本發(fā)明涉及一種含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束及其制備方法和應(yīng)用，屬于抗腫瘤藥物制備技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

千金子二萜醇酯類化合物，又稱千金子素，具有瀉下、抗腫瘤、抗白血病等藥理作用，現(xiàn)代研究證實(shí)該類化合物主要通過對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用或增加多藥耐藥性細(xì)胞對(duì)常規(guī)抗腫瘤藥物的敏感性來發(fā)揮抗腫瘤作用。

千金子素對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用：張建業(yè)等（zhangjy,liangyj,chenhb,etal.structureidentificationofeuphorbiafactorl3anditsinductionofapoptosisthroughthemitochondrialpathway[j].molecules,2011,16(4):3222-3231）用mtt法檢測出千金子素l1對(duì)人肺癌a549細(xì)胞的ic50為51.34±3.28μm；千金子素l3對(duì)人肺癌a549細(xì)胞、人結(jié)腸癌lovo細(xì)胞和人乳腺癌mcf-7細(xì)胞的ic50分別為34.04±3.99，41.67±3.02和45.28±2.56μm。luj等（luj,lig,huangj,etal.lathyrane-typediterpenoidsfromtheseedsofeuphorbialathyris[j].phytochemistry,2014,104(8):79-88）研究表明千金子素l2人乳腺癌mcf-7細(xì)胞顯示出細(xì)胞毒性（ic50=12.4-23.1μm），對(duì)大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤c6細(xì)胞也有一定毒性作用。

千金子素抗腫瘤多藥耐藥作用：jiaow等（jiaow,dongw,liz,etal.lathyranediterpenesfromeuphorbialathyrisasmodulatorsofmultidrugresistanceandtheircrystalstructures[j].bioorgmedchem,2009,17(13):4786-4792）研究發(fā)現(xiàn)千金子素的耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)與陽性對(duì)照逆轉(zhuǎn)倍數(shù)（rf=2.95）比較，千金子素l2（rf=12.84）>千金子素l8（rf=8.03）>千金子素l3（rf=6.57）>千金子素l1（rf=4.40）。張建業(yè)等（zhangjy,zhangc,chenhb,etal.assignmentsof1hand13cnmrsignalsofeuphorbiafactorl1andinvestigationofitsanticanceractivityinvitro[j].jmedplantres,2010,4(4):335-338.zhangjy,miyj,chensp,etal.euphorbiafactorl1reversesabcb1-mediatedmultidrugresistanceinvolvinginteractionwithabcb1independentofabcb1downregualtion[j].jcellbiochem,2011,112(4):1076-1083）發(fā)現(xiàn)千金子素l1可顯著增加多藥耐藥性kbv200和mcf-7/adr細(xì)胞對(duì)常規(guī)抗腫瘤藥物長春新堿和阿霉素的敏感性，且證實(shí)千金子素l1可濃度依賴性的逆轉(zhuǎn)abcb1（p-糖蛋白）介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥，最多逆轉(zhuǎn)倍數(shù)高達(dá)25倍。choijs等（choijs,kangns,minyk,etal.euphorbiasteroidreversesp-glycoproteinmediatedmulti-drugresistanceinhumansarcomacelllinemes-sa/dx5[j].phytotherres,2010,24(7):1042-1046）證實(shí)千金子素l1即使在低濃度（1-3μm）亦可恢復(fù)長春花堿、紫杉醇和阿霉素抗癌藥物對(duì)mes-sa/dx5細(xì)胞的毒性。

但是千金子素極性小，屬難溶性成分，在水中溶解度小。李鳳英等（李鳳英,王英姿,李韶菁,等.千金子制霜前后提取物中主要二萜醇酯類成分的大鼠腸吸收特性研究[j].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2017,19(5):17-19）研究表明千金子素的溶解性差，不能直接溶于k-r液中，在供試液配置時(shí)加入少量吐溫80，結(jié)果增溶效果明顯。吳瑞環(huán)等（吳瑞環(huán),張振凌,王瑞生,等.千金子水煎液中4種有效成分含量測定[j].中國中醫(yī)藥信息雜志,2015,22(7):89-92）發(fā)現(xiàn)千金子中含有的3種二萜醇酯類成分極性較小，用水煎煮難以溶出，所以千金子（打碎）水煎液中3種二萜醇酯類成分含量較低，未打碎的千金子入煎劑則未檢出。段飛鵬等（段飛鵬,王英姿,李韶菁,等.千金子甾醇在caco-2細(xì)胞單層模型中的吸收研究[j].中草藥,2014,45(21):3136-3140）研究發(fā)現(xiàn)不同濃度千金子素l1的papp均介于1×10^-5-1×10^-6，表明其在腸道中的吸收為中等吸收?？梢姡Ы鹱铀厮苄圆?，胃腸吸收效果不理想，使?jié)撛诘幕钚圆荒艹浞职l(fā)揮，進(jìn)而影響了該類化合物在臨床中的開發(fā)與使用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)千金子素水溶性差，胃腸吸收效果不理想，使?jié)撛诘幕钚圆荒艹浞职l(fā)揮等問題，本發(fā)明提供一種含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束。

