專利名稱：抑制炎癥的化合物的制作方法
十三肽α-促黑激素(αMSH)是由前體激素丙炔黑色皮質(zhì)素(POMC)生成得到的。有多種生物活性肽激素來源于POMC基因產(chǎn)物，這些激素的例子如β-促脂解素、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、β-內(nèi)啡肽和黑素細胞刺激素(α-、β-和γ-MSH)。加工這些肽需要具有不同特異性的蛋白水解酶。另外，還可能發(fā)生翻譯后的修飾例如發(fā)生乙酰化反應(yīng)。
α-MSH和其它POMC肽對各種組織的影響是通過一個特異性受體家族介導(dǎo)的。這些黑素細胞刺激素(MC)受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體類。目前已經(jīng)克隆了5種不同的黑素細胞刺激素受體(MC-1至MC-5)。一種看法認為αMSH是調(diào)節(jié)各種黑素細胞功能的重要信號。例如，通常認為αMSH影響黑素細胞的增殖、分化和細胞因子的產(chǎn)生。
現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)表明POMC基因產(chǎn)物能夠影響免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。例如，一種理論認為αMSH下調(diào)若干促炎細胞因子(proinflammatory cytokine)，而αMSH刺激抗炎細胞因子IL-10的產(chǎn)生。這意味著αMSH在抑制免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)方面有重要作用。若干研究表明αMSH通過其C-末端區(qū)域(氨基酸11-13Lys-Pro-Val)介導(dǎo)αMSH的免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用，因為給予C-末端三肽足以誘導(dǎo)這些作用(Catania和Lipton，1993，Endocr.Rev.14，564-576；Bhardvaj等.，1996，J.Immunol.156，2517-2521)。
WO 88/00833公開了三肽Lys-Pro-Val在制備用于治療炎癥的藥物中的應(yīng)用。αMSH的C-末端三肽也被建議作為防止頭發(fā)損失的試劑(FR 2 733 421)。
本發(fā)明的一個目的是提供另一些抑制炎癥的化合物。
現(xiàn)已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)三肽Lys-Pro-Thr具有抗炎活性。令人意外地，更小的化合物例如Lys-Pro和Lys也顯示有利的特性。
因此，本發(fā)明涉及式(I)化合物或其可藥用鹽在治療和/或預(yù)防炎性疾病中的應(yīng)用
其中X為羥基、氨基、烷氧基、Pro或Pro-Thr。術(shù)語“炎性疾病”不僅包括發(fā)炎，還包括涉及炎癥的疾病，例如自身免疫病或移植排斥反應(yīng)。
本發(fā)明的化合物可以是賴氨酸或二肽賴氨酸-脯氨酸，但優(yōu)選應(yīng)用三肽賴氨酸-脯氨酸-蘇氨酸(＝KPT)。
天然氨基酸通常具有(L)構(gòu)型。本發(fā)明的氨基酸可以具有(L)或(D)構(gòu)型。因此，KPT結(jié)構(gòu)的可能化合物為(L)Lys-(D)Pro-(L)Thr，(L)Lys-(L)Pro-(D)Thr，(L)Lys-(D)Pro-(D)Thr，(L)Lys-(L)Pro-(L)Thr，(D)Lys-(D)Pro-(L)Thr，(D)Lys-(D)Pro-(D)Thr，(D)Lys-(L)Pro-(L)Thr，(D)Lys-(L)Pro-(D)Thr，其中最優(yōu)選的化合物為(L)Lys-(D)Pro-(L)Thr。本發(fā)明的化合物還可顯示氨基酸替換，其中一個氨基酸被保守替換。
