專利名稱：抗癌抗體的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及抗癌制劑，特別是抑制人結(jié)腸癌細胞、前列腺癌細胞和乳腺癌細胞在體外和體內(nèi)生長的制劑。本發(fā)明還涉及癌癥疫苗。
背景技術(shù)：
早在二十世紀八十年代，就特別感興趣研制用作抗癌制劑的單克隆抗體(Mab)。在一些情況中，這些被設計為“魔彈”，通過綴合不同的細胞毒性化合物(例如毒素)或其它物質(zhì)(例如同位素和藥物)，輸送至癌細胞。然而，由于許多原因包括特異性低、穿透性低(即針對實體瘤而言)及產(chǎn)生人抗小鼠抗體(即HAMA)應答，這些基于Mab的抗癌制劑未獲成功并大多已被放棄。
近年來，對基于Mab的抗癌制劑又重新注目，而且先前經(jīng)歷的許多問題已經(jīng)通過遺傳工程技術(shù)得以解決(Hudson PJ，“癌癥治療中的重組抗體構(gòu)建體”，免疫學通用觀點11，pp 548-557(1999)；在此將其揭示內(nèi)容并入作為參考)。確實，目前有三種Mab正在使用或在臨床試驗階段(即治療HER2/neu陽性乳腺癌的人源化的HER2/neu Mab，商品名為Transtuzu Mab；治療非霍奇金淋巴瘤的人源化的抗CD20Mab，商品名為Rituxan；及C225，其是一種抗EGFR Mab)。這些抗體不是作為細胞毒性抗體發(fā)揮作用，也不是通過Fc介導的炎癥應答而發(fā)揮作用，而是結(jié)合抗原以干擾細胞信號化及引起細胞凋亡。例如，以HER2/neu Mab為例，所述抗體阻止或“阻斷”生長因子的結(jié)合，導致HER2/neu陽性乳腺癌細胞死亡。
顯然需要更多抗癌制劑以補充現(xiàn)有的癌癥治療。通過用已知在某些癌細胞中表達的Cripto-1蛋白的抗原性部分(Montuori N等，“分離和定性CRIPTO常染色體基因及其X-連鎖相關(guān)序列”，Am J HumGenet，49(3)，pp 555-565(1991))、或者Pim-1蛋白的一種融合蛋白(Friedmann M等，“定性原癌基因pim-1激酶活性和底物識別序列”，Arch Biochem Biophys，298(2)，pp 594-601(1992))、或者結(jié)腸癌細胞裂解物對大鼠進行免疫，結(jié)果令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人生產(chǎn)的Mab可抑制不同癌細胞系生長。

發(fā)明內(nèi)容
第一方面，本發(fā)明提供了Cripto-1蛋白、Pim-1蛋白或結(jié)腸癌細胞裂解物中存在的一種抗原的一種分離的結(jié)合配偶體(bindingpartner)，其中所述結(jié)合配偶體抑制一或多類癌細胞生長。
第二方面，本發(fā)明提供了一種抗癌制劑，其包含Cripto-1蛋白、Pim-1蛋白或結(jié)腸癌細胞裂解物中存在的一種抗原的一種結(jié)合配偶體，其中所述結(jié)合配偶體抑制一或多類癌細胞生長。
第三方面，本發(fā)明提供了一種治療癌癥患者的方法，所述方法包括為所述患者施用有效量的第二方面所述的抗癌制劑。
第四方面，本發(fā)明提供了一種癌癥疫苗，其包含Cripto-1蛋白、Pim-1蛋白或結(jié)腸癌細胞裂解物中存在的一種抗原，或者其包含編碼Cripto-1蛋白、Pim-1蛋白或結(jié)腸癌細胞裂解物中存在的一種抗原的一種可表達的DNA分子。
第五方面，本發(fā)明提供了一種治療癌癥患者的方法，所述方法包括為所述患者施用有效量的第四方面所述的癌癥疫苗。
第六方面，本發(fā)明提供了一種誘導癌細胞凋亡的方法，所述方法包括用Cripto-1蛋白、Pim-1蛋白或結(jié)腸癌細胞裂解物中存在的一種抗原的結(jié)合配偶體處理所述細胞。
第七方面，本發(fā)明提供了一種使癌細胞對細胞毒性化合物敏感的方法，所述方法包括用Cripto-1蛋白、Pim-1蛋白或結(jié)腸癌細胞裂解物中存在的一種抗原的結(jié)合配偶體處理所述細胞。I具體實施方式
本發(fā)明的結(jié)合配偶體優(yōu)選抑制以下一或多種癌細胞生長結(jié)腸癌細胞、乳腺癌細胞、前列腺癌細胞、白血病細胞和肺癌細胞，所述結(jié)合配偶體特征在于其結(jié)合Cripto-1蛋白、Pim-1蛋白或結(jié)腸癌細胞裂解物中存在的抗原。
優(yōu)選地，所述結(jié)合配偶體是一種抗體或其片段，但也可以是Cripto-1蛋白(Bianco C.等，“Cripto-1通過一種新受體間接刺激erb B-4的酪氨酸磷酸化”，生物化學雜志274(13)，pp 8624-8629(1999))、Pim-1蛋白或結(jié)腸細胞裂解物抗原的受體蛋白，或者另外是特異性結(jié)合Cripto-1蛋白、Pim-1蛋白或結(jié)腸細胞裂解物抗原的任何其它肽、多肽或蛋白質(zhì)。文中所用術(shù)語“特異性結(jié)合”是指肽、多肽或蛋白質(zhì)的結(jié)合特性，其只結(jié)合Cripto-1蛋白、Pim-1蛋白或結(jié)腸細胞裂解物抗原，或者與其它哺乳動物蛋白的交叉反應可以忽略不計。
更優(yōu)選地，所述結(jié)合配偶體是一種Mab或其片段，而且特別選自結(jié)合Cripto-1蛋白抗原性決定簇的Mab或其片段，所述抗原性決定簇包含基本上相應于下面的氨基酸序列CPPSFYGRNCEHDVRKE(SEQ ID NO1)，和/或結(jié)合結(jié)腸癌細胞裂解物中存在的抗原的Mab或其片段，其中所述抗原的分子量通過SDS-PAGE估計為16Kd或30Kd。所述16Kd和/或30Kd的抗原可以是結(jié)腸癌細胞和/或乳腺癌細胞生長所需的生長因子。
