本發(fā)明涉及動物分子生物學檢測領域，具體來說，涉及一種與香豬產仔數相關的大片段的獲得與缺失(PAV)分子標記及其應用技術。
背景技術：
：長期以來，豬是我國農業(yè)生產中重要的畜種，豬品種基因組遺傳水平的變異，導致豬種的生活習性、生長發(fā)育以及繁殖性能有著較大的差異。檢測不同個體豬基因組的遺傳變異是研究遺傳變異與表型關系的基礎?；蚪M的遺傳變異可以分為序列變異和結構變異兩種類型。基因組中結構變異的數量遠遠小于核苷酸序列變異數量，結構變異的數量在十萬數量級，而SNP的數目一般在百萬數量級以上，但結構變異影響到的基因組序列的總長度遠遠大于SNP。因此結構變異對基因組和動物性狀影響的權重可能更大?；蚪M結構變異指基因組中獲得與缺失變異和拷貝數變異，包括核苷酸序列的缺失、插入、復制、倒位和易位等。獲得與缺失變異(PAV，presence/absencevariants)是一種重要的遺傳變異形式，通過缺失或插入一個片段引起基因組結構上的變化，直接影響到基因組的大小和基因的數目，其突變頻率與分布特征對于解釋物種表型差異具有重要的意義。在人類的研究中已經發(fā)現許多與結構變異有關的疾病和生理特性，如自閉癥、精神分裂癥、母親生殖能力等。發(fā)生結構變異有助于提高生物個體的適應性，促進物種的形成。我們前期運用二代測序技術，從香豬高產群和低產群中選取2頭作為代表，進行全基因組結構變異檢測，發(fā)現了一個長98675bp的結構變異PAV3在香豬群體中的分布頻率有明顯的不同，PAV3結構變異區(qū)內含有細胞周期末期促進復合物1(anaphasepromotingcomplexsubunit1,APC1)基因。APC1是細胞周期末期復合物(APC)最大的亞基，在整個細胞周期中持續(xù)表達，在細胞周期的調控過程中發(fā)揮著重要的作用。在擬南芥中APC1協(xié)同APC4在雌性配子的形成和胚胎發(fā)生中起重要的作用。因此建立本發(fā)明所描述的一種檢測香豬產仔數相關的結構變異PAV3的方法，以期為實施香豬分子輔助育種提供技術支持。大于30kb的基因組片段通過常規(guī)的PCR方法常不能擴增出目的條帶，因此，我們在缺失片段的外圍設計了一對引物RP，當基因組中的這段區(qū)域缺失時，可以擴增出一個較小的目的條帶。利用Pairwise-PCR的原理，在lsPAVs的邊緣序列50～3000bp之間設計引物對RP，這對引物跨越整個lsPAVs區(qū)域，如果基因組中這段區(qū)域存在，將不能擴增出目的條帶，若這段區(qū)域缺失，可能擴增出6000bp以內的片段。同時，在lsPAVs區(qū)域內部設計另一對特異引物RD，如果大片段缺失用這對引物對RD將不能擴增出目的條帶，反之能擴增出目的條帶。通過兩對引物對RP和RD建立了本發(fā)明所描述的一種檢測與香豬產仔數相關的結構變異PAV3的方法，以深入了解PAVs遺傳變異對豬基因組的影響，為PAVs與經濟性狀和表型變化之間的關聯(lián)研究奠定理論和技術基礎。技術實現要素：本發(fā)明的目的是提供一種與香豬產仔數相關的PAV3標記及其應用。為實現本發(fā)明的目的，本發(fā)明的一種與香豬產仔數相關的PAV3標記，是指豬基因組中候選區(qū)域chr3：46248125-46346800的結構變異，該區(qū)域結構變異缺失98675bp，或不缺失。本發(fā)明提供用于檢測與香豬產仔數相關的PAV3標記的引物對，所述RP引物對為正向引物RPF：CTGCACCTCACACAGCGACT，反向引物RPR：GCAGCACAGCCCTTGAACAG。RD引物對中的正向引物RDF：GTTCCCTGACCCCACTGACTG，反向引物RDR:CCTAGGCTGTCTGTGGTTGTTAG。本發(fā)明提供用于PCR檢測前述與香豬產仔數相關的PAV3標記的試劑盒。所述試劑盒包含上述引物RPF、RPR和RDF、RDR。所述試劑盒還包括10×PCRMix、去離子水，陽性和陰性對照。本發(fā)明還提供所述PAV3標記在鑒定豬品種產仔數中的應用。所述檢測方法包括以下步驟：(1)提取香豬的基因組DNA；(2)以上述香豬基因組DNA為模板，利用所述引物RPF、RPR和RDF、RDR，進行PCR擴增，檢測豬基因組中PAV3的基因型；(3)根據上述檢測結果，如果目的片斷純合缺失，則待測豬有產仔數較高的可能性；如果此片斷不缺失，則待測個體有低產仔數傾向。步驟(2)中進行PCR所用的擴增體系以20μL為例：2×PCRMix10.00μLF-primer(0.10μg/μL)0.20μLR-primer(0.10μg/μL)0.20μLgDNA1.00μLddH2O8.60μLTotalVolume20.00μLPCR反應條件為：本發(fā)明進一步提供所述PAV3標記在香豬產仔數相關的分子標記輔助選擇技術的應用。所述的應用包括以下步驟：(1)個體PAV3基因型檢測以本發(fā)明所述的結構變異PAV3(chr3：46248125-46346800)為候選位點，采用PCR技術檢測個體的PAV3基因型。(2)根據結構變異PAV3進行有高產仔數優(yōu)勢種豬的選育依據本發(fā)明所述的判斷依據，當待測個體基因組中結構變異PAV3為缺失類型時，待測豬屬于產仔數較高的優(yōu)勢個體。結構變異PAV3的檢測，可為香豬產仔數的分子調控機理研究和標記輔助選擇技術的實施提供技術基礎。本發(fā)明的有益效果：(一)本發(fā)明提供的分子遺傳標記不受豬的年齡、性別、生活習性和環(huán)境等因素的限制，可用于個體的早期選擇，從而提高香豬養(yǎng)殖業(yè)的經濟效益。(二)本發(fā)明所述的檢測大片段獲得與缺失變異的方法準確可靠，操作簡便，檢測所需的條件普通實驗室可以滿足。