本發(fā)明的式(I)化合物可以在N-末端和/或C-末端進行化學(xué)修飾，例如在N-末端進行?；磻?yīng)(優(yōu)選進行乙?；磻?yīng))和/或在C末端進行酰胺化或酯化反應(yīng)。還可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它保護性基團進行保護。這些修飾還可以影響賴氨酸側(cè)鏈的氨基或蘇氨酸的羥基。也可以考慮在氨基側(cè)進行其它修飾，例如延長一個甘氨酸，和其它氨基酸殘基直至達到α-MSH的長度。
就本申請來說，術(shù)語“式(I)化合物”還包括該化合物的可藥用鹽。
所述化合物能夠用于治療所有類型的急性或慢性炎癥。這些炎癥特別包括例如皮膚的急性和慢性炎癥、牛皮癬、特應(yīng)性皮炎、各種變態(tài)反應(yīng)(從接觸變應(yīng)原所致鼻炎至哮喘和食物變態(tài)反應(yīng))、自身免疫病、纖維組織形成和硬皮病、移植排斥以及血管性疾病。這些化合物優(yōu)選用于治療皮膚炎癥，在此情況下以軟膏或乳膏的局部劑型給藥較有利。這些化合物在軟膏或乳膏劑型中的濃度通常為1μM至1mM、優(yōu)選10μM至100μM。這些軟膏或乳膏還可以另外含有常規(guī)成分，例如在Braun-Falco等，(1996)Dermatologie undVenerologie，Springer Verlag，Berlin或Merk，Bickers(1992)Dermatopharmakologie und Dermatotherapie中描述的成分。
在優(yōu)選的實施方案中，還可以把本發(fā)明的肽用于治療炎性腸疾病。炎性疾病的例子除了包括由輕度食物中毒引起的短期腸刺激外，還包括慢性腸疾病例如Crohn’s疾病或潰瘍性結(jié)腸炎。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，可以把本發(fā)明的化合物用于治療炎性疾病，其中炎癥發(fā)生于接觸環(huán)境的機體部位。這些部位特別包括口腔粘膜和胃腸道以及肺部。
然而，本發(fā)明的化合物還對炎癥的治療或預(yù)防具有全身活性。此時優(yōu)選以腹腔、靜脈內(nèi)或口服方式給藥所述化合物。給藥劑量通常為20μg-10mg/kg體重、優(yōu)選100μg-1mg/kg體重。
最后，所述化合物還可以噴霧劑形式給藥，例如經(jīng)吸入方式給藥用于治療氣道的炎癥。
還可以應(yīng)用一組不同的式(I)化合物進行治療。在此實施方案中，至少用兩種不同的式(I)化合物以治療炎癥。
還可以把式(I)化合物用于制備治療和/或預(yù)防炎癥的藥物。所有上面指出的實施方案可以類似地用于此用途。通常把所述化合物與可藥用載體或稀釋劑混合。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的制備藥物的方法記載于Forth，Henschler，Rummel(1996)Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie，Urban& Fischer中。
還可把式(I)化合物加入到食物中以降低某些食物成分的過敏反應(yīng)活性。因此，本發(fā)明還涉及式(I)化合物作為食品添加劑的應(yīng)用。在食物中的濃度可以是1μM-1mM。
還可以把式(I)化合物用作化妝品中的非藥物添加劑。例如，可以把含有式(I)化合物的乳膏用于刺激后的皮膚或者用于日光浴后的皮膚。
令人驚奇地，本發(fā)明的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)在體外用半抗原和αMSH處理樹突狀細胞，然后把這些細胞注射至實驗動物中，這樣會導(dǎo)致半抗原特異性耐受性的產(chǎn)生，并將導(dǎo)致CHS反應(yīng)(“接觸超敏反應(yīng)”)的抑制。因此，本發(fā)明還涉及體外制備能賦予對抗原的耐受性的細胞的方法，該方法包括提供抗原呈遞細胞，讓這些細胞接觸αMSH或其生物活性衍生物或片斷，然后讓這些細胞接觸抗原，其中最后兩個步驟可以按照任意順序進行或者同時進行。
已知有多種類型的抗原呈遞細胞。本發(fā)明優(yōu)選應(yīng)用樹突狀細胞或朗格漢斯細胞。并不需要把抗原呈遞細胞置于不含其它成分或細胞的制劑中。也可以把抗原呈遞細胞與其它細胞混合。優(yōu)選的實例是提供表皮細胞，其中以朗格漢斯細胞作為抗原呈遞細胞。還可以用已知的體外培養(yǎng)技術(shù)從骨髓中分離樹突狀細胞，或者從前體細胞，例如PBMC中產(chǎn)生樹突狀細胞。提供抗原呈遞細胞的方法可以參見Labeur等.J.of Immunol.162(1)168-175(1999)。