本發(fā)明的Mab可以通過本領域的任何標準技術(shù)生產(chǎn)。Mab的片段如F(ab′)2、Fab和Fc可以通過例如本領域標準的胃蛋白酶和木瓜蛋白酶裂解方法生產(chǎn)，或者通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)，所述重組DNA技術(shù)包括表達分離自雜交瘤細胞系或產(chǎn)生抗體的動物細胞的抗體基因。
特別優(yōu)選的抗體片段是單鏈Fv(scFv)抗體片段。生產(chǎn)scFv的方法見于Pluckthun A，生物/技術(shù)9，pp 545-551(1991)和美國專利No.4,946,778所述。這兩個文獻所揭示的內(nèi)容在此并入作為參考。
確信本發(fā)明的抗體片段可以提供比Mab及其它“大型”結(jié)合配偶體更多的優(yōu)勢，因為它們對實體瘤特別是大腫瘤具有更佳的穿透性。
本發(fā)明的Mab及抗體片段可以根據(jù)美國專利No.5,225,539所述技術(shù)進行人源化(在此并入作為參考)。
Mab及抗體片段還可以通過使用取自免疫動物(例如小鼠或大鼠)的脾細胞生產(chǎn)，所述脾細胞融合于人骨髓瘤細胞系(例如Karpas707H人骨髓瘤細胞系；Karpas A等，“適于產(chǎn)生人Mab的人骨髓瘤細胞系”，美國科學院院報98，pp 1799-1804(2001))，以生產(chǎn)人抗體或抗體片段。嵌合的小鼠/人Mab可以根據(jù)Mount PF等所述方法生產(chǎn)(Mount PF等，“嵌合的(小鼠/人)抗結(jié)腸癌抗體c30.6抑制scid/SCID小鼠中人結(jié)腸直腸癌異種移植體生長”，癌癥研究54，pp 6160-6166(1994)，在此并入作為參考)。
Mab及抗體片段可以通過標準技術(shù)大量生產(chǎn)(例如通過組織培養(yǎng)或無血清發(fā)酵)，及使用親和層析柱純化如A蛋白(例如針對小鼠Mab)、G蛋白(例如針對大鼠Mab)或MEP HYPERCEL(例如針對IgM和IgG Mab)。
本發(fā)明的結(jié)合配偶體可以與細胞毒性化合物或上述其它物質(zhì)綴合。優(yōu)選的細胞毒性化合物包括一線化療藥物如蒽環(huán)類抗生素(如依達比星、多柔比星、道諾霉素、表阿霉素)、5-氟尿嘧啶(5FU)、拓撲異構(gòu)酶抑制劑(如伊立替康)、順鉑、卡鉑和紫杉醇。
本發(fā)明的結(jié)合配偶體也可以與第一種結(jié)合蛋白(例如生物素)綴合以通過施用第二種結(jié)合蛋白(例如抗生物素蛋白)使結(jié)合配偶體之間交聯(lián)，所述第二種結(jié)合蛋白結(jié)合第一種蛋白。在后文實施例11所述的體外試驗中，與二級抗體的交聯(lián)使對乳腺癌細胞的生長抑制得到增強。此外，初步試驗表明用結(jié)腸癌細胞可以達到相似結(jié)果。
此外，本發(fā)明的結(jié)合配偶體可以與抗體交聯(lián)，所述抗體如Panorex(Centacor，Glaxo)、Rituxin(Genentech，Roche)或Herceptin(Genentech，Roche)。已經(jīng)證明，這些二級抗體可分別有效用于抗結(jié)腸癌、淋巴瘤和乳腺癌。
優(yōu)選地，本發(fā)明的結(jié)合配偶體與一種合適的藥用可接受的載體或稀釋劑組合，以形成一種抗癌制劑(其可以用于人或動物)。合適的載體或稀釋劑包括等滲鹽水溶液，例如磷酸鹽緩沖鹽水。所述組合物可以配制為非腸道、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、口服或經(jīng)皮施用配方。典型地，所述結(jié)合配偶體(例如抗體或抗體片段)可以施用的劑量大約為0.01-30mg/kg體重，優(yōu)選0.1-10mg/kg體重。然而，所述施用途徑和劑量只作為指導，因為本領域技術(shù)人員可以易于對任何特殊患者和癌癥病變確定最佳施用途徑和劑量。
所述抗癌制劑可以用于治療癌癥患者的方法中。所述方法可以縮小癌癥、或者至少抑制其生長和/或蔓延。所述方法還可以與傳統(tǒng)癌癥治療組合使用，如組合放療、化療(例如使用蒽環(huán)類抗生素、5FU、拓撲異構(gòu)酶抑制劑、順鉑和卡鉑)或激素療法或者利用激素修飾物(例如Catamoxifen)治療。
本發(fā)明還涉及癌癥疫苗及其在治療癌癥患者的方法中的應用。此類疫苗可以包含Cripto-1蛋白(或其抗原性片段)、Pim-1蛋白(或其抗原性片段)或結(jié)腸癌細胞裂解物中存在的一種抗原，或者可以包含編碼Cripto-1蛋白(或其抗原性片段)、Pim-1蛋白(或其抗原性片段)或結(jié)腸癌細胞裂解物中存在的一種抗原的一種可表達的DNA分子。
典型地，這種疫苗制備為可注射的液體溶液或懸浮液形式；也可以制備為在注射之前溶解于或懸浮于液體中的固體形式。所述制品還可以是乳化的，或者將蛋白質(zhì)或DNA置入脂質(zhì)體膠囊。所述蛋白質(zhì)或DNA也可以與藥用可接受的賦形劑或佐劑混合。合適的賦形劑例如是水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等或這些物質(zhì)的組合。合適的佐劑包括氫氧化鋁、磷酸鋁和硫酸鉀鋁(明礬)。
本發(fā)明還涉及一種誘導癌細胞凋亡的方法，所述方法包含用Cripto-1蛋白、Pim-1蛋白或結(jié)腸癌細胞裂解物中存在的一種抗原的結(jié)合配偶體處理所述細胞。用于處理癌細胞的結(jié)合配偶體的量根據(jù)特定結(jié)合配偶體的種類和特性以及癌細胞的環(huán)境(例如在體外細胞培養(yǎng)物中或在體內(nèi)病灶如腫瘤模型或癌癥患者中)而變化。然而，本領域技術(shù)人員完全可以確定有效產(chǎn)生細胞凋亡作用的所述結(jié)合配偶體的量。
