專(zhuān)利名稱(chēng)：新型癌抗原eEF2的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供檢測(cè)癌癥的方法和癌癥治療/預(yù)防用藥物組合物。本發(fā)明還提供包含與HLA分子具有結(jié)合能力的來(lái)自eEF2蛋白的連續(xù)的氨基酸的肽、包含這些肽的癌癥治療/ 預(yù)防用藥物組合物，詳細(xì)而言，提供HLA-A1402限制性eEF2肽、HLA_A*0201限制性eEF2肽、 或HLA-A*0206限制性eEF2肽、以及包含這些肽的癌癥治療/預(yù)防用藥物組合物等。需要說(shuō)明的是，本申請(qǐng)對(duì)日本國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第2009-002608號(hào)主張優(yōu)先權(quán)，并通過(guò)參照而將其全部?jī)?nèi)容納入本申請(qǐng)。
背景技術(shù)：
迄今為止已知有各種癌癥標(biāo)志物，但通過(guò)一種標(biāo)志物可以診斷多種癌癥的癌癥標(biāo)志物幾乎不存在，人們正在積極探索所述的癌癥標(biāo)志物。另一方面，現(xiàn)在人們相繼開(kāi)發(fā)了以HER2為靶的曲妥珠單抗(trastuzumab)、以酪氨酸激酶中的一種為靶的伊馬替尼(imatinib)、以EGFR為靶的吉非替尼(gefitinib)、以CD20抗原為靶的利妥昔單抗(rituximab)等癌分子靶向藥物，但以作為翻譯延伸因子而已知的真核翻譯延伸因子 (eukaryotic translation elongation factor 2，eEF2)為靴的癌癥治療 / 預(yù)防用藥物組合物尚不存在(非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。另外，人們還就各種癌癥進(jìn)行了抗原蛋白的檢索，但被證明是癌抗原的抗原蛋白不多。1 :Nygard 0, Nilsson L. Kinetic determination of the effects of ADP-ribosylation on the interaction of eukaryotic elongation factor 2 with ribosomes. J Biol Chem. 1990 ；265 :6030-
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題因此，本發(fā)明的解決課題在于提供以在多種癌癥中表達(dá)的蛋白為指標(biāo)來(lái)檢測(cè)癌癥的方法、以及用于治療或預(yù)防通過(guò)該方法檢測(cè)出的癌癥的藥物組合物。本發(fā)明的解決課題還在于提供包含來(lái)自該蛋白的癌抗原肽的藥物組合物。解決課題的方法本發(fā)明人等為了解決上述課題，進(jìn)行了深入研究。于是，發(fā)現(xiàn)了在多種癌組織中高度表達(dá)的1種標(biāo)志物蛋白eEF2，完成了以該標(biāo)志物蛋白的表達(dá)和相對(duì)于該標(biāo)志物蛋白在體內(nèi)產(chǎn)生的抗體為指標(biāo)的癌癥的檢測(cè)方法、以及以eEF2蛋白為靶的癌癥的治療/預(yù)防用藥物組合物。本發(fā)明人等還發(fā)現(xiàn)編碼eEF2蛋白的連續(xù)的氨基酸序列的一部分發(fā)揮癌抗原肽的功能，顯示可以將它們用作癌癥的治療/預(yù)防用藥物組合物。S卩，本發(fā)明提供下述(1) 06)(1)檢測(cè)對(duì)象的癌癥的方法，該方法包括測(cè)定在由該對(duì)象得到的試樣中eEF2多肽、eEF2抗體或eEF2基因的轉(zhuǎn)錄物的存在或量的步驟。(2) (1)所述的方法，其中，上述癌癥選自肺腺癌、非小細(xì)胞性肺癌、小細(xì)胞性肺癌、頭頸部扁平上皮癌、食道癌、食道扁平上皮癌、胃癌、大腸癌、胰管癌、神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 (神経膠芽腫)和惡性淋巴瘤。(3)雙鏈siRNA，該雙鏈SiRNA抑制癌細(xì)胞的增殖，其中，有義鏈由SEQ ID NO :2所示的RNA序列構(gòu)成，反義鏈由SEQ ID NO 3所示的RNA序列構(gòu)成。(4) (3)所述的雙鏈siRNA，其中，上述癌細(xì)胞來(lái)自選自胃癌、肺癌、胰癌、神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和惡性淋巴瘤的癌。(5)藥物組合物，其用于治療或預(yù)防癌癥，該藥物組合物包含C3)或(4)所述的雙鏈siRNA作為有效成分。(6)用于治療或預(yù)防癌癥的方法，其特征在于給予對(duì)象有效量的權(quán)利要求5所述的藥物組合物。(7) (3)或(4)所述的雙鏈siRNA在制造用于治療或預(yù)防癌癥的藥物中的應(yīng)用。(8) shRNA，該shRNA抑制癌細(xì)胞的增殖，并以由SEQ ID N0:18或SEQ ID N0:19所示的DNA序列轉(zhuǎn)錄的mRNA為靶。(9)核酸，該核酸是⑶所述的shRNA所轉(zhuǎn)錄的核酸，其具有SEQ ID NO :20或SEQ ID NO 22所示的DNA序列。(10)載體，該載體包含(9)所述的核酸。(11)藥物組合物，其用于治療或預(yù)防癌癥，該藥物組合物含有⑶所述的shRNA、 (9)所述的核酸或(10)所述的載體。(12)用于治療或預(yù)防癌癥的方法，其特征在于給予對(duì)象有效量的(11)所述的藥物組合物。(13)⑶所述的shRNA、(9)所述的核酸或(10)所述的載體在制造用于治療或預(yù)防癌癥的藥物中的應(yīng)用。(14)藥物組合物，其用于治療或預(yù)防HLA-A1402陽(yáng)性對(duì)象的癌癥，該藥物組合物包含eEF2肽，所述eEF2肽具有由來(lái)自eEF2蛋白的連續(xù)的氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列，上述氨基酸序列選自下述(a) (e)(a)Arg Phe Tyr Ala Phe Gly Arg Val Phe(SEQ ID NO 4)；(b)Ala Phe Gly Arg Val Phe Ser Gly Leu(SEQ ID NO :5)；(c)Arg Phe Asp Val His Asp Val Thr Leu(SEQ ID NO :6)；(d)Ala Tyr Leu Pro Val Asn Glu Ser Phe (SEQ ID NO :7)；以及(e)在(a) (d)所示的氨基酸序列中，取代、缺失或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列。