然后把所述細胞在體外與αMSH或其生物活性衍生物或片斷接觸。αMSH的生物活性衍生物或片斷的例子包括αMSH的化學(xué)修飾物、含有Lys，Lys-Pro、Lys-Pro-Val或Lys-Pro-Thr的αMSH片斷、或含有上述物質(zhì)之一的化合物?？梢栽趯嶋H上保留αMSH生物活性(誘導(dǎo)耐受的能力)的條件下對其作各種類型的修飾。用于接觸細胞的αMSH或所述衍生物的正常濃度為10-6M-10-16M、優(yōu)選10-8M-10-12M。
在細胞與αMSH或其生物活性衍生物或其片斷接觸之后、接觸之前或者在接觸的同時，讓細胞在體外與所述需誘導(dǎo)耐受的抗原接觸。在此情況下，所述抗原可以是具有變態(tài)反應(yīng)危險性的蛋白。例如，已知該抗原的半抗原可引起免疫反應(yīng)時，也可讓細胞與這種特異性半抗原接觸。此處可能的例子是含7-20個氨基酸的肽，其中優(yōu)選含7-15個氨基酸的肽。
可以在所述步驟之后洗滌抗原呈遞細胞，然后讓其與可藥用載體或稀釋劑混合。然后把細胞加入到患者或者哺乳動物中，在那里針對所應(yīng)用的半抗原或抗原產(chǎn)生耐受性。
本發(fā)明的另一方面涉及αMSH或其生物活性衍生物或其片斷在制備用于誘導(dǎo)對抗原的耐受性的藥物中的用途。制備的藥物優(yōu)選含有通過上述用于體外產(chǎn)生能夠賜予耐受性的細胞的方法獲得的細胞。
肽Lys-Pro-Thr防止內(nèi)皮細胞和角質(zhì)細胞中TNFα、IL-1或LPS對轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化。其結(jié)果導(dǎo)致細胞粘附分子(內(nèi)皮細胞)和趨化因子(角質(zhì)細胞)的表達降低。本發(fā)明的發(fā)明者還能夠指出例如，KPT肽預(yù)防接觸變應(yīng)性(接觸超敏反應(yīng)，CHS反應(yīng))的發(fā)生，并且誘導(dǎo)變應(yīng)原特異性的長期耐受性。這兩部分可以在CHS反應(yīng)中區(qū)別開與抗原的最初接觸(誘導(dǎo)期)建立后續(xù)CHS反應(yīng)的基礎(chǔ)，與抗原的再次接觸導(dǎo)致反應(yīng)的出現(xiàn)(接觸性皮炎即腫脹和瘙癢等)。可在這兩部分之前應(yīng)用本發(fā)明的化合物，當(dāng)在最初接觸前應(yīng)用(注射或局部應(yīng)用)，出現(xiàn)對CHS的抑制和對耐受的誘導(dǎo)，當(dāng)在誘導(dǎo)接觸性皮炎時應(yīng)用，這些化合物能夠防止皮炎的發(fā)生。在所有這些應(yīng)用中，變態(tài)反應(yīng)基本上完全被抑制。
另外還發(fā)現(xiàn)Lys-Pro-Thr降低樹突狀細胞表面協(xié)同刺激分子的表達。這最可能是與抑制CHS和誘導(dǎo)耐受性有關(guān)的機理的一部分。同時，這些化合物增加了單核細胞中抗炎性IL-10的分泌。這種作用也是與變應(yīng)性接觸皮炎有關(guān)的機理的一部分。
不愿以任何方式被一種理論所束縛，本發(fā)明的化合物可能結(jié)合β-腎上腺素能受體。另外還有一種理論是本發(fā)明的肽能夠結(jié)合IL-1的I型受體。但不能認為本發(fā)明的肽還結(jié)合其它受體(例如κ阿片樣物質(zhì)受體)?；谶@種假設(shè)，可以推測本發(fā)明的肽能夠結(jié)合多種受體，而這些受體被其原始配體活化后在炎性反應(yīng)中能夠干擾促炎途徑。本發(fā)明的肽與這些受體的結(jié)合可以防止這些受體與其原始配體的結(jié)合，從而防止誘導(dǎo)促炎作用。另一方面，本發(fā)明的肽與其起始物質(zhì)(αMSH)的受體的結(jié)合活化這些受體，從而誘導(dǎo)該作用機理的另一種成分，從而全面抗炎。


圖1表示靜脈給藥αMSH、KPV或KPT抑制CHS致敏期。
圖2表示靜脈給藥αMSH、KPV或KPT能夠誘導(dǎo)耐受性。