本發(fā)明還涉及一種使癌細胞對細胞毒性化合物敏感的方法，所述方法包括用Cripto-1蛋白、Pim-1蛋白或結(jié)腸癌細胞裂解物中存在的一種抗原的結(jié)合配偶體處理所述細胞。用于致敏癌細胞的結(jié)合配偶體的量根據(jù)特定結(jié)合配偶體的種類和特性以及癌細胞的環(huán)境(例如在體外細胞培養(yǎng)物中或在體內(nèi)病灶如腫瘤模型或癌癥患者中)、及使所述細胞對其敏感的細胞毒性細胞的種類和特性而變化。然而，本領域技術(shù)人員完全可以確定結(jié)合配偶體的有效致敏量。
最后，本發(fā)明涉及誘導針對癌細胞的CTL應答的方法，所述方法包括為所述患者施用有效量的肽或其抗原性片段，所述肽包含基本上相應于下面的氨基酸序列ELNRTCCLNGGTCMLGSFCACPPSFYGPNCEHDVRKE(SEQID NO2)。
在本說明書中，術(shù)語“包含”應理解為包括指定的一種因子、整體或步驟，或一組因子、整體或步驟，但不排除任何其它一種因子、整體或步驟，或一組因子、整體或步驟。
本文所用關(guān)于一種氨基酸序列的術(shù)語“基本上相應于”是指涵蓋特異的氨基酸序列以及相關(guān)氨基酸序列，不同之處僅在于包含一或多個氨基酸取代、插入或添加而基本不改變所述特異氨基酸序列的生物活性。特別地，該術(shù)語是指涵蓋相關(guān)氨基酸序列，不同之處僅在于包括一或多個保守氨基酸取代。就保守氨基酸取代而言，所述組合是G，A；V，I，L，M；D，E；N，Q；S，T；K，R，H；F，Y，W，H；及P，Nα-烷基氨基酸。
本說明書中提及的任何文獻、案例、資料、設備、論文等只是為本發(fā)明提供了闡述背景，而不應理解為如下含義，即由于其在本申請的各項權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日之前既已存在，上述任一或所有便構(gòu)成了本發(fā)明相關(guān)領域的部分現(xiàn)有技術(shù)基礎或公知常識。
本發(fā)明通過以下非限制性實施例和所附圖表得以進一步闡述。


圖1示出在溫育72小時后，通過3H-胸苷摻入測定的Mab C4對LS174T結(jié)腸癌細胞的抑制，以及由Mab C4所致的所述細胞對順鉑(Cis)敏感性增強的示意圖。
圖2提供了表明Mab C3、C4和C13及對照的Mab BCP7(抗粘液素1(mucinl)Mab)對結(jié)腸癌細胞系LS174T的抑制作用的條線圖。
圖3提供了乳腺癌組織(A)和正常乳腺組織(B)樣品用Mab C4進行免疫過氧化物酶染色的照片。在正常乳腺組織中未見染色。
圖4A提供了示出在SCID小鼠中Mab C4的抑制作用圖示結(jié)果。SCID小鼠用2×106個前列腺癌DU145細胞經(jīng)皮下接種，并用MabC4處理。
圖4B提供了在接種前列腺癌DU145細胞和Mab C4后24天，Mab C4對處理和未處理的SCID小鼠的腫瘤大小(重量)的作用條線圖。
圖5A提供了示出在SCID小鼠中Mab C13的抑制作用圖示結(jié)果。SCID小鼠用2.5×106個結(jié)腸癌Ls174T細胞經(jīng)皮下接種及用MabC13處理。
圖5B提供了在接種結(jié)腸癌LS174T細胞和Mab C13后25天，Mab C13對處理和未處理的SCID小鼠的腫瘤大小(重量)作用結(jié)果的條線圖。
圖6示出由抗Cripto-1 Mab，C3誘導的凋亡細胞的DNA片段化結(jié)果。
圖7提供了在用Mab C4和對照的Mab，Mab BCP7處理72小時的結(jié)腸癌細胞LS174T中，確定碘化丙錠染色(PI)——細胞凋亡檢測試劑——的FACS分析結(jié)果圖示。
圖8A示出用以下物質(zhì)處理3小時的LS174T細胞中JNK和p38的激活情況培養(yǎng)基(泳道1)，C3(5，10μg/ml)(泳道2，3)；順鉑(25，50μg/ml)(泳道4，5)；及C3(10μg/ml)和順鉑(25，50μg/ml)組合(泳道6，7)。JNK以劑量依賴性方式激活。C3與順鉑(Cis)的組合還增強JNK的激活。P38不受C3影響，但由順鉑激活。
圖8B示出用培養(yǎng)基(m)，C4在10μg/ml溫育8，24或16小時的LS174T細胞中JNK和p38的激活情況。
圖8C示出在用培養(yǎng)基(1)，C3(10，μg/ml)(2)，C4(10，μg/ml)和順鉑(25μg/ml)(4)，順鉑(25μg/ml)(5)和C13(10μg/ml)(6)溫育16小時后，LS174T細胞中JNK和p38的激活情況。
圖8D示出在用培養(yǎng)基(M)，C4(10μg/ml)溫育24小時，48小時和72小時(泳道2，3，4)；C3(10μg/ml)，C13溫育48小時(泳道5，6)和72小時(泳道7，8)；C3溫育48小時(泳道9)后，LS174T細胞中JNK和p38的激活情況。
圖9提供了示出由抗-Cripto-1 Mab(即C3和C13)及抗-Pim-1Mab(即P4和P9)對CCRF-CEM和CEM/A7R細胞(Austin研究所，Heidelberg，Victoria，Australia)生長的抑制作用結(jié)果示意圖。
圖10示出表明藥物表阿霉素對三個細胞系的作用白血病細胞CEM A7，耐藥變體CEM A7/R和小鼠thyoma細胞E3(A)，Mab C4對用表阿霉素處理的耐藥白血病細胞系CEM/A7R(B)和小鼠thyoma細胞E3(C)的作用結(jié)果示意圖。
圖11提供了示出Mab C3對前列腺癌細胞PC3生長的抑制作用結(jié)果示意圖。
圖12提供了示出抗Cripto-1 Mab C3對前列腺癌細胞系DU 145生長的超長抑制作用結(jié)果圖表。
圖13提供了低濃度的抗Cripto-1 Mab，C3和順鉑組合對前列腺癌細胞系PC3生長的抑制作用結(jié)果圖表。
圖14示出低濃度的抗Cripto-1 Mab，C3和順鉑組合對前列腺癌細胞系DU 145生長的抑制作用圖表。
圖15提供了示出Mab C3和表阿霉素(7.9-125μg/ml)對LS174T細胞生長的抑制作用結(jié)果示意圖。
圖16提供了示出Mab C13和5FU(0-3.0μg/ml)對LS174T細胞生長的抑制作用結(jié)果示意圖。