(15) (14)所述的藥物組合物，其中，氨基酸序列為Ala Tyr Leu Pro Val Asn Glu Ser Phe(SEQ ID NO :7)。(16)藥物組合物，其用于治療或預(yù)防對(duì)象的癌癥，該藥物組合物包含編碼(14)所述的肽的多核苷酸。(17) (14) (16)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中，上述癌癥選自肺腺癌、小細(xì)胞性肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、胰管癌、惡性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、惡性淋巴瘤和頭頸部扁平上皮癌。(18)用于治療或預(yù)防癌癥的方法，其特征在于對(duì)HLA-A*2402陽(yáng)性對(duì)象給予有效量的(14) (17)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物。(19) (14)所述的肽在制造用于治療或預(yù)防癌癥的藥物中的應(yīng)用。(20)藥物組合物，其用于治療或預(yù)防HLA-A*0201陽(yáng)性對(duì)象的癌癥，該藥物組合物包含eEF2肽，所述eEF2肽具有由來(lái)自eEF2蛋白的連續(xù)的氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列，上述氨基酸序列選自下述(a) (h)(a)Arg Leu Met Glu Pro lie Tyr Leu Val (SEQ ID NO :8)；(b)Lys Leu Val Glu Gly Leu Lys Arg Leu(SEQ ID NO :9)；(c)Tyr Leu Asn Glu lie Lys Asp Ser Val(SEQ ID NO :10)；(d)Ile Leu Thr Asp lie Thr Lys Gly Val(SEQ ID NO :11)；(e)Leu Met Met Tyr lie Ser Lys Met Val (SEQ ID NO :12)；(f)Lys Leu Pro Arg Thr Phe Cys Gln Leu(SEQ ID NO :13)；(g)Leu lie Leu Asp Pro lie Phe Lys Val (SEQ ID NO :14)；以及(h)在(a) (g)所示的氨基酸序列中，取代、缺失或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列。(21) (20)所述的藥物組合物，其中，氨基酸序列為Arg Leu Met Glu Pro lie Tyr Leu Val (SEQ ID NO :8)或 lie Leu Thr Asp lie Thr Lys Gly Val (SEQ ID NO :11)。(22M20)所述的藥物組合物，其中，氨基酸序列為在Leu lie Leu Asp Pro Ile Phe Lys Val (SEQ ID NO :14)中將第2位氨基酸lie取代成Leu或Met、和/或?qū)⒌?位氨基酸Val取代成Leu而得到的氨基酸序列。(23)藥物組合物，其用于治療或預(yù)防對(duì)象的癌癥，該藥物組合物包含編碼O0)所述的肽的多核苷酸。(24) (20) 03)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中，上述癌癥選自肺腺癌、小細(xì)胞性肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、胰管癌、惡性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、惡性淋巴瘤和頭頸部扁平上皮癌。(25)用于治療或預(yù)防癌癥的方法，其特征在于給予對(duì)象有效量的00) 04) 中任一項(xiàng)所述的藥物組合物。(26) (20)所述的肽在制造用于治療或預(yù)防癌癥的藥物中的應(yīng)用。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，在患有癌癥或有可能患有癌癥的對(duì)象或預(yù)后的對(duì)象中，可以高靈敏度地檢測(cè)多種癌癥、例如肺腺癌、非小細(xì)胞性肺癌、小細(xì)胞性肺癌、頭頸部扁平上皮癌、食道癌、食道扁平上皮癌、胃癌、大腸癌、胰管癌、神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、惡性淋巴瘤等。并且，可以抑制通過(guò)上述方法檢測(cè)出的癌細(xì)胞的增殖。根據(jù)本發(fā)明，還可以得到HLA-Ai402限制性 eEF2肽或HLA-A*0201限制性eEF2肽、以及包含這些肽的癌癥的治療/預(yù)防用藥物組合物等，因此可以在具有HLA-A5402或HLA-A*0201的對(duì)象中誘導(dǎo)體內(nèi)和體外的eEF2特異性 CTL0特別是約55%的日本人具有至少一種HLA-A1402分子、而約19. 9%的日本人具有至少一種HLA-A*0201分子，所以可以在非常廣范圍的對(duì)象中誘導(dǎo)eEF2特異性CTL。


圖1顯示在來(lái)自肺癌患者的血清中檢測(cè)出eEF2IgG抗體。
圖2顯示使用由患有非小細(xì)胞性肺癌(左圖)和小細(xì)胞性肺癌(右圖)的患者得到的肺的組織切片中的抗eEF2抗體的免疫染色的結(jié)果。圖3顯示使用由患有頭頸部扁平上皮癌(左圖)和食道扁平上皮癌(右圖)的患者得到的頭頸部扁平上皮和食道扁平上皮的組織切片中的抗eEF2抗體的免疫染色的結(jié)^ ο圖4顯示使用由患有胃癌(左圖)和大腸癌(右圖)的患者得到的胃和大腸的組織切片中的抗eEF2抗體進(jìn)行的免疫染色的結(jié)果。圖5顯示由各種癌癥的患者和健康人得到的血清中的eEF2抗體的檢測(cè)。圖6顯示在非小細(xì)胞性肺癌患者中，血清中的eEF2抗體效價(jià)的值高的對(duì)象中預(yù)后良好。圖7顯示以eEF2基因的mRNA為靶的雙鏈siRNA抑制胃癌細(xì)胞株的增殖。圖8顯示以eEF2基因的mRNA為靶的雙鏈siRNA抑制各種癌細(xì)胞株的細(xì)胞增殖。圖9顯示使用eEF2786_794肽誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性。圖10顯示使用eEF2786_794肽誘導(dǎo)的CTL對(duì)內(nèi)源性eEF2基因表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。