圖3說明人PBL用αMSH、KPV或KPT處理24小時后分泌IL-10的情況。
圖4說明人PBL用αMSH、KPV或KPT處理48小時后分泌IL-10的情況。
圖5顯示THP-1細胞表達αMSH的受體。
圖6a至d、7a至d和8a至d顯示在競爭性測試中，未標(biāo)記的αMSH、KPV或KPT能夠替換THP-1細胞的結(jié)合部位的生物素-標(biāo)記的αMSH。
圖9a顯示用TNFα+αMSH或TNFα+KPT處理24小時后，HMEC-1細胞表面的細胞粘附分子(CAMS)的表達。
圖9b顯示HDMEC對淋巴細胞的粘附性(鉻釋放試驗)。Amolt4 T淋巴細胞；BJYB淋巴細胞。
圖10顯示在LPS-處理的HMEC-1細胞中，αMSH、KP、KPV或KPT對NF-κB活化的影響。
圖11a顯示用αMSH處理降低了組織切片中E-選擇蛋白表達型導(dǎo)管(vessels)的數(shù)量。
圖11b顯示在LPS-處理的小鼠的耳朵中，用αMSH處理降低了瘀點損害的數(shù)目。
圖12顯示用αMSH或KP體外處理BMDC，可抑制CHS，并且能夠誘導(dǎo)耐受性。
圖13a顯示在NF-κB條帶移位分析中，各種αMSH衍生肽降低NF-κBp65/p50雜二聚物條帶的強度。
圖13b顯示在BalbC小鼠中，αMSH、KP或K對CHS反應(yīng)的影響和αMSH或KP對誘導(dǎo)耐受性的影響。
圖14顯示用荷抗原的、經(jīng)αMSH或衍生物處理的DC在體外接觸T-細胞后，T-細胞對CHS的抑制。
圖15顯示用荷抗原的、經(jīng)αMSH處理的DC體外接觸T細胞后，T細胞對耐受性的誘導(dǎo)。
圖16顯示用荷抗原的、經(jīng)αMSH或衍生物處理的DC接觸T-細胞后，T細胞中CTLA-4上調(diào)的情況。ACD4陽性T細胞；BCD8陽性T細胞。
下列實施例用于更詳細地解釋本發(fā)明。
實施例1小鼠實驗動物采用7-10周齡雌性Balb/C小鼠，其來自Charles River(Sulzfeld，德國)，并按照政府制定的規(guī)則保存。
給藥αMSH或KPV或KPT或KP在20℃儲存等份量的αMSH和所述肽備用。在注射前，把具體化合物溶解于PBS，0.1％小鼠血清中，置于冰上直至靜脈注射至小鼠的尾靜脈中。每只小鼠注射5μg αMSH或1.5μg肽(KP50μg)，2小時后進行致敏。
測定CHS和耐受性將未經(jīng)處理的小鼠腹部剃毛，涂敷75μl 0.5％DNFB在丙酮/橄欖油(4∶1)中的溶液。在小鼠一只耳朵的雙側(cè)施用10μl 0.3％DNFB以便誘導(dǎo)CHS。在接觸抗原24小時后，用彈簧量規(guī)測量耳朵的腫脹程度，把接觸抗原的耳朵與另一只對照處理的耳朵的腫脹程度進行比較，通過此方式測定CHS。把耳朵接觸了抗原但事先未致敏的小鼠用作陰性對照。為了確定在給藥半抗原前注射αMSH或肽是否會誘導(dǎo)耐受性，在致敏之前2小時如上所述對小鼠靜脈注射(腹部)或接觸(左耳)αMSH或肽。為了證實CHS受到經(jīng)αMSH-誘導(dǎo)的抑制，在致敏7天后，讓小鼠的一只耳朵接觸半抗原，24-36小時后測定耳腫脹反應(yīng)。14天后，同一只小鼠在已經(jīng)剃毛的小鼠背部(現(xiàn)在沒有外源性αMSH)再次致敏，一星期后讓半抗原第二次接觸小鼠的右耳，研究其誘導(dǎo)CHS反應(yīng)的能力。
在某些實驗中局部應(yīng)用αMSH制劑。在這些實驗中，將其應(yīng)用于小鼠的要致敏的部位(腹部)，然后立即或者在3小時或24小時后進行致敏反應(yīng)。
結(jié)果在DNFB接觸7天后，靜脈注射αMSH和KPV或KPT或KP抑制小鼠誘導(dǎo)CHS反應(yīng)的能力。這些小鼠因此不導(dǎo)致DNFB-特異性致敏作用。KPT能夠最有效地抑制CHS反應(yīng)(參見圖1和13b)。
為了區(qū)分開暫時的免疫抑制和特異性免疫耐受性，再次使小鼠致敏，并讓小鼠接觸半抗原。即使再次給藥致敏劑量的半抗原也不能使在首次致敏前注射了αMSH或KPV或KPT的小鼠致敏，這表明這些小鼠已經(jīng)發(fā)展了對DNFB的耐受性。KPV顯示弱的作用，而αMSH和KPT和KP非常明顯地抑制耳腫脹反應(yīng)(參見圖2和13b)。
