058] 具有內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶活性的多肽；和
[0059] 具有貝殼杉烯酸13-羥化酶活性的多肽的一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列，
[0060] 其中所述核苷酸序列的表達(dá)賦予所述微生物生產(chǎn)至少甜菊醇的能力。
[0061] 為了本發(fā)明的目的，具有內(nèi)根-柯巴基焦磷酸合酶（EC5. 5. 1. 13)活性的多肽能夠 催化如下化學(xué)反應(yīng)：
[0062]
[0063] 該酶有一種底物（香葉基香葉基焦磷酸）和一種產(chǎn)物（內(nèi)根-柯巴基焦磷酸）。 該酶參與赤霉素的生物合成。該酶屬于異構(gòu)酶家族，具體是分子內(nèi)的裂解酶類(lèi)。這種酶類(lèi) 的系統(tǒng)名稱(chēng)是內(nèi)根-柯巴基-二磷酸裂解酶（去環(huán)化）。其它的常用名包括內(nèi)根-柯巴基 焦磷酸合酶、內(nèi)根-貝殼杉烯合酶A和內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶A。
[0064] 為了本發(fā)明的目的，具有內(nèi)根-貝殼杉烯合酶（EC4. 2. 3. 19)活性的多肽能夠催化 下述化學(xué)反應(yīng)：
[0065] 內(nèi)根-柯巴基二磷酸#內(nèi)根-貝殼杉烯+二磷酸鹽
[0066] 因此，該酶有一種底物（內(nèi)根-柯巴基二磷酸）和兩種產(chǎn)物（內(nèi)根-貝殼杉烯和 二磷酸鹽）。
[0067] 該酶屬于裂解酶家族，具體是作用于磷酸酯的碳-氧裂解酶。這種酶類(lèi)的系統(tǒng)名 稱(chēng)是內(nèi)根-柯巴基-二磷酸二磷酸酯-裂解酶（環(huán)化，形成內(nèi)根-貝殼杉烯）。其它的常 用名包括內(nèi)根-貝殼杉烯合酶B、內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶B、內(nèi)根-柯巴基-二磷酸二磷酸 酯-裂解酶和（環(huán)化）。該酶參與二萜類(lèi)化合物的生物合成。
[0068] 內(nèi)根-柯巴基二磷酸合酶還可以有與同一蛋白質(zhì)分子關(guān)聯(lián)的不同的內(nèi)根-貝殼杉 烯合酶的活性。內(nèi)根-貝殼杉烯合酶催化的反應(yīng)是赤霉素生物合成途徑中的下一個(gè)步驟。 這兩種類(lèi)型的酶活性是不同的，抑制蛋白質(zhì)的內(nèi)根-貝殼杉烯合酶活性的定點(diǎn)突變導(dǎo)致內(nèi) 根-柯巴基焦磷酸的積累。
[0069] 因此，本發(fā)明使用的單個(gè)核苷酸序列可編碼具有內(nèi)根-柯巴基焦磷酸合酶活性和 內(nèi)根-貝殼杉烯合酶活性的多肽。或者，可以用兩段不同的、分開(kāi)的核苷酸序列編碼這兩種 活性。
[0070] 為了本發(fā)明的目的，具有內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶（EC1. 14. 13.78)活性的多肽能夠 催化內(nèi)根-貝殼杉烯的4-甲基的連續(xù)三次氧化以產(chǎn)生貝殼杉烯酸。這種活性通常需要細(xì) 胞色素P450的存在。
[0071] 為了本發(fā)明的目的，具有貝殼杉烯酸13-羥化酶活性（EC1. 14. 13)活性的多肽能 夠催化利用NADPH和02形成甜菊醇（對(duì)映-貝殼杉-16-烯-13-醇-19-羧酸）的反應(yīng)。 這種活性也可被稱(chēng)為內(nèi)根-貝殼杉烯13-羥化酶活性。
[0072] 在本發(fā)明方法中使用的重組微生物可包括一種或多種核苷酸序列，其中所述核苷 酸序列編碼具有UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶（UGT)活性的多肽，通過(guò)所述核苷酸序列的表達(dá)使重組 微生物能夠生產(chǎn)甜菊單糖苷、甜菊雙糖苷、甜菊苷或萊苞迪苷A、萊苞迪苷B、萊苞迪苷C、萊 苞迪苷D、萊苞迪苷E、萊苞迪苷F、甜葉懸鉤子苷、杜克苷A中的至少一種。