圖17提供了示出只用抗Cripto-1 Mab，C3或者當組合細胞毒性藥物順鉑(Cis)、5-氟尿嘧啶(5FU)或卡鉑(Carb)(David BullLaboratories，USA)時，對乳腺癌細胞系MCF7(ATCC，USA)生長的抑制作用結(jié)果示意圖。
圖18示出Mab C13和表阿霉素(E)對乳腺癌細胞MCF-7的抑制作用。
圖19提供了示出交聯(lián)的Mab C3對乳腺癌細胞系MCF7的抑制作用結(jié)果示意圖。
圖20(A)提供了將小鼠thyoma E3細胞(Austin研究所，Heidelberg，Victoria，澳大利亞)，在存在抗Cripto-1 Mab C3和C13及抗Pim-1 Mab P4和P9情況下溫育24-72小時的結(jié)果示意圖，示出與未暴露于Mab、對照抗體BC3、抗粘液素1抗體(Austin研究所，Heidelberg，Victoria，Australia)和半數(shù)致死濃度20ng的藥物表阿霉素(DavidBull實驗室，美國)處理的細胞相對比，細胞數(shù)目減少。
圖20(B)提供了與圖20(A)相同試驗的結(jié)果，但在此示出其中沒有Mab的對照組中細胞生長抑制百分率。
圖21提供了示出抗Cripto-1 Mab，C3和抗Pim-1 Mab，P4與對照抗體BC3相比，對結(jié)腸癌細胞系HT29(ATCC，美國)生長的抑制作用結(jié)果示意圖。
圖22提供了示出單獨施用抗Pim-1 Mab，P4或者組合濃度增加的順鉑對結(jié)腸癌細胞系LS174T生長的抑制作用結(jié)果示意圖。
圖23提供了示出通過3H-胸苷摻入百分率變化，Mab 1.14、1.68、2.20和3.60對結(jié)腸癌細胞系LS174T(ATCC，USA)和乳腺癌細胞系MCF7生長的抑制作用結(jié)果示意圖，使用抗粘液素1抗體BCP7作對照。
圖24示出Mab 1.14(針對結(jié)腸癌細胞裂解物而產(chǎn)生的)和順鉑組合對前列腺癌細胞系DU 145生長的作用。
圖25示出使用37-mer Cripto-1肽包被的平板通過ELISA測試的小鼠血清滴定結(jié)果。
圖26示出對INF γ分泌進行ELISPOT分析的結(jié)果。將取自免疫的小鼠和首次用于實驗的小鼠(正常1和2)的脾細胞，用和不用37-mer肽刺激過夜，通過解剖顯微鏡計數(shù)斑點形成單位(SFU)。
圖27示出肺癌Ben和Colo 338細胞隨著Mab C4濃度增加的作用，在培養(yǎng)72小時后3H-胸苷摻入百分率的變化，示出Mab C4導致Ben和Colo338細胞分別抑制90％和60％。點、一式三份實驗的平均值、條、SD。
實施例導言在結(jié)腸癌中，盡管近年來用拓撲異構(gòu)酶抑制劑伊立替康有一定改善，但其仍對放療無反應，對藥物如5FUDR，左旋咪唑的反應很小?；加懈叨冗M展的結(jié)腸癌(即Dukes B，C，D)的患者預后不好，其通過淋巴結(jié)由局部擴散至遠處轉(zhuǎn)移(Dukes D)；在Dukes D中，很少患者在診斷后存活一年。
就乳腺癌而言，預后相對較好，除了具有原發(fā)疾病的那些患者，許多患者用細胞毒性/激素處理和放療處理獲得較好療效。而在乳腺癌是HER-2/neu陽性情況中(大約30％患者)，一部分患者對上述HER-2/neuMab反應良好。
仍需要確定和研制結(jié)腸癌和乳腺癌的新治療方法。
抗體的生產(chǎn)(1)將Lewis大鼠根據(jù)本領域標準技術(shù)用衍生自Cripto-1蛋白的KLH偶聯(lián)的17個氨基酸的肽免疫，所述肽具有序列CPPSFYGRNCEHDVRKE(SEQ ID NO1)。這個序列相應于人和小鼠Cripto-1蛋白的第97-113位殘基。其形成了修飾的類EGF基序部分，可以將Cripto-1與其它EGF家族成員區(qū)分開(Brandt R，等，“表皮生長因子相關(guān)的蛋白質(zhì)cripto-1的鑒別和生物學定性”，生物化學雜志269，pp 17320-17328(1994)；Salomon DS.“Cripto乳腺發(fā)育和瘤形成中一種新表皮生長因子(EGF)相關(guān)的肽”，生物分析21，pp61-70(1999))。
(2)將Balb C小鼠根據(jù)標準技術(shù)用結(jié)腸細胞裂解物免疫，所述結(jié)腸細胞裂解物通過凍干腫瘤組織隨后解凍，重復三次而制備。然后將凍干/解凍樣品在含有蛋白酶抑制劑的磷酸鹽緩沖鹽水中均質(zhì)1分鐘，重復三次。
(3)將Balb C小鼠根據(jù)標準技術(shù)用Pim-1與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的59kD的融合蛋白(由Dr Nancy S Magnuson提供，美國華盛頓大學微生物系)免疫。
分離取自免疫大鼠的脾細胞，并與骨髓瘤NS1細胞融合(XingPX，等，“粘液素VNTR肽的Mab”，分子生物學方法125，pp 369-381(2000))，以產(chǎn)生分泌抗體的雜交瘤。最初通過確定含有抗體的上清在體外抑制癌細胞系(即結(jié)腸癌細胞系LS174T和HT29及乳腺癌細胞系MCF7)生長的能力篩選雜交瘤，使用簡便的分析方法，包括將LS174T和MCF7細胞(1×105)在25cm2燒瓶中(含有10ml培養(yǎng)基)在存在或沒有50μg/ml抗Cripto-1 Mab(C3和C13)的情況下生長。存活細胞在培養(yǎng)第6天通過使用相差顯微鏡計數(shù)。
癌細胞生長抑制分析生長抑制通過測定含氚胸苷吸收的抑制情況，通過臺盼藍排阻分析人工計數(shù)細胞數(shù)目或通過使用比色細胞毒性分析SRB(sulforhodamine B)而確定，所述比色細胞毒性分析SRB是測定細胞蛋白含量的一種快速而靈敏方法(Skehan P，“抗癌藥物篩選的新比色細胞毒性分析”，J Natl Cancer Inst.82，pp 1107-1112(1990))。