實施例2材料和方法用Ficoll Hypaque密度梯度離心法從人血沉棕黃層分離單核細胞(PBMC)。這些細胞(1×106/ml)用含抗生素和10％FCS的RPMI 1640培養(yǎng)，對這些細胞不進行處理，或者用含有或不含IL-1β(10U/ml)的αMSH或肽KPV或KPT刺激。在孵育24或48小時后收集PBMC培養(yǎng)物的上清液，在-20℃下儲存直至下一步應(yīng)用。應(yīng)用市售的ELISA檢測IL-10。
結(jié)果在孵育24小時后，用各種濃度αMSH或肽處理的人PBMC或未處理的人PBMC僅僅產(chǎn)生低濃度的IL-10(5-10pg/ml)。αMSH(10-11M)、KPV(10-8至10-9M)和KPT(10-8至10-9M)明顯誘導(dǎo)IL-10的生成(參見圖3)。
在孵育48小時后，人PBMC產(chǎn)生大量的IL-10。αMSH、KPV和KPT明顯增加人PBLC中IL-10的生成。αMSH和肽之間沒有本質(zhì)區(qū)別(參見圖4)。
這些顯示的結(jié)果證明在靜脈給藥后，與αMSH和KPV一樣，肽KPT能夠抑制CHS的致敏，并且能夠誘導(dǎo)半抗原特異性的耐受性。KPT還能夠在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)IL-10。這些數(shù)據(jù)還表明αMSH在體內(nèi)的免疫抑制作用可能不僅僅依賴于IL-10的誘導(dǎo)。
實施例3材料和方法所有步驟在0-4℃進行。把THP-1單核細胞系在PBS中洗滌一次，用酸性甘氨酸緩沖液(50mM甘氨酸、100mM氯化鈉，pH3)洗滌一次，以及用RPMI洗滌三次。再把細胞(2.5×106/ml)重新懸浮于100μl RPMI/1％BSA中，然后轉(zhuǎn)移至96-孔微量滴定板中。加入生物素-標(biāo)記的αMSH(10-10M)后，讓細胞在4℃保溫1小時，用PBS洗滌一次，將其重新懸浮于100μl PBS/1％BSA中，然后在4℃用FITC-標(biāo)記的鏈霉抗生物素(40μg/ml)避光保溫30分鐘。經(jīng)最后洗滌步驟后，讓細胞重新懸浮于PBS中。應(yīng)用流式細胞儀分析結(jié)合的生物素-標(biāo)記的αMSH的含量。在對照實驗中，在無生物素標(biāo)記的αMSH但有FITC-鏈霉抗生物素的條件下培養(yǎng)細胞。在即將進行FACS分析之前加入碘化丙啶以排除死細胞。加入未標(biāo)記的αMSH(10-6至10-12M)或KPV或KPT(10-6至10-12M)測定生物素標(biāo)記的MSH的結(jié)合的特異性。
結(jié)果根據(jù)用生物素標(biāo)記的αMSH進行的FACS分析，與僅僅應(yīng)用FITC-鏈霉抗生物素保溫的對照混合物相比，未刺激的THP-1細胞表達顯著量的αMSH特異性結(jié)合部位。αMSH在該實驗中的應(yīng)用濃度為10-10M(參見圖5)。
為了確定THF-1細胞是否表達一種已知的黑素細胞刺激素受體(MC)之一，應(yīng)用MC-1-、MC-2-、MC-3-和MC-4-特異性的引物進行RT-PCR。從THP-1細胞中獲取總RNA。檢測含有預(yù)期長度416bp的MC-1特異性PCR產(chǎn)物(Rajora等.，1996，J.Leuk.Biol.，59，248)。不檢測MC-2、MC-3或MC-4特異性的PCR產(chǎn)物。所得結(jié)果顯示THP-1細胞表達MC-1，與其它黑素細胞刺激素受體相比，所述MC-1對αMSH和ACTH具有特異性。
為了研究在THP-1上表達的結(jié)合部位是否對αMSH具有特異性，應(yīng)用αMSH或KPV或KPT進行競爭實驗。通過應(yīng)用生物素標(biāo)記的αMSH(10-10M)和各種濃度的未標(biāo)記的αMSH或肽培養(yǎng)THP-1細胞來測定特異性結(jié)合。濃度為10-8的未標(biāo)記αMSH能夠顯著抑制αMSH結(jié)合。當(dāng)以10-6M、10-10M或10-12M的濃度應(yīng)用αMSH時沒有觀察到顯著的抑制(圖6a至6d)。
當(dāng)應(yīng)用未標(biāo)記的KPV時，僅僅在10-6M時觀察到顯著的抑制(參見圖7a至7d)。