圖11顯示通過(guò)FACS分析使用eEF2739_747肽誘導(dǎo)的干擾素Y的圖。圖12顯示通過(guò)FACS分析使用eEF2661_669肽誘導(dǎo)的干擾素Y的圖。圖13是顯示eEF2蛋白的強(qiáng)制表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞周期G2/M期的進(jìn)展的圖。圖14是顯示eEF2蛋白的強(qiáng)制表達(dá)促進(jìn)體內(nèi)的腫瘤形成的圖。圖15是顯示eEF2蛋白的強(qiáng)制表達(dá)促進(jìn)體內(nèi)的腫瘤形成的圖。圖16是顯示使用eEF2739_747肽誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性的圖。圖17是顯示使用eEF&19_527肽誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性的圖。圖18是顯示使用eEF2671_679肽誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性的圖。圖19是顯示使用eEF2661_669肽誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性的圖。圖20是顯示使用eEFA94_4(12肽誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性的圖。圖21是顯示使用eEF2284_2i32肽誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性的圖。圖22是顯示使用eEFAf肽誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性的圖。圖23是顯示使用eEF2292_3QQ2L肽誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性的圖。圖M是顯示使用eEF2292_3(1(12M肽誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性的圖。
圖25是顯示使用eEF2292_3QQ2L9L肽誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性的圖。圖26 是顯示用 eEF&92_3。。肽或修飾型 eEF&92_3。。肽(eEF22i32_3。。2L、eEF2 292_3。。2M 和 eEF2292_3(l(l2L9L肽)進(jìn)行脈沖時(shí)的干擾素-γ活性測(cè)定的結(jié)果的圖。圖27是顯示eEF2的新型shRNA在體外抑制癌細(xì)胞增殖的圖。細(xì)胞數(shù)以導(dǎo)入有表達(dá)eEF2的shRNA的載體的細(xì)胞數(shù)相對(duì)于導(dǎo)入有對(duì)照載體即shLuc的細(xì)胞數(shù)的比例(％ )表
7J\ ο圖28是顯示用修飾型eEF2 292_3QQ肽(eEF492_3QQ2M9L肽)進(jìn)行脈沖時(shí)的干擾素_ Y 活性測(cè)定的結(jié)果的圖。圖四是顯示7 種 eEF2 肽(eEFAw-·肽、eEF2739_747 肽、eEF&19_527 肽、eEF&71_679 肽、 eEF2661_669肽、eEF2394_4(12肽和eEF2284_2i32肽)也是HLA_A*0206限制性肽的干擾素Y活性測(cè)定的結(jié)果。圖30 是顯示用 3 種 eEF2 肽(eEF2409_417 肽、eEF2412_420 肽和 eEF2701_709 肽)進(jìn)行脈沖時(shí)的干擾素-Y活性測(cè)定的結(jié)果的圖。
具體實(shí)施例方式在一個(gè)方案中，本發(fā)明提供檢測(cè)癌癥的方法。可以利用本發(fā)明的方法檢測(cè)癌癥的對(duì)象可以是任何動(dòng)物、例如人、猴、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豚鼠、牛、馬、綿羊、山羊、豬、狗、貓、兔等，但最優(yōu)選為人。在本發(fā)明中，即使對(duì)象動(dòng)物健康也可以使用，優(yōu)選為患有癌癥或有可能患有癌癥的狀態(tài)。另外，即使對(duì)象是癌癥治療的預(yù)后也可以使用。并且，本發(fā)明的特征在于 可以較用作現(xiàn)有的癌癥標(biāo)志物的CEA更早地檢測(cè)出癌癥。例如，本發(fā)明的方法可以在早期階段、特別是在I期階段以高靈敏度檢測(cè)出非小細(xì)胞性肺癌。這里，I期階段是指在由惡性腫瘤的病期分類(lèi)即國(guó)際癌癥防治聯(lián)合會(huì)規(guī)定的 M分類(lèi)中，表示分類(lèi)為T(mén)l或T2、NO和MO 的腫瘤的狀態(tài)的時(shí)期。本發(fā)明可以使用由上述對(duì)象得到的試樣來(lái)實(shí)施。本發(fā)明中使用的試樣可以是任何試樣，例如可以使用含有細(xì)胞的組織。本發(fā)明中使用的試樣優(yōu)選為各種組織切片或血清。由對(duì)象獲得試樣可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員中利用普通方法來(lái)進(jìn)行。例如，使用組織切片作為本發(fā)明中使用的試樣時(shí)，可以將通過(guò)手術(shù)或活體得到的組織在10%福爾馬林中固定一夜，之后進(jìn)行石蠟包埋以制成薄切切片。此外，使用血清作為本發(fā)明中使用的試樣時(shí)，可以使對(duì)象的末梢血在裝有分離劑的試管中凝固，之后通過(guò)離心來(lái)獲取。通過(guò)本發(fā)明的方法能夠檢測(cè)的癌癥包括表達(dá)eEF2蛋白的所有癌癥，優(yōu)選為肺腺癌、非小細(xì)胞性肺癌、小細(xì)胞性肺癌、頭頸部扁平上皮癌、食道癌、食道扁平上皮癌、胃癌、大腸癌、胰管癌、神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和惡性淋巴瘤。特別優(yōu)選的癌癥為肺腺癌、小細(xì)胞性肺癌、 胃癌、大腸癌、惡性淋巴瘤。本發(fā)明中檢測(cè)的癌癥可以是處于任何分期的癌癥。例如，可以檢測(cè)由上述國(guó)際癌癥防治聯(lián)合會(huì)規(guī)定的 m分類(lèi)的I期、II期、III期中任一分期的癌癥。 另外，在本發(fā)明的方法中，特別可以在早期檢測(cè)的癌癥是非小細(xì)胞性肺癌。在對(duì)象中實(shí)施本發(fā)明的檢測(cè)方法時(shí)，可以測(cè)定上述試樣中eEF2多肽的存在或量。 