本發(fā)明的另一目的是提供一種簡便可行的上述混合膠束的制備方法。

本發(fā)明的再一目的是提供一種含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。

一種含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束，包括以下成分：千金子素，千金子脂肪油和脫氧膽酸鹽，所述千金子素、千金子脂肪油與脫氧膽酸鹽的質(zhì)量比為1-3:20-200:8-16。

所述含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束，采用以下方法制備獲得：

將千金子素、千金子脂肪油、脫氧膽酸鹽分別溶于適當(dāng)溶劑中；千金子素溶液與千金子脂肪油溶液混合，脫溶劑制成脂膜；脫氧膽酸鹽溶液與脂膜混合后超聲，離心，取上清液過濾，濾液即為含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束溶液，冷凍干燥即得含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束制劑。

所述含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束的平均粒徑為100-200nm。

所述千金子素為千金子素l1，l2，l3和l8中的至少一種，其結(jié)構(gòu)式如下式（i）-式（iv）所示：

式（i）式（ii）

式（iii）式（iv）

所述千金子脂肪油，不含千金子素。

所述千金子脂肪油，采用千金子粉碎后醇提經(jīng)柱層析獲得。

一種上述含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束的制備方法，包括以下步驟：

（1）將千金子素、千金子脂肪油、脫氧膽酸鹽分別溶于適當(dāng)溶劑中，制成溶液；

（2）將千金子素溶液與千金子脂肪油溶液混合，脫溶劑制成脂膜；

（3）脫氧膽酸鹽溶液與脂膜混合后超聲，離心，取上清液過濾，濾液即為含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束溶液；

（4）將含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束溶液冷凍干燥，即得。

步驟（1）中千金子素與千金子脂肪油的溶劑為乙酸乙酯；脫氧膽酸鹽的溶劑為0.01mol/lph7.0-7.4的磷酸緩沖液；

所述千金子素的濃度為1-3mg/ml；千金子脂肪油的濃度優(yōu)選為10-100mg/ml；脫氧膽酸鹽的濃度為0.1-2mg/ml；

所述脫氧膽酸鹽為脫氧膽酸鈉。

步驟（2）千金子素溶液與千金子脂肪油溶液的體積比為1:1。

步驟（3）超聲溫度為35-65℃，超聲時(shí)間為20-60min；

離心速度為5000-18000r/min，離心時(shí)間為2-30min；

過濾方式為濾膜過濾，濾膜孔徑為0.22μm。

步驟（4）冷凍干燥前加入甘露醇，用量為溶液體積的5%。

一種上述千金子脂肪油的制備方法，采用以下步驟：

（1）將千金子粉碎為千金子粉；

（2）將千金子粉醇提，得醇提液；

（3）將醇提液脫溶劑后過柱層析，洗脫物即為千金子脂肪油。

所述千金子粉的粒度小于20目；

所述千金子粉與低級(jí)脂肪醇的質(zhì)量比為1:8-20；

所述醇為低級(jí)脂肪醇，選自甲醇、乙醇、異丙醇中的至少一種，優(yōu)選為乙醇；

所述醇提次數(shù)為1-3次；

所述柱層析填料為硅膠，粒度為100-200目；

所述柱層析的洗脫溶劑選自石油醚或正己烷，所述石油醚為60-90℃沸程。

一種上述含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明利用千金子自身所含的脂肪油和外加脫氧膽酸鹽的自組裝膠束能力，將千金子二萜醇酯類化合物包裹或荷載，制得了均勻、穩(wěn)定地納米級(jí)混合膠束。改變了藥物的存在形態(tài)，不僅顯著提高了千金子二萜醇酯化合物在水中的溶解度，還有利于被動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程，使得該類化合物的腸吸收效果顯著提高。

