專利名稱：具有導(dǎo)向治療低毒副作用的癌胚抗原特異性結(jié)合肽的制作方法
具有導(dǎo)向治療低毒副作用的癌胚抗原特異性結(jié)合肽技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體的是涉及一種具有導(dǎo)向治療低毒副作用的癌胚抗原特異性結(jié)合肽。
背景技術(shù)：
本發(fā)明公開了兩種與癌胚抗原特異性結(jié)合的環(huán)七肽，及其與腫瘤壞死因子的融合蛋白，更具體地說，包括兩條結(jié)合肽的氨基酸序列、核昔酸序列和融合蛋白的氨基酸序列、 核普酸序列以及構(gòu)建的融合蛋白表達(dá)載體。
癌胚抗原(carcinoembryonic antign，CEA)是一種腫瘤標(biāo)志物和腫瘤相關(guān)性抗原，高表達(dá)于上皮源性的腫瘤組織，尤其是消化道腫瘤如結(jié)腸癌、直腸癌中。針對CEA的導(dǎo)向治療主要集中于特異性結(jié)合CEA的抗體或單鏈抗體的研究，將單抗或單鏈抗體與細(xì)胞毒素如阿霉素、氨甲喋呤、腫瘤壞死因子等偶聯(lián)，通過單抗的特異性結(jié)合作用使毒素能富集于腫瘤部位，提高靶部位的藥濃度，從而達(dá)到導(dǎo)向治療、降低毒副作用的目的。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對上述抗癌藥物研發(fā)現(xiàn)狀，提供一種具有導(dǎo)向治療低毒副作用的癌胚抗原特異性結(jié)合肽，從而克服單抗和單鏈抗體分子量大，穿透力弱，難以到達(dá)靶部位尤其是實(shí)體瘤組織的缺點(diǎn)。并且鼠源性的單抗應(yīng)用于人體會產(chǎn)生人抗鼠抗體，而小肽則具有免疫原性低的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的技術(shù)途徑是從噬菌體展示肽庫中篩選出CEA的特異性結(jié)合肚，將此結(jié)合肽與腫瘤壞死因子(TNF-α )融合表達(dá)，形成融合蛋白，以使結(jié)合肽的CEA結(jié)合活性與 TNF-α的細(xì)胞毒活性偶聯(lián)，該融合蛋白為、能導(dǎo)向殺傷CEA陽性腫瘤。其特征為1)從噬菌體隨機(jī)展示環(huán)七肽庫中篩選出與CEA特異結(jié)合的環(huán)七肽。2 ) CEA結(jié)合肽的氨基酸序列為CPAPWGRLC。 3 )構(gòu)建序列為CPAPWGRLC的結(jié)合肽CSP-I與TNF-α的融合蛋白CSP-I-TNF的表達(dá)載體，二者之間加入兩個(gè)甘氨酸作為柔性接頭。4 )構(gòu)建序列為 CLRGffPAPC的結(jié)合肽CSP-2與TNF-α的融合蛋白CSP-2-TNF的表達(dá)載體，二者之間加入兩個(gè)甘氨酸作為柔性接頭。5 )表達(dá)并純化CSP-I-TNF、CSP-2-TNF，檢測表明上述二者均能與CEA特異性結(jié)合，并且能夠競爭抑制篩選出的與CEA結(jié)合的單克隆噬菌體與CEA 的結(jié)合。6 ) CSP-I-TNF、CSP-2-TNF均有殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，CSP-1-TNF具有對LoVo細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。
圖1 CAE結(jié)合肽的氨基酸序列330-339為小肽的編號，氨基酸序列從左到右為 N端到C端；圖2噬菌體單克隆與CEA親和力比較； 圖3噬菌體單克隆特異性的比較；3圖4 CSP-I-TNF表達(dá)載體pBV220-CSP-l-TNF的構(gòu)建圖； 圖5 CSP-2-TNF表達(dá)載體pBV220-CSP-2-TNF的構(gòu)建圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例一CEA結(jié)合肽的篩選以CEA為靶蛋白從噬菌體隨機(jī)展示環(huán)七肽庫中篩選與CEA特異結(jié)合的結(jié)合肽，經(jīng)過四輪的篩選，得到了一系列與CEA特異結(jié)合的噬菌體單克隆，從中隨機(jī)挑取10個(gè)單克隆測序，其外源展示肽序列見圖1。
用ELISA的方法檢測各個(gè)單克隆噬菌體的CEA結(jié)合力的大小及特異性(圖2、 圖3 )，確定結(jié)合力和特異性最好的的單克隆的外源展示肽的序列為PAPWGRL，因?yàn)槭黔h(huán)肽庫，所以結(jié)合肽應(yīng)在兩側(cè)加上半肽氨酸，即CPAPffGRLC。
實(shí)施例二 CSP-I-TNF表達(dá)載體的構(gòu)建(圖4 ) 1 .合成CSP-I的基因合成CSP-I基因的兩互補(bǔ)片段，并在其基因的5 ’端加上兩個(gè)甘氨酸的基因密碼子， 基因兩側(cè)分別加上EcoR工的酶切位點(diǎn)。