本發(fā)明中的eEF2多肽是指具有eEF2蛋白的氨基酸序列或其部分序列的多肽，包括以下的突變型多肽。即，本發(fā)明中的eEF2多肽可以是具有SEQ ID NO :1所示的人eEF2蛋白的氨基酸序列的多肽，或者可以是具有下述氨基酸序列的多肽在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中， 缺失、取代或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列；或在SEQ ID NO 1的氨基酸中， 缺失、取代、添加和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列，例如缺失、取代或添加 1 9個(gè)、優(yōu)選1 5個(gè)、1 4個(gè)、1 3個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選1 2個(gè)、更優(yōu)選1個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列，或缺失、取代、添加和/或插入1 9個(gè)、優(yōu)選1 5個(gè)、1 4個(gè)、1 3 個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選1 2個(gè)、更優(yōu)選1個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列；與SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有70%以上的同源性、優(yōu)選80%以上的同源性、更優(yōu)選90%以上的同源性、進(jìn)一步優(yōu)選93%、95%或99%以上的同源性的氨基酸序列；以及上述中的任一個(gè)氨基酸序列的片段的氨基酸序列。氨基酸序列的同源性可以利用FASTA、BLAST等普通的序列分析用工具來(lái)測(cè)定。本發(fā)明中的片段是指上述eEF2多肽的一部分。并且，在本發(fā)明中，eEF2多肽是指與eEF2蛋白具有同等性質(zhì)的多肽，包括具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列由在嚴(yán)格條件下與編碼SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的核苷酸序列雜交的核苷酸序列編碼。 本說(shuō)明書(shū)中的同等的性質(zhì)是指，作為eEF2蛋白，具有同等的生物學(xué)、化學(xué)和物理學(xué)特性。在本發(fā)明中，eEF2蛋白是來(lái)源于人的eEF2蛋白，但即使是來(lái)源于例如小鼠、猴、大鼠、牛、貓等其他動(dòng)物的eEF2蛋白，這些動(dòng)物種中的eEF2也可以包含在本說(shuō)明書(shū)中的eEF2蛋白中。本發(fā)明中，上述雜交條件可以根據(jù)J. Sambrook等人，“Molecular Cloning =A Laboratory Manual, Second Edition",1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press 白勺記載，由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)選擇。雜交條件可以是嚴(yán)格性差的條件，但優(yōu)選為嚴(yán)格性強(qiáng)的條件。嚴(yán)格性差的條件是指，根據(jù)上述文獻(xiàn)在雜交后的清洗中，例如42°C、0. 1XSSC、0. 1% SDS的條件，優(yōu)選為50°C、0. 1XSSC.0. 1% SDS的條件。嚴(yán)格性強(qiáng)的條件例如包括65°C、 5XSSC和0. 1% SDS的條件等。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)適當(dāng)選擇這些要素，可以實(shí)現(xiàn)同樣的條件。本發(fā)明的檢測(cè)方法可以通過(guò)任何方法來(lái)進(jìn)行。例如，本發(fā)明的檢測(cè)方法可以使用抗上述eEF2多肽的抗體來(lái)進(jìn)行。在本發(fā)明的檢測(cè)方法中，可以使用抗具有上述eEF2多肽的任何區(qū)的氨基酸序列的多肽的抗體，例如可以是抗具有人eEF2蛋白的氨基酸序列中的第1 417位或第411 858位的區(qū)的多肽的抗體。本發(fā)明中使用的抗體可以是IgG、IgA、 IgM、IgD、IgE中的任一個(gè)同種型。本發(fā)明中使用的抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。 本發(fā)明中使用的抗體可以利用普通方法來(lái)制作，可以是市售的抗體。本發(fā)明的檢測(cè)方法還可以使用抗eEF2抗體的抗體來(lái)進(jìn)行。本發(fā)明中可以檢測(cè)的 eEF2抗體是在體內(nèi)、即對(duì)象的體內(nèi)制作的抗體。在本發(fā)明的檢測(cè)方法中，上述抗eEF2抗體的抗體可以利用公知的方法來(lái)制作，或者可以是市售的抗體。優(yōu)選為抗_eEF2抗體(H-118， Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 0本發(fā)明中，為了測(cè)定試樣中的eEF2多肽或eEF2抗體的存在或量，可以使用公知的手段、方法。只要是可以定性、定量地檢測(cè)eEF2多肽或eEF2抗體的方法，可以是任何手段、 方法，例如包括免疫染色法、點(diǎn)漬法、熒光抗體法、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)、中和抗體測(cè)定法、免疫沉淀法、蛋白質(zhì)印跡法、放射免疫測(cè)定(RIA)法、ELISA法、雙雜交系統(tǒng)等免疫學(xué)的蛋白檢測(cè)方法。在本發(fā)明中，可以優(yōu)選使用免疫染色法或點(diǎn)漬法。在本發(fā)明的檢測(cè)方法中，通過(guò)將由對(duì)象得到的試樣中的eEF2多肽或eEF2抗體的存在或量與由健康對(duì)象或正常時(shí)期的對(duì)象得到的試樣中的eEF2多肽或eEF2抗體的存在或量進(jìn)行比較，可以確定為陽(yáng)性。在本發(fā)明的檢測(cè)方法中，使用血清作為試樣時(shí)，可以以血清中的eEF2抗體的抗體效價(jià)(光密度單位(densitometric units))為指標(biāo)。