附圖說明

圖1為含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束的顯微圖片；

圖2為不含千金子脂肪油的千金子素-膽鹽膠束的顯微圖片；

圖3為含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束的粒徑分布圖；

圖4為不含千金子脂肪油的千金子素-膽鹽膠束的粒徑分布圖；

圖5為含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束對(duì)千金子素的增溶效果圖；

圖6為含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束中千金子素在全腸段的ka變化圖；

圖7為含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束中千金子素在全腸段的peff變化圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不受下述實(shí)施例的限制。

實(shí)施例1千金子脂肪油的制備。

（1）將千金子粉碎為通過20目篩的千金子粉；

（2）將1000g千金子粉以20000g乙醇提取3次，合并得醇提液；

（3）將醇提液回收除去乙醇后使通過粒度為100-200目的硅膠柱層析，以石油醚（60-90℃）為洗脫溶劑進(jìn)行洗脫，洗脫物即為千金子脂肪油。

實(shí)施例2含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束的制備。

（1）200mg脫氧膽酸鈉溶于ph=7.4的0.01m磷酸緩沖液（pbs）中，得0.2mg/ml的脫氧膽酸鈉溶液；

稱取5mg的千金子素l1、l2、l3和l8于乙酸乙酯中溶解，得各單體濃度分別為1mg/ml的千金子素混合溶液；

稱取實(shí)施例1中獲得的千金子脂肪油2g于乙酸乙酯中溶解，得20mg/ml的脂肪油溶液。

（2）分別將上述千金子素混合溶液和千金子脂肪油溶液各取1ml，置同一圓底燒瓶中，于40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，揮盡乙酸乙酯，將圓底燒瓶置真空干燥箱，常溫抽真空過夜以除去殘存的乙酸乙酯，制成脂膜。

（3）取80ml脫氧膽酸鈉溶液加入上述脂膜的圓底燒瓶中，將脂膜與膽鹽溶液在35℃水浴中超聲混合60min，轉(zhuǎn)移至離心管中，常溫5000r/min離心30min，吸取上清液，0.22μm濾膜過濾，得到澄清的溶液即為含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束溶液s1。

對(duì)比例1不含千金子脂肪油的千金子素-膽鹽膠束的制備。

（1）200mg脫氧膽酸鈉溶于ph=7.4的0.01m磷酸緩沖液（pbs）中，得0.2mg/ml的脫氧膽酸鈉溶液；

稱取5mg的千金子素l1、l2、l3和l8于乙酸乙酯中溶解，得各單體濃度分別為1mg/ml的千金子素混合溶液。

（2）取上述千金子素混合溶液1ml，置圓底燒瓶中，于40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，揮盡乙酸乙酯，將圓底燒瓶置真空干燥箱，常溫抽真空過夜以除去殘存的乙酸乙酯，制成脂膜。

（3）取80ml脫氧膽酸鈉溶液加入上述脂膜的圓底燒瓶中，將脂膜與膽鹽溶液在35℃水浴中超聲混合60min，轉(zhuǎn)移至離心管中，常溫5000r/min離心30min，吸取上清液，0.22μm濾膜過濾，得到澄清的溶液即為千金子素-膽鹽膠束溶液c1。

實(shí)施例3含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束的表征。

3.1形態(tài)

通過高分辨率透射電子顯微鏡對(duì)實(shí)施例2與對(duì)比例1中的溶液進(jìn)行表征，含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束溶液的顯微照片如圖1所示，千金子素-膽鹽膠束溶液的顯微照片如圖2所示。由圖1和圖2可見，千金子脂肪油存在的情況下，千金子二萜醇酯類化合物在脫氧膽酸鈉溶液中形成的膠束形態(tài)更規(guī)則，粒徑更均一，分布更均勻。

3.2粒徑分布及zeta電位

zetasizer3000hsinstrument(malverninstruments,malvern,uk)在25oc、he-ne激光測定實(shí)施例2樣品溶液s1與對(duì)比例1樣品溶液c1的粒徑與zeta電位。樣品溶液s1的平均粒徑為135.8nm，zeta電位為-22.35mv，粒徑分布圖如圖3所示；樣品溶液c1的平均粒徑為565.2nm，zeta電位為-1.58mv，粒徑分布圖如圖4所示；粒徑分布圖中橫坐標(biāo)為粒徑大小，縱坐標(biāo)為粒徑分布。由兩者平均粒徑數(shù)值及圖3與圖4可知，千金子素在脫氧膽酸鈉溶液中可生成膠束，但膠束的粒徑大小不一，zeta電位較小，生成膠束穩(wěn)定性差；但在有適量千金子脂肪油存在的情況下，形成較均一的膠束粒徑，形成的膠束粒徑較均一、穩(wěn)定性更好。