而對于肽KPT來說，各個測試濃度下(10-6至10-12M)均觀察到對αMSH結(jié)合有顯著的抑制(參見圖8a至8d)。
這些結(jié)果表明KPT肽結(jié)合到對αMSH有特異性的THP-1細胞的黑素細胞刺激素受體，從而顯示αMSH和KPT具有共同的結(jié)合部位。然而，由于在非常低的濃度下KPT顯示對受體的競爭，因此，該肽比MSH對MC-1受體可能事實上具有更高的親和力。
實施例4材料和方法在應(yīng)用或不應(yīng)用所述肽之一的情況下，應(yīng)用TNFα或LPS處理人皮膚微血管內(nèi)皮細胞(HDMEC)和HMEC-1(人微血管內(nèi)皮細胞系-1)細胞系。在處理后的3小時和6小時之時收集細胞用于RNA分離，或者在處理后的3、6、16或24小時之時收集細胞用于粘附分子EIA或FACS分析。RNA進行反轉(zhuǎn)錄，利用PCR測定樣品中的E選擇蛋白、ICAM-1、VCAM或作為管家基因的β-肌動蛋白，以便進行半定量分析。為了進行淋巴細胞粘附試驗，把內(nèi)皮細胞引入皿中，與51Cr-標(biāo)記的淋巴細胞一起保溫。洗滌后，測定樣品中的放射活性以確定結(jié)合到EC層的剩余淋巴細胞的量。
結(jié)果用αMSH或KPT處理內(nèi)皮細胞抑制了LPS-或TNFα-誘導(dǎo)的粘附分子表達。10-6至10-12M濃度的αMSH或肽觀察到該作用。肽KPT對粘附分子mRNA的表達具有最強的作用。
所有這些激動劑均把LPS-或TNFα-誘導(dǎo)的粘附分子的表面表達降低至較小程度。這些數(shù)據(jù)可以通過EIA(應(yīng)用完整細胞)獲得，也可以應(yīng)用特異性抗體經(jīng)FACS獲得(參見圖9a，其顯示EIA數(shù)據(jù))。
αMSH明顯降低了T和B細胞與LPS-或TNF-αMSH-處理的EC層的結(jié)合(參見圖9b)?？傊@些結(jié)果顯示αMSH對淋巴細胞與EC之間的粘附有影響，因此也降低了組織炎癥狀況下淋巴細胞的外滲。這種結(jié)論得到了局部化結(jié)節(jié)性脈管炎的體內(nèi)數(shù)據(jù)的支持。
實施例5材料和方法
在存在或不存在肽的情況下，用IL-1、LPS或TNFα處理表皮細胞(EC)或正常人角質(zhì)細胞(HNK)。經(jīng)15或30分鐘后，得到核蛋白，應(yīng)用具有NF-κB-特異性結(jié)合序列的放射性標(biāo)記型寡核苷酸使核蛋白進行電泳纖移率變動分析(EMSA)。應(yīng)用未標(biāo)記的寡核苷酸作為競爭劑。在一些實驗中，應(yīng)用抗NF-κB的p65或p50鏈的抗體以便證實所測出的鏈?zhǔn)莗50均二聚物或p50/p65雜二聚物。
結(jié)果在TNFα-或LPS-處理的EC中以及在IL-1處理的HNK中加入所述肽導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化減弱(參見圖10和13a)。這將導(dǎo)致多種促炎癥介質(zhì)(細胞因子、趨化因子、粘附分子等)的基因的轉(zhuǎn)錄減少。應(yīng)用抗p65抗體證實在EMSA中觀察到的帶為NF-κB雜二聚物。
實施例6材料和方法以皮下注射途徑把LPS注射至小鼠的一只耳中。這種致敏性(preparatory)注射使LPS注射部位的E選擇蛋白表達長期升高。24小時后，腹腔注射另一個劑量的LPS(攻擊)。這種另一個劑量的LPS注射導(dǎo)致快速脈管(vessel)壞死，并導(dǎo)致瘀點損害的形成，這容易根據(jù)其大小和數(shù)目檢測到。在致敏性LPS注射時給藥αMSH(25μg)。
結(jié)果在致敏性LPS給藥時注射αMSH抑制了對耳中E-選擇蛋白局部表達的誘導(dǎo)(參見圖11a)，并且顯著降低了LPS攻擊性注射后形成的瘀點損害的大小和數(shù)目(參見圖11b)。
實施例7材料和方法從小鼠股骨中分離骨髓樹突狀細胞(BMDC)，用IL-4和GM-CSF處理6或9天。在第6或第9天，用αMSH(2×10-11M)或肽KP(2×10-6M)處理細胞3小時和2.5小時，然后再次注射至具有相同的基因背景的未處理小鼠中。在再次注射的2小時前，用半抗原(1mM DNBS，DNFB的水溶性形式)處理細胞。首先用PBS洗滌細胞兩次，然后立即進行再次注射。往各個動物中靜脈注射5×10-5細胞。對照組細胞單獨應(yīng)用DNBS處理，或者單獨用αMSH處理，或者不作處理。注射5天后，讓這些動物的耳朵接觸DNFB，然后在第二天測定耳朵厚度。2周后，用DNFB再次致敏動物，5天后再次接觸耳朵。最后，測定耳朵腫脹程度。