[0073] 為了本發(fā)明的目的，具有UGT活性的多肽具有糖基轉(zhuǎn)移酶（EC2.4)活性，即作為 催化劑能夠催化單糖基團(tuán)從有活性的的核苷酸糖（又稱(chēng)"糖基供體"）轉(zhuǎn)移至糖基受體分子 (通常是醇）。UGT的糖基供體通常是核苷酸糖尿苷二磷酸葡萄糖（尿嘧啶-二磷酸葡萄 糖，UDP-葡萄糖）。
[0074] 可以選擇所使用的UGTs以產(chǎn)生期望的二踏糖苷，例如甜菊糖苷。Humphrey等 人，PlantMolecularBiology(2006)61:47_62 和Mohamed等人，J.PlantPhysiology 168(2011) 1136-1141中展示了甜菊糖苷形成的示意圖。此外，圖10展示了甜菊糖苷形成的 示意圖。
[0075] 萊苞迪苷A的生物合成涉及糖苷配基甜菊醇的葡糖基化。具體而言，萊苞迪苷A 可通過(guò)以下步驟形成：首先葡糖基化甜菊醇的13-0H形成13-0-甜菊單糖苷，然后葡糖基化 甜菊單糖苷的13-0-葡萄糖的C-2'形成甜菊醇-1，2二糖苷，接著葡糖基化甜菊醇-1，2二 糖苷的C-19羥基形成甜菊糖苷，以及葡糖基化甜菊糖苷的C-13-0-葡萄糖的C-3'形成萊 苞迪苷A。各個(gè)葡糖基化反應(yīng)發(fā)生的順序可以變化一參見(jiàn)圖10。如該示意圖中所示，一種 UGT可以能夠催化不止一種轉(zhuǎn)換。
[0076] 通過(guò)在重組宿主中表達(dá)編碼功能UGTs(UGT74G1、UGT85C2、UGT76G1和UGT2)的基 因，可以實(shí)現(xiàn)從甜菊醇到萊苞迪苷A或萊苞迪苷D的轉(zhuǎn)換。因此，當(dāng)表達(dá)這四種UGTs的用 于本發(fā)明方法中的重組微生物產(chǎn)生甜菊醇或向培養(yǎng)基中補(bǔ)加甜菊醇時(shí)，該微生物能夠制造 萊苞迪苷A。通常，這些基因中的一個(gè)或多個(gè)是重組基因，它們被轉(zhuǎn)化到天生不具有這些基 因的微生物中。所有這些酶的實(shí)例都展示在表1中。本發(fā)明的微生物可能包括UGT74G1、 UGT85C2、UGT76G1和UGT2的任意組合。在表1中，序列UGT64G1被表示為序列UGT1，序列 UGT74G1被表示為序列UGT3,序列UGT76G1被表示為序列UGT4,序列UGT2被表示為序列 UGT2。
[0077] 適合用于本發(fā)明的包括編碼具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重組微生物可 以包括一種核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼能夠催化向甜菊醇添加C-13-葡萄糖的 多肽。也就是說(shuō)，適合用于本發(fā)明方法中的微生物可包括能夠催化將甜菊醇轉(zhuǎn)換為甜菊單 糖苷的UGT。因此，這種核苷酸序列的表達(dá)可以使重組微生物至少能產(chǎn)生甜菊單糖苷。
[0078] 這種微生物可包括編碼具有UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶（UGT)UGT85C2所顯示的活性的多肽 的核苷酸序列，通過(guò)將所述核苷酸序列轉(zhuǎn)化至微生物中，使細(xì)胞能夠?qū)⑻鹁沾嫁D(zhuǎn)換為甜菊 單糖苷。
[0079]UGT85C2的活性是向甜菊醇的13-0H轉(zhuǎn)移一個(gè)葡萄糖單元。因此，合適的UGT85C2 可以起尿嘧啶5' -二磷酸葡糖基：甜菊醇13-0H轉(zhuǎn)移酶和尿嘧啶5' -二磷酸葡糖基：甜菊 醇-19-0-葡糖苷13-0H轉(zhuǎn)移酶的作用。功能UGT85C2多肽還可以催化葡糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)， 該反應(yīng)利用甜菊糖苷，而非甜菊醇和甜菊醇-19-0-葡糖苷作為底物。這種序列在表1中被 表示為序列UGT1。