實(shí)施例4含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束中千金子素的含量測定

采用hplc法測定混合膠束中千金子素的含量，方法如下：

對(duì)照品溶液制備：取千金子素l1、l2、l3和l8對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml中含千金子素l1、l2、l3和l850μg的混合溶液，搖勻，即得。

供試品溶液的制備：精密量取10ml所制成不同千金子脂肪油含量的含千金子素的混合膠束溶液，置分液漏斗中，以乙酸乙酯提取2次，每次10ml，合并提取液，水浴蒸干，以甲醇溶解，稀釋定容至2ml量瓶中，搖勻，作為供試品溶液。

色譜條件：inertsilods-3(5μm，250mm×4.6mm)，流動(dòng)相為甲醇-水(75∶25)，流速1.0ml·min^-1，檢測波長275nm，進(jìn)樣量20μl。

實(shí)施例5含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束對(duì)千金子素的增溶。

取不同量的千金子脂肪油置容量瓶，分別加乙酸乙酯溶解稀釋至刻度，獲得濃度為0、2.5、5、7.5、10、15、20、25、50、100mg/ml的脂肪油溶液。按實(shí)施例2的方法制成不同千金子脂肪油含量的千金子素混合膠束溶液。按照實(shí)施例5的方法測定混合膠束中4種千金子素的含量。

以不同千金子脂肪油濃度（不同千金子脂肪油加入量）為橫坐標(biāo)，以4種千金子素在該溶液中的溶解度為縱坐標(biāo)作圖，見圖5。由圖5可見，脂肪油的加入，使千金子素的溶解量增大；并且，在一定范圍內(nèi)，隨著脂肪油濃度（即加入量）的增加，千金子素的溶解度顯著提高。脂肪油濃度為10mg/ml時(shí)，千金子素的溶解度就已增加2-3倍，脂肪油濃度達(dá)到100mg/ml，千金子素的溶解度就已達(dá)平臺(tái)，再增加脂肪油的用量，其增溶效果不顯著，故千金子脂肪油的濃度優(yōu)選為10-100mg/ml。

實(shí)施例6含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束中千金子素在腸道中的吸收效果。

6.1灌流液的制備

取不同量的千金子脂肪油置容量瓶，分別加乙酸乙酯溶解稀釋至刻度，獲得濃度為0、10、20、50、100mg/ml的脂肪油溶液。考慮到人與大鼠給藥劑量換算，千金子素l1、l2、l3和l8于乙酸乙酯中溶解，得各單體濃度分別為20μg/ml的千金子素混合溶液。按實(shí)施例2的方法制成不同千金子脂肪油含量的千金子素混合膠束溶液，作為灌流液。

6.2在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?/p>

雌性wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，在灌流實(shí)驗(yàn)前禁食12h，自由飲水。腹腔注射10%水合氯醛（3ml·kg^-1）麻醉，背位固定于手術(shù)臺(tái)上，沿大鼠腹中線劍突下2cm，打開腹腔，分離待考察的腸段（全段小腸：上端自胃部幽門下行1cm，下端自盲腸上行1cm），兩端處各剪一個(gè)v型小口，將硅膠管小心插入并結(jié)扎，應(yīng)注意避免傷及血管，恰當(dāng)擺向?qū)嶒?yàn)?zāi)c段使灌流液能流通順暢為宜，用浸有生理鹽水的脫脂棉覆蓋傷口保濕，同時(shí)紅外燈保溫。用37℃預(yù)熱的生理鹽水從腸上端開口輕緩沖洗腸道（方向勿反），直至將腸內(nèi)容物沖洗干凈，通空氣排凈生理鹽水，接著用預(yù)熱的ph6.8的krebs-ringer’s緩沖液作為腸灌流液（37℃）進(jìn)行在體單向灌流，以建立灌流體系，灌流方向要與腸道沖洗方向一致。實(shí)驗(yàn)開始前以實(shí)驗(yàn)灌流液（37℃）灌充腸段，以0.2ml·min^-1的速度平衡lh后，從第一滴供試液滴下開始計(jì)時(shí)，進(jìn)口處用己知重量的裝有實(shí)驗(yàn)灌流液的小瓶灌流，保持恒流泵流速不變，同時(shí)出口處放另一已知重量的空小瓶收集流出液，每隔15min迅速更換下一對(duì)稱定重量的盛有實(shí)驗(yàn)灌流液的小瓶和空的收集液小瓶，放冷至室溫后，稱量灌流液小瓶和收集液小瓶的重量，共收集8個(gè)時(shí)間段的樣品，實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間為120min。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將該腸段剪下，沿腸管剪開，平鋪于坐標(biāo)紙上，測量小腸內(nèi)徑與長度。