結(jié)果不出所料，注射了未處理細胞或經(jīng)αMSH處理的細胞的動物在第一次攻擊后沒有顯示免疫反應(yīng)。注射了DNBS-處理的BMDC的動物在第一次攻擊時顯示適當(dāng)?shù)腃HS反應(yīng)。該反應(yīng)在注射了預(yù)先用TNBS和αMSH或用TNBS和KP體外處理的細胞的動物中受到抑制。因此，DC與αMSH或肽接觸足以誘導(dǎo)CHS的抑制(參見圖12)。
在第二次攻擊時和相應(yīng)的再致敏反應(yīng)時，用DNBS處理的細胞再次注射的動物未顯示免疫反應(yīng)，而用DNBS/αMSH-處理的細胞注射的動物未顯示免疫反應(yīng)，這表明αMSH-誘導(dǎo)的耐受性也由DC介導(dǎo)(參見圖12)。
實施例8“應(yīng)用經(jīng)αMSH或αMSH衍生物處理的樹突狀細胞或T細胞進行的免疫治療”(從血液、骨髓或組織中)分離樹突狀細胞(DC)。然而也可應(yīng)用含有DC的細胞混合物(例如表皮細胞混合物)，在GM-CSF和IL-4的存在下(優(yōu)選各個物質(zhì)的濃度為250-1000μ/ml)培養(yǎng)。
經(jīng)過一個成熟期(優(yōu)選6-9天)后，向細胞上添加抗原(其濃度取決于具體的抗原，經(jīng)過類似的時間段)，然后用αMSH或其衍生物處理。這些衍生物至少相當(dāng)于αMSH的氨基酸12和13(Lys-Pro)，優(yōu)選含有Lys-Pro-Val-的衍生物。D和L構(gòu)型的氨基酸是可能的，保守的AA交換也是可能的。這也導(dǎo)致可能應(yīng)用來源于IL-1β的Lys-Pro-Thr，及其帶有N-末端延伸物的衍生物。也可以應(yīng)用帶有C-末端延伸物的衍生物。肽可以在加入抗原之前，同時，或之后，加入一次或多次(優(yōu)選的劑量取決于具體的肽，例如對于αMSH來說，其劑量為10-8M-10-14M)。
然后將如此處理的細胞靜脈注射至受體生物(也可以應(yīng)用腹腔注射或皮下注射方式)；小鼠2×105細胞接近下限。根據(jù)抗原的不同，有的進行單次注射就足夠，有的在必要時進行多次注射。還可能需要在長時間(此處沒有獲得數(shù)據(jù))后重復(fù)注射。
一種可能的選擇是讓DC與T細胞在體外接觸，然后注射該混合物或T細胞。在此情況下，DC可以在接觸T細胞之前或期間加載抗原。而且，T細胞可以來自已經(jīng)被特定抗原致敏的個體。小鼠中的下限為約1百萬T細胞，優(yōu)選更多的細胞(圖14和15)。
這種應(yīng)用模式的優(yōu)點在于防止各種類型的不需要的免疫反應(yīng)，它們是抗原特異性的，其中抗原特異性淋巴細胞(B或T細胞)具有致病作用。其中包括變態(tài)反應(yīng)、自身免疫病、慢性炎癥或植入。如果應(yīng)用足夠大量的細胞，還可能治療預(yù)先存在的疾病。
不愿被一種理論所束縛，可以從上述出人意外的結(jié)果得出的事實是αMSH是一個強效的免疫調(diào)節(jié)劑，具有多種抗炎特性。這包括減少DC表面協(xié)同刺激分子的表達。類似的特性也可以通過本發(fā)明的αMSH衍生物顯示，所述衍生物包括C-末端三肽和二肽Lys-Pro。具有不同氨基酸組成的衍生物(保守性AA交換)也具有相當(dāng)?shù)奶匦?，這些包括來源于IL-1β的Lys-Pro-Thr(因此，可推測與IL-1β具有序列共線性的N-末端(類似于αMSH)延長型肽具有相同的作用)。
αMSH及其衍生物能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)半抗原特異性的耐受性。DC是專職抗原呈遞細胞，其能夠誘導(dǎo)許多類型的免疫反應(yīng)，并且能夠決定這些反應(yīng)的過程。這些免疫反應(yīng)特別包括T-細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。