實施例1分離抗Cripto-1抗體及實驗結(jié)果概要將兩種分離的Mab(即C3和C13)結(jié)合Cripto-1(EGF家族的一個成員，在人體由CR1編碼，在小鼠由tdgf1編碼)，一種可溶的或者可能細胞表面(Mr 36Kd)GPI-連接的蛋白質(zhì)，其表現(xiàn)是一種生長因子，促進細胞存活和增殖，而且對胚胎發(fā)育和癌癥也很重要(Brandt R，如前)，對其已經(jīng)在許多物種中加以闡述(例如非洲爪蟾屬、斑馬魚、小鼠和人)。重要的是在本發(fā)明中，Cripto-1的表達在人結(jié)腸、胃、胰腺、乳腺和肺癌中提高幾倍，而且這種提高可以在癌前病變中檢測(BrandtR，如前；Saeki T.等，“在人正常結(jié)腸和結(jié)腸直腸腫瘤中雙調(diào)蛋白和cripto的示差免疫組織化學檢測”，癌癥研究52，pp 3467-3473(1992)；Salomon DS，如前；Panico L.等，“人正常和惡變組織中轉(zhuǎn)化生長因子α，雙調(diào)蛋白和CRIPTO的示差免疫組織化學檢測”，Int J Cancer，65，pp 51-56(1996))。例如，正常結(jié)腸和乳腺細胞不含有Cripto-1，而在約85％的結(jié)腸癌和乳腺癌患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)其存在。
這些抗Cripto-1 Mab所結(jié)合的組織的分布情況還有待充分確定(尤其在發(fā)育中的人乳腺、哺乳期和妊娠期)，但是對新鮮或經(jīng)福爾馬林固定的人體組織使用免疫過氧化物酶染色，表明此類Mab是癌癥特異性的而且結(jié)合結(jié)腸癌(60％)和乳腺癌(70％)中存在的而在正常結(jié)腸組織中沒有的抗原。此外，本申請人觀測到抗Cripto-1 Mab與小鼠腫瘤發(fā)生反應。更重要地，這些抗體示出在組織培養(yǎng)中明顯抑制結(jié)腸癌細胞系LS174T和乳腺癌細胞系MCF7的生長。此外，這些Mab還示出抑制白血病、肺癌細胞和前列腺癌細胞的生長。
在其它實驗中，發(fā)現(xiàn)通過將所述抗體在體外與二級抗大鼠抗體交聯(lián)，可以提高細胞凋亡。也在體外用細胞毒性化合物包括5FU、順鉑和卡鉑進行了劑量反應試驗，示出當Mab與細胞毒性化合物組合使用時，對癌細胞分裂和生長的抑制水平提高，而且細胞數(shù)目確實減少，表明所述Mab誘導癌細胞凋亡。
實施例2Cripto-1的單克隆抗體C4另一種的抗Cripto-1單克隆抗體，Mab C4，通過使用與產(chǎn)生MabC3和C13相同的方法獲得。通過以下步驟選擇每個Cripto-1 Maba)檢測免疫過氧化物酶染色以確定抗體與靶組織的結(jié)合，b)在選擇的細胞系中進行細胞生長抑制分析例如3H-胸苷分析(通過胸苷摻入分析，抗體示出＞60％抑制)，及c)通過臺盼藍排阻分析測定細胞數(shù)目減少兩倍。圖1的大字標題示出在共同培養(yǎng)72小時后，Mab C4對LS174T結(jié)腸癌細胞系的抑制，同時圖2示出在用30μg/ml每種MabC4、C3和C13抗體在于25cm2的燒瓶中的10ml培養(yǎng)基中培養(yǎng)1×104個細胞7天后，細胞計數(shù)減少。所述抗體還增強LS174T對順鉑的敏感性，其中將所述Mab加入處理的細胞中相對于只用0.0938-0.75μg/ml藥物溫育減少3H胸苷摻入。
使用表阿霉素和5FU獲得相似結(jié)果。在用0、10、20和30μg/mlMab C4溫育72小時后，在存在0.04、0.08、0.1625和0.125μg/ml表阿霉素的情況下，LS174T細胞含氚胸苷抑制50-90％。就5FU而言，在存在1.5、1.9、2.1和2.4μg/ml所述藥物的情況下，胸苷摻入抑制50-90％。5FU是治療結(jié)腸直腸癌的主要藥物，而且是抗代謝物。組合使用5FU、順鉑、表阿霉素在臨床上是有益的。
實施例3測試抗Cripto-1抗體與癌組織和正常組織的結(jié)合當通過FACS和免疫過氧化物酶染色測試時，抗Cripto-1 Mab與許多癌細胞系反應，如LS174T，HT29(結(jié)腸癌)，MCF7，T47D(乳腺癌)，DU145和PC3(前列腺癌)，Ben和Colo 235(肺癌)，但與胚腎細胞系293不反應。通過免疫過氧化物酶染色分析表明，這三種Mab還與福爾馬林固定的組織反應，如結(jié)腸癌(7/9)，乳腺癌(5/7)，所有類型肺癌(18/20)，胃癌(3/4)，胰腺癌(1/2)，但與正常乳腺(0/4)，結(jié)腸(0/8)，肺(0/4)，胃(0/2)，胰腺(0/2)，肝(0/3)和淋巴細胞(0/3)不反應。染色的密度和百分率從陰性變化至強陽性，表明Cripto-1在不同的癌癥中不同程度地表達。圖3A示出Mab C4對乳腺癌組織的免疫過氧化物酶染色，相比之下，圖3B示出所述抗體對正常乳腺組織無染色。
實施例4在小鼠中，抗Cripto-1抗體對結(jié)腸癌細胞和前列腺癌細胞生長的體內(nèi)抑制作用在第0天，將SCID小鼠(6-8周齡)皮下接種2×106個前列腺癌細胞系DU145，6小時后，將小鼠用500μg的Mab C4經(jīng)腹膜內(nèi)施用進行處理，隨后在第2，4，7，9和10天用250μg處理，在第14和17天，用125μg處理。使用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(0.5ml)作為對照。
在第24天切除腫瘤并進行測定。用Mab C4處理的腫瘤大小和重量明顯降低(圖4A和4B)。
在結(jié)腸癌模型中，在接種LS174T細胞后16小時用500μg MabC13處理，然后在第2、7、9、11和13天用250μg處理，獲得相似結(jié)果(圖5A和5B)。在第25天切除腫瘤測定重量。