6.3腸灌流液中千金子素的測定

按實(shí)施例4中方法測定4種千金子素的含量。

6.4數(shù)據(jù)處理

采用質(zhì)量分析法對(duì)灌流液的流入與流出體積進(jìn)行校正（采用重量法計(jì)算，假設(shè)進(jìn)出口的灌流液密度一樣，并用進(jìn)入液和流出液的質(zhì)量分別表示進(jìn)入液和流出液的體積），按下列方程式計(jì)算吸收速率常數(shù)ka和小腸表觀吸收系數(shù)peff。

；

。

式中：

cin和cout分別為該腸段進(jìn)入液和流出液的濃度（μg·ml^-1）；

vin和vout分別為該腸段灌流液的流入與流出體積（ml，用進(jìn)入液和流出液的質(zhì)量分別表示）；

qin為灌流速度（ml·min^-1）；

v為該灌流腸段的體積（cm³），v=πr²l，1ml=1cm³；

a為該灌流腸段的表面積（cm²），a=2πrl；

r為該腸段半徑（cm）；

l為該腸段的長度（cm）；

ka為吸收速率常數(shù)（min^-1）；

peff為該腸段表觀吸收系數(shù)（cm·min^-1）。

以不同千金子脂肪油濃度（不同千金子脂肪油加入量）為橫坐標(biāo)，以4種千金子素在全腸段吸收的ka及peff值為縱坐標(biāo)作圖，見圖6和圖7。由圖6、圖7可見，脂肪油的加入，使千金子素的ka及peff值增大；并且，在一定范圍內(nèi)，隨著脂肪油加入量的增加，千金子素的ka及peff值顯著升高，吸收率顯著提高。千金子脂肪油的適量加入可提高千金子素的腸吸收效果。

實(shí)施例6含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束的制備。

（1）100mg脫氧膽酸鈉溶于ph=7.4的0.01m磷酸緩沖液（pbs）中，得1mg/ml的脫氧膽酸鈉溶液；

分別稱取5mg千金子素l1、l2、l3、l8于乙酸乙酯中溶解，得1mg/ml的千金子素l1、l2、l3、l8的混合溶液；

稱取實(shí)施例1中獲得的千金子脂肪油1g于乙酸乙酯中溶解，得100mg/ml的脂肪油溶液。

（2）上述千金子素混合溶液和千金子脂肪油溶液各取1ml，置圓底燒瓶中，于40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，揮盡乙酸乙酯，將圓底燒瓶置真空干燥箱，常溫抽真空過夜以除去殘存的乙酸乙酯，制成脂膜。

（3）取80ml脫氧膽酸鈉溶液加入上述脂膜的圓底燒瓶中，將脂膜與膽鹽溶液在45℃水浴中超聲混合60min，轉(zhuǎn)移至離心管中，常溫12000r/min離心20min，吸取上清液，0.22μm濾膜過濾，得到澄清的溶液即為含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束溶液s2。

（4）將步驟（3）獲得的溶液s2加入凍干保護(hù)劑甘露醇進(jìn)行冷凍干燥，即得含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束固體制劑。

實(shí)施例7含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束的制備。

（1）50mg脫氧膽酸鈉溶于ph=7.4的0.01m磷酸緩沖液（pbs）中，得0.5mg/ml的脫氧膽酸鈉溶液；

分別稱取10mg千金子素l1、l2、l3、l8于乙酸乙酯中溶解，得2mg/ml的千金子素l1、l2、l3、l8的混合溶液；

稱取實(shí)施例1中獲得的千金子脂肪油0.5g于乙酸乙酯中溶解，得50mg/ml的脂肪油溶液。

（2）上述千金子素混合溶液和千金子脂肪油溶液各取1ml，置圓底燒瓶中，于40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，揮盡乙酸乙酯，將圓底燒瓶置真空干燥箱，常溫抽真空過夜以除去殘存的乙酸乙酯，制成脂膜。