此時(shí)，利用點(diǎn)漬法測(cè)定對(duì)象的血清中的eEF2抗體的抗體效價(jià)，可以確定高于來(lái)自健康對(duì)象的血清的數(shù)值、 優(yōu)選1000以上、更優(yōu)選2000以上的抗體效價(jià)(光密度單位)為陽(yáng)性，但該數(shù)值可以依賴(lài)于癌癥的種類(lèi)或組織等各種因子而變動(dòng)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)設(shè)定。另外，使用組織切片作為試樣時(shí)，可以以組織切片中免疫染色法的染色程度為基準(zhǔn)。此時(shí)，例如與對(duì)應(yīng)的正常細(xì)胞相比顯示出強(qiáng)染色的癌細(xì)胞為癌細(xì)胞總體的25%以上時(shí)，可以判斷為陽(yáng)性，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)判斷。當(dāng)在對(duì)象中實(shí)施本發(fā)明的檢測(cè)方法時(shí)，可以測(cè)定試樣中eEF2基因的轉(zhuǎn)錄物的存在或量。本發(fā)明中的eEF2基因的轉(zhuǎn)錄物是指由編碼上述eEF2多肽或其片段的氨基酸序列的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物，例如可以是mRNA或所有的其他類(lèi)型的RNA、以及它們的片段等。另外，在本發(fā)明的檢測(cè)方法中，可以測(cè)定具有編碼eEF2多肽或其片段的氨基酸序列的核苷酸序列(例如DNA序列)的多核苷酸的存在或量。在本發(fā)明中，為了測(cè)定試樣中的上述轉(zhuǎn)錄物或多核苷酸的存在或量，作為多核苷酸的檢測(cè)方法，在本領(lǐng)域技術(shù)人員中可以使用普通的手段、方法。例如包括原位雜交法、 RNA印跡法、DNA印跡法、點(diǎn)漬法、RNA酶保護(hù)試驗(yàn)(RNase Protection Assay)法、PCR法、 RT-PCR法、實(shí)時(shí)PCR等多核苷酸的檢測(cè)方法。另外，還可以進(jìn)行使用微陣列(例如DNA微陣列、microRNA微陣列、蛋白微陣列等)的基因分析方法，只要可以定性、定量地檢測(cè)上述轉(zhuǎn)錄物或多核苷酸，可以是上述方法以外的方法。并且，本發(fā)明的方法可用于診斷患有癌癥的對(duì)象的預(yù)后?？梢詰?yīng)用本發(fā)明的方法的癌癥可以是如上所述的表達(dá)eEF2蛋白的任何癌癥，但優(yōu)選為肺腺癌、非小細(xì)胞性肺癌、 小細(xì)胞性肺癌、頭頸部扁平上皮癌、食道癌、食道扁平上皮癌、胃癌、大腸癌、胰管癌、神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、惡性淋巴瘤。更優(yōu)選為非小細(xì)胞性癌。在本發(fā)明的預(yù)后的診斷中，由對(duì)象得到的試樣中的eEF2抗體的抗體效價(jià)越高，則可以判斷預(yù)后越良好。eEF2抗體的抗體效價(jià)(光密度單位)例如為1000以上、優(yōu)選2000以上、更優(yōu)選為4000以上的值，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以考慮各種因素后適當(dāng)確定。在另一方案中，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)癌癥的診斷試劑盒，該試劑盒包含抗上述 eEF2多肽或eEF2抗體的抗體、或與上述eEF2基因的轉(zhuǎn)錄物或其一部分互補(bǔ)的多核苷酸探針作為必須構(gòu)成成分。在本發(fā)明中，上述抗體或探針優(yōu)選被標(biāo)記。上述標(biāo)記可以按照普通方法進(jìn)行。本發(fā)明的試劑盒除包含抗上述eEF多肽或eEF2抗體的抗體、或與上述eEF2基因的轉(zhuǎn)錄物或其一部分互補(bǔ)的多核苷酸探針以外，還包含例如蛋白或多核苷酸的檢測(cè)方法所必須的試劑、試樣的獲取手段、反應(yīng)容器等。通常，試劑盒中附帶操作說(shuō)明書(shū)。使用本發(fā)明的試劑盒，可以在血清或組織中高效率地檢測(cè)表達(dá)eEF2蛋白的癌癥。在又一方案中，本發(fā)明涉及抑制癌細(xì)胞增殖的雙鏈siRNA。本發(fā)明中，可以抑制增殖的癌細(xì)胞可以是表達(dá)eEF2蛋白的任一種癌，優(yōu)選為肺腺癌、非小細(xì)胞性肺癌、小細(xì)胞性肺癌、頭頸部扁平上皮癌、食道癌、食道扁平上皮癌、胃癌、大腸癌、胰管癌、神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和惡性淋巴瘤。特別優(yōu)選的癌是肺腺癌、小細(xì)胞性肺癌、胃癌、大腸癌、惡性淋巴瘤。本發(fā)明的siRNA是包含以由人eEF2基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的核苷酸序列為靶的有義鏈和反義鏈的雙鏈siRNA。本發(fā)明的siRNA所靶向的核苷酸序列可以是編碼SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的核苷酸序列的部分序列。本發(fā)明的siRNA優(yōu)選為由具有以下所示的RNA 序列的有義鏈(SEQ ID N0J)和反義鏈(SEQ ID NO⑶構(gòu)成的雙鏈siRNA。本發(fā)明的siRNA 的有義鏈(SEQ ID NO 2)；5’ -CAUGGGCAACAUCAUGAUCGAUCCU⑶CCU-3，本發(fā)明的siRNA的反義鏈(SEQ ID NO 3)；5’ -AGGACAGGAUCGAUCAUGAU⑶UGCCCAUG-3’本發(fā)明的siRNA的優(yōu)選的RNA序列為上述SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示的序列，但在這些序列中可以添加、缺失、取代1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)堿基。或者，在這些序列中可以取代、缺失、添加和/或插入1 3個(gè)、優(yōu)選1個(gè)或2個(gè)、更優(yōu)選1個(gè)堿基。就此時(shí)的雜交條件而言，當(dāng)向生物體內(nèi)給予本發(fā)明的siRNA而加以使用時(shí)，雜交條件為生物體內(nèi)的條件；當(dāng)將本發(fā)明的siRNA作為試劑在體外使用時(shí)，雜交條件為中度的嚴(yán)格條件或嚴(yán)格性強(qiáng)的條件，作為這樣的條件，例如有400mM NaCl、40mM PIPES pH6. 