[0080]用于本發(fā)明方法的包括編碼具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重組微生物還 可以包括一種核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼能夠催化向甜菊醇或甜菊單糖苷添加 C-13-葡萄糖的多肽。也就是說(shuō)，合適的微生物可包括能夠催化將甜菊單糖苷轉(zhuǎn)換為甜菊雙 糖苷的UGT。因此，這種微生物可以將甜菊單糖苷轉(zhuǎn)換為甜菊雙糖苷。這種核苷酸序列的表 達(dá)可以使重組微生物至少能產(chǎn)生甜菊雙糖苷。
[0081] 適合用于本發(fā)明方法的微生物還可以包括編碼具有UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶（UGT) UGT74G1所顯示的活性的多肽的核苷酸序列，通過(guò)將所述核苷酸序列轉(zhuǎn)化至微生物中，使細(xì) 胞能夠?qū)⑻鹁諉翁擒辙D(zhuǎn)換為甜菊雙糖苷。
[0082] 適合用于本發(fā)明方法的微生物還可以包括編碼具有UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶（UGT)UGT2 所顯示的活性的多肽的核苷酸序列，通過(guò)將所述核苷酸序列轉(zhuǎn)化至微生物中，使細(xì)胞能夠 將甜菊單糖苷轉(zhuǎn)換為甜菊雙糖苷。
[0083] 合適的UGT2多肽起著尿嘧啶5' -二磷酸葡糖基：甜菊醇-13-0-葡糖苷轉(zhuǎn)移酶（也 被稱(chēng)為甜菊醇-13-單葡糖苷1，2-轉(zhuǎn)葡糖基酶）的作用，它將葡萄糖部分轉(zhuǎn)移至受體分子 (甜菊醇-13-0-葡糖苷）的13-0-葡萄糖的C-2'。通常，合適的UGT2多肽還起著尿嘧啶 5'-二磷酸葡糖基：甜葉懸鉤子苷轉(zhuǎn)移酶的作用，它將葡萄糖部分轉(zhuǎn)移至受體分子（甜葉懸 鉤子苷）的13-0-葡萄糖的C-2'。
[0084] 功能性UGT2多肽還可以催化利用甜菊糖苷，而非甜菊醇-13-0-葡糖苷和甜葉懸 鉤子苷作為底物的反應(yīng)，例如功能UGT2多肽可以利用甜菊苷作為底物，將葡萄糖部分轉(zhuǎn)移 至19-0-葡萄糖殘基的C-2'以產(chǎn)生萊苞迪苷E。功能UGT2多肽還可以利用萊苞迪苷A作 為底物，將葡萄糖部分轉(zhuǎn)移至19-0-葡萄糖殘基的C-2'以產(chǎn)生萊苞迪苷D。但是功能UGT2 多肽通常不能將葡萄糖部分轉(zhuǎn)移至C-13位有1，3-鍵葡萄糖的甜菊醇化合物，即不能將葡 萄糖部分轉(zhuǎn)移至甜菊醇1，3-二苷和1，3-甜菊苷。功能UGT2多肽還可以從不同于尿嘧啶二 磷酸葡萄糖的其他供體轉(zhuǎn)移糖部分。例如，功能UGT2多肽可以起尿嘧啶5' -二磷酸D-木糖 基：甜菊醇-13-0-葡糖苷轉(zhuǎn)移酶的作用，將木糖部分轉(zhuǎn)移至受體分子（甜菊醇-13-0-葡糖 苷）的13-0-葡萄糖的C-2'。又例如，功能UGT2多肽能夠起尿嘧啶5' -二磷酸L-鼠李糖 基：甜菊醇-13-0-葡糖苷轉(zhuǎn)移酶的作用，將鼠李糖部分轉(zhuǎn)移至受體分子（甜菊醇-13-0-葡 糖苷）的13-0-葡萄糖的C-2'。這種序列在表1中被表示為序列UGT2。
[0085] 適合用于本發(fā)明方法的包括編碼具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重組微 生物還可以包括一種核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼能夠催化向甜菊雙糖苷添加 C-19-葡萄糖的多肽。也就是說(shuō)，這樣的微生物可包括能夠催化將甜菊雙糖苷轉(zhuǎn)換為甜菊苷 的UGT。因此，這種微生物可以將甜菊雙糖苷轉(zhuǎn)換為甜菊苷。這種核苷酸序列的表達(dá)可以使