（3）取80ml脫氧膽酸鈉溶液加入上述脂膜的圓底燒瓶中，將脂膜與膽鹽溶液在50℃水浴中超聲混合40min，轉(zhuǎn)移至離心管中，常溫15000r/min離心15min，吸取上清液，0.22μm濾膜過濾，得到澄清的溶液即為含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束溶液s3。

（4）將步驟（3）獲得的溶液s3加入凍干保護(hù)劑甘露醇進(jìn)行冷凍干燥，即得含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束固體制劑。

實(shí)施例8含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束的制備。

（1）0.2g脫氧膽酸鈉溶于ph=7.4的0.01m磷酸緩沖液（pbs）中，得2mg/ml的脫氧膽酸鈉溶液；

分別稱取15mg千金子素l1、l2、l3、l8于乙酸乙酯中溶解，得3mg/ml的千金子素l1、l2、l3、l8的混合溶液；

稱取實(shí)施例1中獲得的千金子脂肪油0.8g于乙酸乙酯中溶解，得80mg/ml的脂肪油溶液。

（2）上述千金子素混合溶液和千金子脂肪油溶液各取1ml，置圓底燒瓶中，于40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，揮盡乙酸乙酯，將圓底燒瓶置真空干燥箱，常溫抽真空過夜以除去殘存的乙酸乙酯，制成脂膜。

（3）取80ml脫氧膽酸鈉溶液加入上述脂膜的圓底燒瓶中，將脂膜與膽鹽溶液在60℃水浴中超聲混合20min，轉(zhuǎn)移至離心管中，常溫8000r/min離心30min，吸取上清液，0.22μm濾膜過濾，得到澄清的溶液即為含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束溶液s4。

（4）將步驟（3）獲得的溶液s4加入凍干保護(hù)劑甘露醇進(jìn)行冷凍干燥，即得千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束固體制劑。

實(shí)施例9含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束的制備。

（1）40mg脫氧膽酸鈉溶于ph=7.4的0.01m磷酸緩沖液（pbs）中，得0.4mg/ml的脫氧膽酸鈉溶液；

分別稱取5mg千金子素l1、l2、l3、l8于乙酸乙酯中溶解，得1mg/ml的千金子素l1、l2、l3、l8的混合溶液；

稱取實(shí)施例1中獲得的千金子脂肪油0.2g于乙酸乙酯中溶解，得20mg/ml的脂肪油溶液。

（2）上述千金子素混合溶液和千金子脂肪油溶液各取1ml，置圓底燒瓶中，于40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，揮盡乙酸乙酯，將圓底燒瓶置真空干燥箱，常溫抽真空過夜以除去殘存的乙酸乙酯，制成脂膜。

（3）取80ml脫氧膽酸鈉溶液加入上述脂膜的圓底燒瓶中，將脂膜與膽鹽溶液在35℃水浴中超聲混合40min，轉(zhuǎn)移至離心管中，常溫5000r/min離心30min，吸取上清液，0.22μm濾膜過濾，得到澄清的溶液即為含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束溶液s5。

（4）將步驟（3）獲得的溶液s5加入凍干保護(hù)劑甘露醇進(jìn)行冷凍干燥，即得千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束固體制劑。

實(shí)施例10含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束的制備。

（1）80mg脫氧膽酸鈉溶于ph=7.4的0.01m磷酸緩沖液（pbs）中，得0.8mg/ml的脫氧膽酸鈉溶液；

分別稱取15mg千金子素l1、l2、l3、l8于乙酸乙酯中溶解，得1.5mg/ml的千金子素l1、l2、l3、l8的混合溶液；

稱取實(shí)施例1中獲得的千金子脂肪油0.5g于乙酸乙酯中溶解，得50mg/ml的脂肪油溶液。

（2）上述千金子素混合溶液和千金子脂肪油溶液各取1ml，置圓底燒瓶中，于40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，揮盡乙酸乙酯，將圓底燒瓶置真空干燥箱，常溫抽真空過夜以除去殘存的乙酸乙酯，制成脂膜。

（3）取80ml脫氧膽酸鈉溶液加入上述脂膜的圓底燒瓶中，將脂膜與膽鹽溶液在37℃水浴中超聲混合30min，轉(zhuǎn)移至離心管中，常溫15000r/min離心10min，吸取上清液，0.22μm濾膜過濾，得到澄清的溶液即為含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束溶液s6。

（4）將步驟（3）獲得的溶液s6加入凍干保護(hù)劑甘露醇進(jìn)行冷凍干燥，即得含千金子素的千金子脂肪油-膽鹽混合膠束固體制劑。