4UmM EDTA、50°C 70°C下、12 16 小時(shí)的雜交條件。另外，本發(fā)明的siRNA的有義鏈序列與靶序列具有90%以上、優(yōu)選95% 以上、進(jìn)一步優(yōu)選95、96、97、98或99%以上的序列同源性。并且，本發(fā)明的siRNA可以在5’末端或3’末端添加突出端序列。這里，突出端序列是指，為了提高雙鏈siRNA的穩(wěn)定性而添加在有義鏈和反義鏈配對(duì)的雙鏈序列的5’末端或3’末端的任一端的突出的序列，例如從5’側(cè)起是AG、UA、AUG、UUG和AAGCUU等序列，但可以是任何序列。本發(fā)明的雙鏈siRNA優(yōu)選在有義鏈和反義鏈的3’末端添加UU。另外， 上述的本發(fā)明的雙鏈siRNA可以通過(guò)環(huán)狀序列(loop sequence)連接雙鏈siRNA以形成 shRNA。本發(fā)明的雙鏈siRNA在本領(lǐng)域技術(shù)人員中可以通過(guò)普通方法來(lái)制備。例如，可以在體外進(jìn)行化學(xué)或酶合成、或者可以在體內(nèi)合成，但并不限于這些方法。優(yōu)選為化學(xué)合成法。利用上述合成方法合成各鏈后，可以在一般的配對(duì)條件下使之配對(duì)。使用時(shí)，根據(jù)需要可以適當(dāng)純化。另外，本發(fā)明的雙鏈siRNA可以以表達(dá)上述siRNA的RNA序列(SEQ ID NO 2和SEQ ID NO :3)的siRNA表達(dá)載體的形式制備。此時(shí)，例如可以使用tRNA_shRNA表達(dá)載體、piGENE tRNA Pur(Clontech, Palo Alto, CA)來(lái)制作。對(duì)本發(fā)明中使用的siRNA的長(zhǎng)度沒(méi)有特別限定，但作為本發(fā)明的優(yōu)選的siRNA的例子，有15 50mer的siRNA ；作為進(jìn)一步優(yōu)選的例子，有20 40mer的siRNA ；作為更優(yōu)選的例子，有25 35mer (例如30mer) 的siRNA。因此，本發(fā)明的優(yōu)選的siRNA的例子有可以和eEF2 mRNA的5’ -CAUGGGCAACAU CAUGAUCGAUCCU⑶CCU-3，序列雜交的雙鏈siRNA，其中，各siRNA的長(zhǎng)度為15 50mer、優(yōu)選 20 40mer、進(jìn)一步優(yōu)選25 35mer (例如3Omer)的雙鏈siRNA。通常，已知在導(dǎo)入有siRNA的細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)靶基因與mRNA的結(jié)合來(lái)抑制siRNA的表達(dá)。因此，本發(fā)明的雙鏈siRNA具有抑制eEF2基因的表達(dá)的功能，由此可以抑制導(dǎo)入有雙鏈siRNA的對(duì)象中的細(xì)胞的增殖。本發(fā)明中的siRNA的導(dǎo)入或給藥方法可以是使用轉(zhuǎn)染試劑的磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、非脂質(zhì)體法、電穿孔、磁顆粒等本領(lǐng)域技術(shù)人員中公知的方法、 或?qū)iRNA插入普通siRNA表達(dá)載體中后利用上述公知的方法將其導(dǎo)入的方法。優(yōu)選利用公知方法導(dǎo)入表達(dá)上述siRNA的RNA序列(SEQ ID NO :2和SEQ ID NO 3)的siRNA表達(dá)載體。另外，如下所述，本發(fā)明的siRNA可以以藥物組合物的形式進(jìn)行給藥。在本發(fā)明中，提供以上述雙鏈siRNA作為有效成分的用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物。在本發(fā)明的藥物組合物中，作為有效成分，除上述雙鏈siRNA以外，還可以含有公知的抗癌藥。在本發(fā)明的藥物組合物中，作為有效成分的siRNA可以以被插入到載體中的形式含有。例如，可以以克隆到由制造商市售的siRNA表達(dá)載體等公知的siRNA表達(dá)載體或根據(jù)使用方式適當(dāng)重組的公知的siRNA表達(dá)載體中的形態(tài)含有。因此，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明的siRNA的核酸、以及包含該核酸的載體。本發(fā)明的藥物組合物可以含有藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明中可以使用的藥學(xué)上可接受的載體可以是選自生理鹽水、蒸餾水、林格液(Ringer ’ s液)、緩沖生理鹽水、葡萄糖溶液、麥芽葡萄糖溶液、甘油、乙醇和脂質(zhì)體中的一種或多種成分，但并不限于這些。還可以在本發(fā)明的藥物組合物中添加抗氧劑、緩沖水溶液、抑菌劑等其他普通的添加劑。另外，為了制造注射用溶液、丸藥、膠囊、顆?；蚱瑒?，可以進(jìn)一步添加稀釋劑、噴霧劑、表面活性劑、粘合劑和潤(rùn)滑劑。本發(fā)明的藥物組合物的給藥方式可以是口服給藥或胃腸外給藥(例如靜脈內(nèi)給藥、皮內(nèi)給藥、皮下給藥、肌肉內(nèi)給藥、經(jīng)鼻給藥或口服給藥)，只要能夠?qū)⒂行С煞钟行瓦_(dá)患處或其附近，也可以是上述給藥方式以外的給藥方式?？梢愿鶕?jù)對(duì)象的狀態(tài)、例如對(duì)象的重量、年齡、性別和健康狀態(tài)等、以及飯量、給藥頻率、給藥方法、排泄量和疾病的嚴(yán)重程度等確定以本發(fā)明的藥物組合物的形式給藥的本發(fā)明的siRNA的有效量。以本發(fā)明的藥物組合物的形式給藥的本發(fā)明的siRNA的有效量通常為每天0. 01 100mg/kg，優(yōu)選為每天 0. 1 10mg/kgo在又一方案中，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防癌癥的方法，其特征在于給予對(duì)象有效量的上述藥物組合物。所治療或預(yù)防的癌癥只要是表達(dá)eEF2蛋白的癌癥即可，可以是任一種癌癥，例如包括肺腺癌、非小細(xì)胞性肺癌、小細(xì)胞性肺癌、頭頸部扁平上皮癌、食道癌、 食道扁平上皮癌、胃癌、大腸癌、胰管癌、神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和惡性淋巴瘤。另外，本發(fā)明優(yōu)選對(duì)通過(guò)上述癌癥的檢測(cè)方法確定為陽(yáng)性的對(duì)象進(jìn)行給藥。