實施例5由抗Cripto-1抗體誘導的細胞凋亡抗Cripto-1 Mab終止細胞分裂(通過3H胸苷吸收降低測定)，并降低細胞數(shù)目(分別見圖1和2)，表明Mab誘導癌細胞凋亡。這通過DNA片段化和FACS分析進一步論證(圖6和7)。
在圖6中，可溶的DNA從已經(jīng)用50μg/ml的Mab C3處理72小時的LS174T細胞中提取，并在2％瓊脂糖凝膠上電泳。對照樣品取自用細胞培養(yǎng)基處理的細胞。
圖7示出用30μg/ml Mab C4或?qū)φ湛贵wMab BCP7處理72小時LS174T細胞，然后通過流式細胞儀分析以確定碘化丙錠(PI)染色，這是細胞凋亡的指征。結(jié)果示出在用測試的Mab處理的細胞中，PI染色增加。
實施例6抗Cripto-1抗體介導的信號轉(zhuǎn)導(i)抗Cripto-1 Mab誘導JNK激活由蛋白激酶控制的信號轉(zhuǎn)導途徑調(diào)節(jié)重要的細胞功能，包括細胞生長、分化和細胞凋亡。已經(jīng)鑒別了控制細胞凋亡的三種主要的激酶級聯(lián)，在激活三種不同的促分裂原活化蛋白激酶中達到頂點胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)，JNK/SAPK和p38。ERK由促分裂原和存活因子激活，而JNK/SAPK和p38由應激信號刺激。應激激活的激酶級聯(lián)包括JNK/SAPK，p38途徑在應答不同的細胞凋亡刺激中激活，而且似乎在細胞凋亡中起決定性作用。
JNK和p38活化在抗Cripto-1介導的細胞凋亡中的作用，在結(jié)腸癌LS17T細胞系中使用不同濃度的Mab和不同的溫育時間加以研究。特別地，JNK/SPAK在LS174T細胞中在用抗Cripto-1 Mab溫育3小時后，以劑量依賴性方式激活(圖8A)。JNK活化水平在暴露24小時后最高(圖8B和8D)，在48小時內(nèi)降低，在溫育72小時降至基本水平(圖8D)，表明由抗Cripto-1抗體對JNK的激活是時間依賴性的。
(ii)抗Cripto-1抗體對JNK的激活先于p38的激活應激相關(guān)的p38途徑也在用抗Cripto-1 Mab處理的LS174T細胞中加以研究，在暴露于Mab下48小時后，當激活的JNK水平降低時，p38激活。在72小時當提高的JNK降至基本水平時，p38進一步激活(圖8D)。因此，JNK激活發(fā)生在Mab誘導的細胞凋亡之前，同時p38在當細胞凋亡發(fā)生期間激活，提示這兩個信號也許參與Mab誘導的細胞凋亡。相反，順鉑誘導JNK和p38 MAPK均激活(圖8A和8C)，表明Mab以不同于順鉑的方式激活JNK和p38?？笴ripto-1Mab增強順鉑的細胞毒性(圖1)通過JNK磷酸化(圖8A)和p38 MAPK(圖8B)提高而實現(xiàn)。
因此，抗Cripto-1 Mab通過激活JNK和p38誘導細胞凋亡。
(iii)ERK和Akt磷酸化及Cripto-1表達Mab對ERK和Akt(圖8B和8D)存活途徑的抑制作用還未證實。在Mab處理后觀測到Cripto-1表達水平無變化(圖B和8D)。這些初步信號化研究清晰示出抗Cripto-1 Mab通過JNK激活途徑導致細胞凋亡。
實施例7抗Cripto-1抗體對白血病細胞的抑制圖9提供了示出Mab C3和C13抑制T細胞原淋巴細胞白血病細胞系CCRF-CEM生長的結(jié)果。所述抗體還抑制這個細胞系的耐藥變體CEM/A7R的生長，其通過P-糖蛋白的過表達獲得這個特性。因此，這個細胞系對多種天然產(chǎn)生的化療藥物有正常抗性。
Mab C4示出對耐藥細胞系CEM/A7和CEM/A7R及對藥物敏感的小鼠胸腺瘤細胞系(即E3)的相似抑制作用。
與E3相比，CEM/A7和CEM/A7R對表阿霉素的抗性分別為大約80和40倍(圖10A)。所述抗體表現(xiàn)為使耐藥細胞(圖10B)和藥物敏感細胞(圖10C)對表阿霉素敏感。因此，C4可以克服耐藥，耐藥是急性白血病的一個常見問題。
實施例8抗Cripto-1抗體對前列腺癌的作用將取自前列腺癌細胞系PC3的細胞用30μg/ml Mab C3培養(yǎng)6天。在第2，3和6天計數(shù)細胞數(shù)目。圖11示出在存在所述抗體的情況下，細胞數(shù)目明顯減少。在耐藥DU 145細胞中也觀測到相似作用，如圖12所示。
Mab C3也能使PC3細胞對藥物表阿霉素敏感，及使DU 145細胞對藥物順鉑敏感，分別如圖13和14所示。
實施例9抗Cripto-1抗體和抗癌藥物的作用Mab C4在結(jié)腸癌細胞LS174T中增強細胞毒性藥物如順鉑的抑制作用的能力如上述實施例2所示。關(guān)于表阿霉素和5 FU分別使用Mab C3和13觀測到相似結(jié)果，如圖15和16所示。
實施例10抗Cripto-1抗體和乳腺癌如圖17所示，Mab C3抑制乳腺癌細胞MCF7的生長，還進一步使所述細胞對順鉑，卡鉑和5FU敏感。使用Mab C13和表阿霉素觀測到相似結(jié)果(圖18)。
實施例11抗Cripto-1抗體的交聯(lián)Mab C3通過抗大鼠抗體交聯(lián)。Mab交聯(lián)的作用在乳腺癌細胞系MCF7中加以研究，將細胞用所述抗體溫育2小時，然后用兔抗大鼠抗體溫育4小時，隨后進行PI染色。未交聯(lián)的BCP7和MabC3用作對照。圖19示出交聯(lián)Mab明顯增加細胞死亡，使用PI通過流式細胞儀測定。
實施例12分離抗Pim-1抗體兩種分離的Mab(即P4和P9)是針對Pim-1癌基因的產(chǎn)物產(chǎn)生的。這個基因編碼屬于絲氨酸-蘇氨酸激酶類的蛋白質(zhì)?？筆im-1抗體抑制小鼠thyoma E3細胞的生長(圖20)及測試的結(jié)腸癌細胞系(圖21和22)和乳腺癌細胞系，這些抗體還示出抑制白血病和前列腺癌細胞系(數(shù)據(jù)未示出)。