(三)本發(fā)明可作為分子標記用于香豬產仔數性狀的輔助選擇。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例1中瓊脂糖凝膠電泳檢測PAV3基因型的結果，M：DL2000DNAMarker；1-2：DD型；3-4：AA型；圖2為本發(fā)明實施例1中Sanger測序的比對分析結果，細線代表缺失片段98675bp。具體實施方式以下實例對本發(fā)明做進一步的解釋，但不限定本發(fā)明的范圍，若無特別指明，實施例中所用的技術方法和條件均為本領域技術人員所熟知的技術方法和常規(guī)實驗條件，或按照相關試劑廠商說明書建議的方法和條件。實施例1為本發(fā)明的檢測方法，步驟如下：1.豬耳組織基因組DNA的提取本方法采用天根生化科技(北京)有限公司生產的血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(Cat.#DP304)，從豬耳組織中提取基因組DNA，具體方法如下：1)取小于50mg的耳組織置于2μL的離心管中，用手術剪充分剪碎；2)加入200μL緩沖液GA及20μL蛋白酶K，漩渦混勻，56℃消化2-4小時(每隔0.5小時混勻一次)至組織塊消化完全；3)加入200μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃消化10min；4)加入200μL無水乙醇，漩渦混勻；5)將消化液倒入吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm離心30sec，棄廢液，將吸附柱CB3放回收集管中；6)向吸附柱CB3中加入500μL緩沖液GD，12000rpm離心30sec，棄廢液，將吸附柱CB3放回收集管中；7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm離心30sec，棄廢液，將吸附柱CB3放回收集管中；8)重復操作步驟7)；9)將吸附柱CB3放回收集管中12000rpm空離心2min，棄廢液，將吸附柱CB3置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘留的漂洗液；10)將吸附柱轉移到干凈的2mL離心管中，向吸附柱中間部懸空加入50-200μL洗脫液TE，室溫放置2-5min，12000rpm離心2min；基因組DNA轉移到離心管中的TE溶液中，4℃保存?zhèn)溆没?20℃長期保存。11)為增加基因組DNA的得率，可將離心得到的溶液返回吸附柱CB3中，放置2min，12000rpm離心2min；2.目標序列及參考序列的擴增根據NCBI數據庫登錄的該區(qū)域的序列設計引物，所述引物對為：正向引物RPF：CTGCACCTCACACAGCGACT，反向引物RPR：GCAGCACAGCCCTTGAACAG。RD引物為：正向引物RDF：GTTCCCTGACCCCACTGACTG，反向引物RDR:CCTAGGCTGTCTGTGGTTGTTAG。以20μL計PCR反應體系為：10×PCRMix10.00μLUp-primer(0.10μg/μL)0.20μLDown-primer(0.10μg/μL)0.20μLgDNA1.00μLddH2O8.60μLTotalVolume20.00μLPCR反應條件為：本試劑盒所包含的引物符合PCR擴增要求，擴增效果穩(wěn)定、特異性強，PCR擴增結果可準確反應基因組中目標序列的結構變異類型。3.瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物檢測選用1％的瓊脂糖凝膠。點樣時，用微量加樣器將PCR產物5μL，加入點樣孔中，同時加入3μL的D2000DNAMarker(天根生化科技(北京)有限公司)對參照，設置電壓為120V，時間為30min。電泳完成后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結果，并做好圖像的保存。4.Sanger測序為了獲得精確的PAV3的斷點信息，我們通過Sanger測序技術對擴增片段進行了序列測定，將序列信息與豬參考基因組序列(ref.Sscrofa10.2)進行比對分析，確定基因組中PAV3區(qū)域的精確斷點位置實施例2香豬群體結構變異PAV3的檢測及應用按照實施例1所述的方法，以豬基因組區(qū)域結構變異位點(chr3：46248125-46346800)為候選位點，通過PCR技術檢測PAV3在香豬群體(香豬470頭，其中產仔數高的個體230頭，產仔數低的個體240頭)中的結構變異情況。480頭香豬的血樣采自從江縣。應用本發(fā)明所述的檢測技術分析群體中的結構變異PAV3的分布頻率，結果顯示香豬高低產群體中存在PAV3變異(表1)。香豬基因組結構變異中，基因型DD型的香豬的產仔數高于基因型AA型的香豬的產仔數(P<0.05)(表2)。表1香豬群體中候選PAV3位點的基因型頻率和等位基因頻率檢測結果表2候選PAV3基因型對應的產仔數比較應用本發(fā)明建立的檢測技術可檢測待測個體基因組中結構變異PAV3的基因型，不受香豬的年齡、性別、地理位置和環(huán)境等因素的限制，且操作簡便，結果準確。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之做部分修改或改進，這對本領域的技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的修改或改進，均屬于本發(fā)明要求的保護范圍。當前第1頁1 2 3