現(xiàn)在已經(jīng)有可能表明在αMSH或其衍生物的存在下，用抗原體外處理DC或DC/T細胞混合物，很可能導(dǎo)致細胞在注射至生物體后誘導(dǎo)半抗原特異性的耐受性。
此時，所述機理看來是由DC呈遞的抗原受αMSH或其衍生物調(diào)控。因此可能顯示在相應(yīng)混合物中的T細胞顯示CTLA-4的高表達(圖16)。這是抑制性T細胞特有的表面分子之一。
有可能用以此種方式產(chǎn)生的DC或T細胞預(yù)防性阻止自身免疫病、慢性炎癥或變態(tài)反應(yīng)。如果應(yīng)用足夠大量的細胞，還有可能治療預(yù)先存在的疾病。
本發(fā)明的化合物也可以借助樹突狀細胞的原位活化而用于腫瘤治療。該方法也可以在存在本發(fā)明肽的情況下用于耐受作用(tolerization)。
權(quán)利要求
1.式(I)化合物或其可藥用鹽在治療和/或預(yù)防炎性疾病中的應(yīng)用， 其中X為羥基、氨基、烷氧基、Pro或Pro-Thr。
2.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于式(I)化合物在N末端?；?或在C末端酰胺化或酯化。
3.權(quán)利要求1或2的應(yīng)用，其特征在于所述炎癥選自皮膚炎癥或脈管炎癥、變態(tài)反應(yīng)、自身免疫病、纖維組織形成、硬皮病或移植物排斥。
4.上述任意一項權(quán)利要求的應(yīng)用，其特征在于所述炎癥選自牛皮癬、特應(yīng)性皮炎、鼻炎、接觸性變態(tài)反應(yīng)、哮喘或食物性變態(tài)反應(yīng)。
5.上述任意一項權(quán)利要求的應(yīng)用，其特征在于所述炎癥為皮膚炎癥。
6.上述任意一項權(quán)利要求的應(yīng)用，其特征在于式(I)化合物以軟膏或乳膏形式給藥。
7.權(quán)利要求6的應(yīng)用，其特征在于式(I)化合物在軟膏或乳膏中的濃度為1μM至1mM。
8.權(quán)利要求1-5任意一項的應(yīng)用，其特征在于式(I)化合物以腹腔、靜脈內(nèi)或者口服方式給藥。
9.權(quán)利要求8的應(yīng)用，其特征在于式(I)化合物的給藥劑量為20μg-10mg/kg體重。
10.上述任意一項權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用至少兩種不同的式(I)化合物。
11.式(I)化合物作為食品添加劑的應(yīng)用。
12.式(I)化合物在制備化妝品組合物中的應(yīng)用。
13.體外產(chǎn)生能賦予對抗原的耐受性的細胞的方法，包括下列步驟a)提供抗原呈遞細胞，b)讓這些細胞接觸αMSH或其生物活性衍生物或片斷，和c)讓這些細胞接觸抗原，其中步驟b)和c)可以按照任意順序進行或者同時進行。
14.權(quán)利要求13的方法，其特征在于抗原呈遞細胞基本上是樹突狀細胞。
15.權(quán)利要求13的方法，其特征在于抗原呈遞細胞基本上是表皮細胞。
16.權(quán)利要求13-15任意一項的方法，其特征在于在步驟b)中讓所述細胞接觸含有αMSH、Lys-Pro-Val、Lys-Pro-Thr、Lys-Pro或Lys的化合物。
17.αMSH或其生物活性衍生物或片斷在制備用于誘導(dǎo)抗原耐受性的藥物中的應(yīng)用。
18.權(quán)利要求17的應(yīng)用，其特征在于所述藥物含有通過權(quán)利要求13-16任意一項的方法可獲得的細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及式Lys－X化合物或其可藥用鹽在治療炎癥中的應(yīng)用，其中X為羥基、氨基、烷氧基、Pro或Pro－Thr。本發(fā)明還涉及αMSH在誘導(dǎo)耐受性中的應(yīng)用。
文檔編號A61K38/06GK1541095SQ02807263
公開日2004年10月27日 申請日期2002年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月14日
發(fā)明者托馬斯·盧格爾, 托馬斯 盧格爾 申請人:托馬斯·盧格爾, 托馬斯 盧格爾