實施例13分離結(jié)腸細胞裂解物抗原的抗體五種分離的Mab(即1.14，1.68，2.20，3.60和4.57)是針對未知的抗原通過用新鮮結(jié)腸癌組織的裂解物免疫大鼠而產(chǎn)生的。
還發(fā)現(xiàn)這些抗體在組織培養(yǎng)物中抑制結(jié)腸癌細胞系LS174T和乳腺癌細胞系MCF7生長(圖23)。當與順鉑組合使用時，這些抗體還抑制前列腺癌細胞系DU 145(圖24)。
實施例14抗體的人源化完全的人抗Cripto-1抗體是通過使用偶聯(lián)于KLH的兩種肽作為抗原進行免疫而產(chǎn)生的，一種肽稱為17-mer(97-113)肽(SEQ ID NO1)，用于生產(chǎn)Mab C3，C4和C13，另一種肽稱為37-mer肽p47(77-113)，其含有所述17-mer肽及Cripto-1的推定的結(jié)合位點及其受體ELNRTCCLNGGTCMLGSFCACPPSFYGPNCEHDVRKE(SEQ IDNO2)，并以與生產(chǎn)大鼠抗Cripto-1 Mab相同方式在體外和體內(nèi)測試。
將所述抗原用于免疫小鼠，隨后與非分泌的骨髓瘤細胞系NSO-bcl 2(其沒有免疫球蛋白基因)融合并篩選，或者此外用于免疫人Ig小鼠(例如XenoMouse)，其中所述小鼠免疫球蛋白基因已經(jīng)“剔除”并用人抗體置換，這樣它們只產(chǎn)生人抗體(nb可以進行多次免疫，并對小鼠篩選高親和性抗體的存在情況)，隨后使用基于微平板的細胞生長抑制分析鑒別產(chǎn)生具有抑制功能性質(zhì)的抗體的B細胞。
然后回收各個B細胞產(chǎn)生的抑制抗體的抗體編碼基因，并用于產(chǎn)生一組合適的重組候選抗體產(chǎn)物，每種均易于按比例擴大規(guī)模生產(chǎn)。
實施例15抗體的臨床應用將根據(jù)實施例14所述產(chǎn)生的人Mab，以0.5mg-10mg/kg體重的劑量通過靜脈內(nèi)注射施用于患者。所述患者也可以施用合適的抗癌藥物。
實施例16Cripto-1免疫的作用與“被動”施用于受者的抗體相反，Cripto蛋白或其抗原性片段可以用于“主動”免疫，并產(chǎn)生一種疫苗。在這個程序中，將Cripto抗原與一種載體組合(例如明礬、甘露聚糖、載體珠或其它佐劑)，并用于免疫癌癥患者作為癌癥的預防措施。產(chǎn)生的免疫應答可以是a)產(chǎn)生抗體，包括但非限于上述那些；b)產(chǎn)生T細胞，其識別由MHC I類或II類分子呈遞的Cripto抗原(產(chǎn)生的T細胞應答可以測定是以下情況的效應細胞細胞毒性T細胞，細胞因子(例如產(chǎn)生干擾素的細胞如ELISPOT或通過其它方式)，T細胞增殖和/或遲發(fā)型的體內(nèi)超敏反應)；和/或c)抗體和細胞免疫的組合。
因此，Cripto-1可用于生產(chǎn)施用于受者的抗體，或者Cripto-1可用于“接種”患者以產(chǎn)生抗體、T細胞或這二者。
將小鼠用與KLH綴合的實施例14所述Cripto-1 37-mer肽免疫，KLH用CFA乳化。通過ELISA和ELISPOT IFNγ分析測試免疫應答。小鼠在這兩種抗體和INFγ產(chǎn)品中均應答(如圖25和26所示)。
實施例17抗Cripto-1抗體與肺癌Mab C4也以劑量依賴性方式抑制肺癌細胞Ben和Colo 38中3H摻入。在Ben細胞中，在用Mab溫育72小時后與對照細胞相比，摻入抑制90％。在Colo 38細胞中，抑制為60％(圖27)。
肺癌細胞系Ben或肺癌組織也示出Mab C3免疫過氧化物酶染色，觀測到肺癌細胞表面和胞質(zhì)均染色，而在正常肺組織中未見染色。
本領域技術(shù)人員意識到在不偏離廣泛闡述的本發(fā)明精神或范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明加以各種改變和/或修改。因此本發(fā)明的實施方案只是例證了本發(fā)明而無限制之意。
序列表<110>奧斯汀研究院<120>抗癌抗體<130>MOD13135464<140>澳大利亞臨時專利中請No.PR3958<141>2002-03-26<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>17<212>PRT<213>智人<400>1Cys Pro Pro Ser Phe Tyr Gly Arg Asn Cys Glu His Asp Val Arg Lys1 5 10 15Glu<210>2<211>37<212>PRT<213>智人<400>2Glu Leu Asn Arg Thr Cys Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Met Leu Gly1 5 10 15Ser Phe Cys Ala Cys Pro Pro Ser Phe Tyr Gly Pro Asn Cys Glu His20 25 30Asp Val Arg Lys Glu3權(quán)利要求
1.Cripto-1蛋白、Pim-1蛋白或結(jié)腸癌細胞裂解物中存在的一種抗原的一種分離的結(jié)合配偶體，其中所述結(jié)合配偶體抑制一或多類癌細胞生長。
2.權(quán)利要求1的結(jié)合配偶體，其中所述結(jié)合配偶體抑制以下一或多種癌細胞生長結(jié)腸癌細胞、乳腺癌細胞、前列腺癌細胞、白血病細胞和肺癌細胞。
3.權(quán)利要求1的結(jié)合配偶體，其中所述結(jié)合配偶體抑制結(jié)腸癌細胞生長。
4.權(quán)利要求1的結(jié)合配偶體，其中所述結(jié)合配偶體抑制乳腺癌細胞生長。
5.權(quán)利要求1的結(jié)合配偶體，其中所述結(jié)合配偶體抑制前列腺癌細胞生長。
6.權(quán)利要求1的結(jié)合配偶體，其中所述結(jié)合配偶體抑制白血病細胞生長。
7.權(quán)利要求1的結(jié)合配偶體，其中所述結(jié)合配偶體抑制肺癌細胞生長。
