確定異常狀態(tài)相關(guān)生物標(biāo)志物的方法及系統(tǒng)的制作方法
【專利說明】
[0001] 優(yōu)先權(quán)?目息
[0002] 本發(fā)明專利申請要求于2012年8月1日提交的PCT專利申請NO. PCT/ CN2012/079524的權(quán)益，該專利申請在此全部引用作為參考。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及確定異常狀態(tài)相關(guān)生物標(biāo)志物的 方法及系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0004] 宏基因組學(xué)（metagenomics)又稱為環(huán)境基因組學(xué)，元基因組學(xué)，生態(tài)基因組學(xué)， 或者群落基因組學(xué)，這是一門直接研宄自然狀態(tài)下微生物群落，包含了可培養(yǎng)的和不可培 養(yǎng)的細菌、真菌和病毒的基因組總和的學(xué)科。1998年，威斯康辛大學(xué)植物病理學(xué)部門的 Handelsman等人在研宄土壤微生物時，最早提出了"宏基因組學(xué)"這一概念。傳統(tǒng)的微生 物研宄受到微生物分離和純培養(yǎng)技術(shù)限制。然而，宏基因組學(xué)研宄是基于特定環(huán)境下的微 生物群落，其研宄目的是微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及 新微生物之間的環(huán)境關(guān)系。宏基因組學(xué)的基本研宄策略包括：環(huán)境基因組大片段DNA的提 取和純化、文庫構(gòu)建、目的基因篩選和/或大規(guī)模測序分析。宏基因組文庫中包含了可培養(yǎng) 的和不可培養(yǎng)的微生物基因和基因組。將某個自然環(huán)境中的DNA克隆到可培養(yǎng)的宿主細胞 中，從而避開了微生物分離和培養(yǎng)的難題。在該研宄中，借助于大規(guī)模序列分析并結(jié)合生 物信息學(xué)工具，在基因序列分析的基礎(chǔ)上，大量未知微生基因或新基因簇被發(fā)現(xiàn)。這對 了解微生物群落組成、進化歷程和代謝特點，以及挖掘具有應(yīng)用潛力的新基因具有重要意 義。
[0005] 然而，目前的宏基因組研宄仍有待改進。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明提出了能夠 有效確定對象中異常狀態(tài)相關(guān)生物標(biāo)志物的方法和系統(tǒng)。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種確定對象中異常狀態(tài)相關(guān)生物標(biāo)志物 的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括：對來自第一對象的核酸樣本和來自第二對象的 核酸樣本進行核酸測序，以便獲得分別由第一測序結(jié)果和第二測序結(jié)果構(gòu)成的多個測序序 列，其中，所述第一對象具有所述異常狀態(tài)，所述第二對象不具有所述異常狀態(tài)，所述來自 第一對象的核酸樣本和所述來自第二對象的核酸樣本都分離自相同類型的樣本，所述第一 對象和所述第二對象屬于相同物種；以及基于所述第一測序結(jié)果和所述第二測序結(jié)果的差 異，確定所述異常狀態(tài)相關(guān)生物標(biāo)志物。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述確定對象中異常狀態(tài)相關(guān)生物標(biāo)志物的方法可能進一 步具有下列附加技術(shù)特征：
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述異常狀態(tài)為疾病。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述疾病為選自腫瘤性疾病、自身免疫性疾病、遺傳性 疾病和代謝性疾病中的至少一種。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述異常狀態(tài)為糖尿病。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述第一對象和所述第二對象為人。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述來自第一對象的核酸樣本和所述來自第二對象的 核酸樣本分別分離自所述第一對象和第二對象的排泄物。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，利用第二代測序方法或第三代測序方法對來自所述第 一對象的核酸樣本和來自所述第二對象的核酸樣本進行測序。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，利用選自把8叫2000、501^10、454、和單分子測序裝置的 至少一種進行所述測序步驟。