片段1 5 ’ AATTCACCACCGCACAGACGACCCCACGGAGCCGGGCACATG 3 ’ 片段2 5 ’ AATTCATGTGCCCGGCTCCGTGGGGTCGTCTGTGCGGTGGTG 3 ’將片段1和2等比例混勻，94 V水浴變性3min，待其慢慢冷卻至室溫，使兩互補(bǔ)片段退火。
酶切并連接PBV220-TNF 用 EcoR I 酶切，酶切體系為pBV220_TNF 質(zhì)粒溶液 8. 5 μ 1，IOXH buffer 1μ 1, EcoR I 0.5μ 1, 37°C溫育Ih，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，片段切下回收，與退火的CSP-I基因片段連接，連接體系為PBV220-TNF質(zhì)粒酶切后回收的片段4μ1，退火后的目的基因片段6μ1，Ligation Solution I 10 μ 1,混勻，16°C連接Ih。
鑒定連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 ( DE3 )感受態(tài)，挑單克隆培養(yǎng)，分別測序鑒定和表達(dá)鑒定，確定正確克隆。
實(shí)施例三CSP-2-TNF表達(dá)載體的構(gòu)建(圖5 )將CSP-I的氨基酸序列顛倒，為CLRGffPAPC，記為CSP-2。以pBV220_TNF為模板， 通過兩次PCR將CSP-2的基因逐步加入到TNF-α基因的上游。
UPCR 反應(yīng)第一次PCR 上游引物為5 ’ CGGCTCCGTGCGGTGGTGTCAGATCATCTTCTCGA 3 ’ ， 下游引物為5 ’ GGGTCATCACAGGGCAATGATC 3 ’，含 Sma I 酶切位點(diǎn)。
PCR 參數(shù)為94°C，2 min;94°C，30 sec ；55°C,30 sec ；72°C, Imin，進(jìn)行 5 個(gè)循環(huán)；94°C，30 SeC, 60°C, 1 min，72 °C，Imin，共 25 個(gè)循環(huán)；72°C，7 min。
PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳，切下目的片段回收，與PMD18-T連接，轉(zhuǎn)化后挑單克隆測序，從中選正確克隆的質(zhì)粒作為模板進(jìn)行第二次PCR。
第二次PCR 上游引物為5 ’ GGAATTCATGTGCCTGCGTGGTTGGCCGGCTCCGTGCGGTGGT3 ’，含 EcoR I 酶切位點(diǎn)。
下游引物為5，GGGTCATCACAGGGCAATGATC3，，PCR 參數(shù)為94°C，2 min ；94°C，30 sec ；55°C，30 sec ；72°C，lmin，進(jìn)行 5 個(gè)循環(huán)； 94°C, 30 Sec ；60°C, 1 min ;72°C，Imin，共 25 個(gè)循環(huán)；72°C，7 min。
產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段，與pMD 18-T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 ( DE3 )，挑單克隆測序，從中選擇正確克隆。
2、酶切及連接正確克隆用EcoR I，Sma I雙酶切，酶切體系為EcoR I、Sma I各0.5 μ ，質(zhì)粒溶液 7μ1，10ΧΤ buffer 1 μ 1, IOXBSA 1μ l,37°C,lh，同時(shí)將 pBV220 用 EcoR I、Sma I雙酶切。酶切產(chǎn)物1 %瓊脂糖凝膠電泳?；厥漳康钠?，連接。
權(quán)利要求
1.具有導(dǎo)向治療低毒副作用的癌胚抗原特異性結(jié)合肽，其特征在于其氨基酸序列從N 末端至丨J C末端為=C-P-A -P-W-G-R-L-C 。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述具有導(dǎo)向治療低毒副作用的癌胚抗原特異性結(jié)合肽的反向序列，其特征在于氨基酸序列從N末端至IJ C末端為C-L-R-G-W-P-A-P-C。
全文摘要
本發(fā)明涉及癌胚抗原陽性腫瘤的導(dǎo)向治療研究，屬于生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域。通過噬菌體隨機(jī)展示肽庫篩選出與癌胚抗原特異性結(jié)合的結(jié)合肽，這些結(jié)合肽可以用作癌胚抗原陽性腫瘤導(dǎo)向治療藥物的載體；將該結(jié)合肽與TNF-α融合，表達(dá)產(chǎn)生的融合蛋白能特異結(jié)合癌胚抗原，并且對癌胚抗原陽性的LoVo細(xì)胞有細(xì)胞毒活性，表明該融合蛋白能用于癌胚抗原陽性腫瘤細(xì)胞的治療。
文檔編號C07K7/64GK102477083SQ20101055343
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月22日
發(fā)明者杜沖 申請人:大連創(chuàng)達(dá)技術(shù)交易市場有限公司