8.權(quán)利要求1-7中任一項的結(jié)合配偶體，其中所述結(jié)合配偶體特異性結(jié)合Cripto-1蛋白。
9.權(quán)利要求8的結(jié)合配偶體，其中所述結(jié)合配偶體特異性結(jié)合一種Cripto-1氨基酸序列，所述序列基本上相應于CPPSFYGRNCEHDVRKE(SEQ ID NO1)。
10.權(quán)利要求1-7中任一項的結(jié)合配偶體，其中所述結(jié)合配偶體特異性結(jié)合Pim-1蛋白。
11.權(quán)利要求1-7中任一項的結(jié)合配偶體，其中所述結(jié)合配偶體特異性結(jié)合結(jié)腸癌細胞裂解物抗原。
12.權(quán)利要求11的結(jié)合配偶體，其中所述結(jié)腸細胞裂解物抗原分子量通過SDS-PAGE估計為16Kd或30Kd。
13.權(quán)利要求1-12中任一項的結(jié)合配偶體，其中所述結(jié)合配偶體是一種抗體或其片段。
14.權(quán)利要求13的結(jié)合配偶體，其中所述抗體或其片段是人源化的。
15.權(quán)利要求1-14中任一項的結(jié)合配偶體，其中所述結(jié)合配偶體與一種細胞毒性化合物綴合。
16.權(quán)利要求15的結(jié)合配偶體，其中所述細胞毒性化合物選自如表阿霉素的蒽環(huán)類抗生素、5-氟尿嘧啶、拓撲異構(gòu)酶抑制劑、順鉑、卡鉑和紫杉醇。
17.權(quán)利要求1-16中任一項的結(jié)合配偶體，其中所述結(jié)合配偶體與第一種結(jié)合蛋白綴合，所述第一種結(jié)合蛋白能結(jié)合第二種結(jié)合蛋白，以使所述結(jié)合配偶體與綴合第三種結(jié)合蛋白的另一種結(jié)合配偶體交聯(lián)，所述的第三種結(jié)合蛋白與所述第一種結(jié)合蛋白相同。
18.權(quán)利要求17的結(jié)合配偶體，其中所述第一種、第二種和第三種結(jié)合蛋白是抗體。
19.一種抗癌制劑，其包含權(quán)利要求1-18中任一項的結(jié)合配偶體，所述的結(jié)合配偶體任選地與一種藥用可接受的載體或稀釋劑組合。
20.一種治療癌癥患者的方法，所述方法包括為所述患者施用有效量的權(quán)利要求19的抗癌制劑。
21.一種癌癥疫苗，其包含Cripto-1蛋白(或其抗原性片段)、Pim-1蛋白(或其抗原性片段)或結(jié)腸癌細胞裂解物中存在的一種抗原，或者，其包含編碼Cripto-1蛋白(或其抗原性片段)、Pim-1蛋白(或其抗原性片段)或結(jié)腸癌細胞裂解物中存在的一種抗原的一種可表達的DNA分子。
22.權(quán)利要求21的癌癥疫苗，其中所述疫苗包含Cripto-1蛋白或編碼Cripto-1蛋白的一種可表達的DNA分子。
23.權(quán)利要求22的癌癥疫苗，其中所述疫苗包含Cripto-1抗原性片段或編碼Cripto-1抗原性片段的一種可表達的DNA分子，所述Cripto-1抗原性片段包含一種氨基酸序列，所述序列基本上相應于CPPSFYGRNCEHDVRKE(SEQ ID NO1)。
24.權(quán)利要求22的癌癥疫苗，其中所述疫苗包含一種肽或其抗原性片段，所述肽包含一種氨基酸序列，所述序列基本上相應于ELNRTCCLNGGTCMLGSFCACPPSFYGPNCEHDVRKE(SEQID NO2)。
25.權(quán)利要求21的癌癥疫苗，其中所述疫苗包含Pim-1蛋白或編碼Pim-1蛋白的一種可表達的DNA分子。
26.權(quán)利要求21的癌癥疫苗，其中所述疫苗包含一種結(jié)腸細胞裂解物抗原或編碼結(jié)腸細胞裂解物抗原的一種可表達的DNA分子。
27.權(quán)利要求26的癌癥疫苗，其中所述結(jié)腸細胞裂解物抗原的分子量通過SDS-PAGE估計為16Kd或30Kd。
28.一種治療癌癥患者的方法，所述方法包括為患者施用有效量的權(quán)利要求20-27中任一項的癌癥疫苗。
29.一種誘導癌細胞凋亡的方法，所述方法包括用權(quán)利要求1-18中任一項的結(jié)合配偶體處理所述細胞。
30.一種使癌細胞對細胞毒性化合物敏感的方法，所述方法包括用權(quán)利要求1-18中任一項的結(jié)合配偶體處理所述細胞。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述細胞毒性化合物選自如表阿霉素的蒽環(huán)類抗生素、5-氟尿嘧啶、拓撲異構(gòu)酶抑制劑、順鉑、卡鉑和紫杉醇。
32.一種誘導對患者的細胞產(chǎn)生CTL應答的方法，所述方法包括為所述患者施用有效量的肽或其抗原性片段，所述肽包含一種氨基酸序列，所述序列基本上相應于ELNRTCCLNGGTCMLGSFCACPPSFYGPNCEHDVRKE(SEQID NO2)。
全文摘要
本發(fā)明闡述了Cripto－1蛋白、Pim－1蛋白或結(jié)腸癌細胞裂解物中存在的一種抗原的一種分離的結(jié)合配偶體。所述結(jié)合配偶體抑制一或多類癌細胞生長，可以用作抗癌劑治療癌癥。所述結(jié)合配偶體還可以用于誘導癌細胞凋亡的方法中，以及用于使癌細胞對細胞毒性化合物敏感的方法中。此外，本發(fā)明闡述了一種癌癥疫苗，所述疫苗包含Cripto－1蛋白(或其抗原性片段)、Pim－1蛋白(或其抗原性片段)或結(jié)腸癌細胞裂解物中存在的一種抗原，或者其包含編碼Cripto－1蛋白(或其抗原性片段)、Pim－1蛋白(或其抗原性片段)或結(jié)腸癌細胞裂解物中存在的一種抗原的一種可表達的DNA分子。
文檔編號A61K48/00GK1639194SQ02807317
公開日2005年7月13日 申請日期2002年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月26日
發(fā)明者伊恩·法奎爾·坎貝爾·麥肯奇, 邢培祥 申請人:奧斯汀研究院