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，基于所述第一測序結(jié)果和所述第二測序結(jié)果的差異， 確定所述異常狀態(tài)相關(guān)生物標(biāo)志物進一步包括：將所述第一測序結(jié)果和所述第二測序結(jié)果 與參考基因集進行比對；基于比對結(jié)果，分別確定來自所述第一對象和所述第二對象的所 述核酸樣本中基因的相對豐度；對來自所述第一對象和所述第二對象的所述核酸樣本中基 因的相對豐度進行統(tǒng)計檢驗；以及確定在來自所述第一對象和所述第二對象的所述核酸樣 本之間相對豐度存在顯著差異的基因為基因標(biāo)志物。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，在將所述第一測序結(jié)果和所述第二測序結(jié)果與參考基 因集進行比對之前，采用過濾步驟以便去除污染序列。所述污染序列為選自下列的至少一 種：接頭序列，低質(zhì)量序列和宿主基因組序列。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，利用選自SOAP2和MAQ的至少一種進行所述比對步驟， 將所述第一測序結(jié)果和所述第二測序結(jié)果與參考基因集進行比對，任選地，人類腸道微生 物群落非冗余基因集。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述方法進一步包括：對來自所述第一測序結(jié)果和所 述第二測序結(jié)果的高質(zhì)量測序序列，進行從頭組裝和宏基因組的基因預(yù)測，其中，不能與參 考基因集比對上的所述基因被定義為新基因；以及將所述新基因整合至所述參考基因集中 以便獲得一個更新的基因集；以及進行物種分類和功能注釋。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述物種分類是通過將所述參考基因集中每個基因與 MG數(shù)據(jù)庫進行比對而進行的。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，利用BLASTP方法將所述參考基因集中每個基因與MG 數(shù)據(jù)庫進行比對，以便確定所述基因的物種分類水平，利用85%相似性和80%比對覆蓋度 作為屬水平的分類閾值，對于每個基因，超過所述兩個域值的最高得分結(jié)果被選擇為屬水 平的分類；以及對于門水平的物種分類，用65%相似性代替。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，功能注釋是通過將假定氨基酸序列與eggNOG和KEGG 的至少之一數(shù)據(jù)庫中的"蛋白/結(jié)構(gòu)域"進行比對而進行的，其中，所述假定氨基酸序列是 由所述基因集翻譯的。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，根據(jù)E-Value值小于le-5的函數(shù)，利用BLASTP方法將 假定氨基酸序列與eggNOG和KEGG的至少之一數(shù)據(jù)庫中的"蛋白/結(jié)構(gòu)域"進行比對而進 行的，其中，所述假定氨基酸序列是由所述基因集翻譯的。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述相對豐度包含物種相對豐度和功能相對豐度，以 及所述參考基因集包含物種分類和功能注釋?；谒龅谝粶y序結(jié)果和所述第二測序結(jié)果 的差異，確定所述異常狀態(tài)相關(guān)生物標(biāo)志物進一步包括：將所述第一測序結(jié)果和所述第二 測序結(jié)果與參考基因集進行比對；以及基于比對結(jié)果，分別確定來自所述第一對象和所述 第二對象的核酸樣本中各基因的物種相對豐度和功能相對豐度；以及對來自所述第一對象 和所述第二對象的核酸樣本中各基因的物種相對豐度和功能相對豐度進行統(tǒng)計檢驗；以及 分別確定在來自所述第一對象和所述第二對象的核酸樣本之間相對豐度存在顯著差異的 物種標(biāo)志物和功能標(biāo)志物。任選地，在獲得所述相對豐度之后，泊松分布用于對相對豐度的 精確性進行統(tǒng)計檢驗。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述方法進一步包括腸型鑒定。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述方法進一步包括評估每個表觀因素（covariate) 的影響，任選地，腸型、II型糖尿病、年齡、性別和BMI。優(yōu)選地，利用置換多元方差分析方法 進行評估。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述方法進一步包括校正所述數(shù)據(jù)的群體分層分析， 其中，校正基因的相對豐度譜，優(yōu)選地，利用EIGENSTRAT方法以便剔除所述表觀因素的影 響。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述統(tǒng)計檢驗選自Student T檢驗、Wilcox軼和檢驗 的至少一種進行。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述方法進一步包括對所述基因