在又一方案中，本發(fā)明涉及上述雙鏈siRNA在制造用于治療或預(yù)防癌癥的藥物中的應(yīng)用。需要說(shuō)明的是，在又一方案中，本發(fā)明涉及抑制癌細(xì)胞增殖的shRNA或siRNA。 shRNA (short hairpin RNA or small hairpin RNA，短發(fā)夾 RNA 或小發(fā)夾 RNA)通常是指有義鏈和反義鏈通過(guò)環(huán)狀序列連結(jié)而成的RNA，有時(shí)在細(xì)胞內(nèi)環(huán)狀結(jié)構(gòu)被切斷而形成雙鏈 siRNA。本發(fā)明的siRNA優(yōu)選為雙鏈siRNA。對(duì)本發(fā)明的shRNA或siRNA所靶向的eEF2 的區(qū)沒(méi)有特別限定，優(yōu)選的例子有以由下述DNA序列5’ -gcc tggccgagga catcgataaa ggcgagg-3' (SEQ ID NO 18) 5 5' -actcaac cataacactt gatgccgttt ctt_3，(SEQ ID NO 19)轉(zhuǎn)錄的mRNA為靶的shRNA或siRNA。本發(fā)明的shRNA可以是由包含DNA序列的載體轉(zhuǎn)錄的shRNA，所述DNA序列由上述DNA序列的有義序列-環(huán)狀序列-反義序列構(gòu)成。若由包含所述DNA序列的載體轉(zhuǎn)錄到RNA中，則來(lái)自有義序列和反義序列的RNA結(jié)合，形成短的發(fā)夾(短發(fā)夾)RNA，變得穩(wěn)定。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明中使用的環(huán)狀序列可以是任何序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)選擇。本發(fā)明的優(yōu)選的siRNA的例子有能夠與由 5'-gcc tggccgagga catcgataaa ggcgagg-3'(SEQ ID NO 18) 5 5'-actcaac cataacactt gatgccgttt ctt-3’(SEQ ID NO :19)轉(zhuǎn)錄的mRNA雜交的siRNA。本發(fā)明的更具體的siRNA的 M^W :%! 5'-gcc tggccgagga catcgataaa ggcgagg-3' (SEQ ID NO :18) 5 5'-actcaac cataacactt gatgccgttt ctt_3，(SEQ ID NO :19)轉(zhuǎn)錄的 mRNA 具有互補(bǔ)序列的 siRNA?；蛘?，本發(fā)明的siRNA可以是由與SEQ ID N0:18或SEQ ID NO 19所示的DNA序列對(duì)應(yīng)的RNA 的有義鏈和反義鏈構(gòu)成的雙鏈siRNA。此外，本發(fā)明的優(yōu)選的shRNA的例子有包含能夠與 ^ 5' -gcc tggccgagga catcgataaa ggcgagg-3' (SEQ ID NO 18) $1 mRNA 1RNA 和能夠與該RNA雜交的RNA的shRNA。并且，本發(fā)明的優(yōu)選的shRNA的例子有包含能夠與由 5'-actcaac cataacactt gatgccgttt ctt-3' (SEQ ID NO :19)轉(zhuǎn)錄的 mRNA 雜交的 RNA 和能夠與該RNA雜交的RNA的shRNA。本發(fā)明的shRNA的更具體的例子有由具有下述DNA 序列5' -gcc tggccgagga catcgatgaa agcgtgg cttcctgtca cctcgcc tttatcgatg tcctcggcca ggc-3，(SEQ ID NO :20)；
5' -actcaac cataacactt gataccattt gtt cttcctgtca aag aaacggcatc aagtgttatg gttgagt-3' (SEQ ID NO 22)；3' -egg accggctcct gtagctactt tcgcacc gaaggacagt ggagcgg aaatagctac aggagccggt ccg-5，(SEQ ID NO :21)；或3' -tgagttg gtattgtgaa ctatggtaaa caa gaaggacagt ttc tttgccgtag ttcacaatac caactca-5' (SEQ ID NO :23)的核酸轉(zhuǎn)錄的shRNA。本發(fā)明可以在上述DNA序列或RNA序列中添加、缺失、取代 1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)堿基，或者可以是與上述DNA序列或RNA序列具有90%以上、優(yōu)選95%以上、進(jìn)一步優(yōu)選95、96、97、98或99%以上的序列同源性的shRNA。需要說(shuō)明的是，同源性、 雜交條件、siRNA的長(zhǎng)度如上所述。另外，本發(fā)明可以在上述DNA序列或RNA序列中添加、 缺失、取代和/或插入1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)堿基。本發(fā)明的ShRNA或siRNA可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員中利用普通方法進(jìn)行制備。例如， 可以在體外進(jìn)行化學(xué)或酶合成、或者可以在體內(nèi)合成，并不限于這些方法。另外，本發(fā)明的 shRNA或siRNA可以以包含上述SEQ ID NO 20或SEQ ID NO 22所示的DNA序列的shRNA 表達(dá)載體或siRNA表達(dá)載體的形式制備。此時(shí)，例如可以使用tRNA-shRNA表達(dá)載體、piGENE tRNA Pur (Clontech, Palo Alto, CA)來(lái)制作。本發(fā)明的shRNA或siRNA的導(dǎo)入或給藥方法可以是使用轉(zhuǎn)染試劑的磷酸鈣法、 脂質(zhì)體法、非脂質(zhì)體法、電穿孔、磁顆粒等本領(lǐng)域技術(shù)人員中公知的方法、或插入普通siRNA 表達(dá)載體中后利用上述公知的方法將其導(dǎo)入的方法。如下所述，本發(fā)明的shRNA或siRNA 可以以藥物組合物的形式給藥。在本發(fā)明中，提供以上述shRNA或siRNA作為有效成分的、用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物可以同時(shí)含有公知的抗癌藥。本發(fā)明的藥物組合物可以含有編碼本發(fā)明的shRNA或siRNA的核酸(例如包含 SEQ ID N0:20或SEQ ID NO :22所示的DNA序列的核酸)作為有效成分。例如，包含所述的DNA序列的核酸可以是被插入到市售的shRNA表達(dá)載體或siRNA表達(dá)載體中核酸。因此， 本發(fā)明提供編碼本發(fā)明的shRNA或siRNA的核酸、以及包含該核酸的載體。本發(fā)明的藥物組合物可以含有藥學(xué)上可接受的普通載體和添加劑。本發(fā)明的藥物組合物的給藥方式可以是口服給藥或胃腸外給藥(例如靜脈內(nèi)給藥、皮內(nèi)給藥、皮下給藥、 肌肉內(nèi)給藥、經(jīng)鼻給藥或口服給藥)。以本發(fā)明的藥物組合物的形式給藥的本發(fā)明的shRNA 或siRNA的有效量可以根據(jù)對(duì)象的狀態(tài)、例如對(duì)象的重量、年齡、性別和健康狀態(tài)等、以及飯量、給藥頻率、給藥方法、排泄量和疾病的嚴(yán)重程度等來(lái)確定。在又一方案中，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防癌癥的方法，其特征在于給予對(duì)象有效量的上述藥物組合物。所治療或預(yù)防的癌癥只要是表達(dá)eEF2蛋白的癌癥即可，可以是任一種癌癥，例如包括肺腺癌、非小細(xì)胞性肺癌、小細(xì)胞性肺癌、頭頸部扁平上皮癌、食道癌、 食道扁平上皮癌、胃癌、大腸癌、胰管癌、神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和惡性淋巴瘤。在又一方案中，本發(fā)明涉及上述shRNA或siRNA在制造用于治療或預(yù)防癌癥的藥物中的應(yīng)用。在又一方案中，本發(fā)明涉及包含來(lái)自eEF2蛋白的連續(xù)的氨基酸的肽。本發(fā)明的肽的例子有包含后述的氨基酸序列的肽或由后述的氨基酸序列構(gòu)成的肽。優(yōu)選這些肽與HLA分子具有結(jié)合能力。優(yōu)選這些肽誘導(dǎo)細(xì)胞毒活性。優(yōu)選這些肽為HLA-A1402限制性 eEF2肽、HLA-A*0201限制性eEF2肽或HLA_A*0206限制性eEF2肽。優(yōu)選這些肽為9 30 個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。本發(fā)明還提供包含這些肽的、用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物；這些肽在制備用于治療或預(yù)防癌癥的藥物中的應(yīng)用；以及癌癥的治療或預(yù)防方法等，該方法的特征在于將這些肽給予對(duì)象。因此，在一個(gè)方案中，本發(fā)明提供HLA-A1402限制性eEF2肽。本發(fā)明還提供用于治療或預(yù)防HLA-Ai402陽(yáng)性對(duì)象的癌癥的HLA-A1402限制性eEF2肽、以及包含這些肽的藥物組合物。作為本發(fā)明中使用的HLA-Ai402限制性eEF2肽，可以例示具有由來(lái)自eEF2 蛋白的連續(xù)的氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列的肽或含有由來(lái)自eEF2蛋白的連續(xù)的氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列的肽，上述氨基酸序列選自=Arg Phe Tyr Ala Phe Gly Arg Val Phe (SEQ ID NO 4) ；Ala Phe Gly Arg Val Phe Ser Gly Leu(SEQ ID NO 5) ；Arg Phe Asp Val His Asp Val Thr Leu (SEQ ID NO :6) ；Ala Tyr Leu Pro Val Asn Glu Ser Phe (SEQ ID NO :7)；以及在上述中的1個(gè)氨基酸序列中，取代、缺失或添加多個(gè)、例如1 9個(gè)、優(yōu)選1 5個(gè)、1 4個(gè)、1 3個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選1 2個(gè)、更優(yōu)選1個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列，但并不限于這些肽。還可以包含上述氨基酸序列選自在上述中的1個(gè)氨基酸序列中取代、缺失、添加和/或插入多個(gè)、例如1 9個(gè)、優(yōu)選1 5個(gè)、1 4個(gè)、1 3個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選1 2個(gè)、 更優(yōu)選1個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列的肽。取代上述肽的氨基酸時(shí)，優(yōu)選的取代位點(diǎn)有 2位和/或9位的氨基酸。上述肽的2位的氨基酸的優(yōu)選例子有Phe或Tyr。上述肽的9 位的氨基酸的優(yōu)選例子有Ile、Leu或I^he。這樣的修飾型肽的具體例子有表12或表13 所記載的肽。本發(fā)明中優(yōu)選的eEF2肽為Ala Tyr Leu Pro Val Asn Glu Ser Phe (SEQ ID NO :7)。但即使是上述的任一種肽，也是以保持與HLA-A1402分子的結(jié)合能力為條件。在本說(shuō)明書(shū)中，將保持與HLA-A1402的結(jié)合能力的肽稱(chēng)作HLA-A1402限制性eEF2肽。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明的上述肽可用于HLA-Ai402陽(yáng)性對(duì)象以外的對(duì)象。因此，本發(fā)明提供包含上述任一個(gè)氨基酸序列的肽、以及包含該肽的藥物組合物。在又一方案中，本發(fā)明提供HLA_A*0201限制性eEF2肽。本發(fā)明還提供用于治療或預(yù)防HLA-A*0201陽(yáng)性對(duì)象的癌癥的、包含HLA-A*0201限制性eEF2肽的藥物組合物。本發(fā)明中使用的HLA-A*0201限制性eEF2肽是具有由來(lái)自eEF2蛋白的連續(xù)的氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列的肽或含有由來(lái)自eEF2蛋白的連續(xù)的氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列的肽。下述表1 7中例示本發(fā)明中使用的HLA-A*0201限制性eEF2肽的候選。其中，作為本發(fā)明中優(yōu)選的肽，例示上述氨基酸序列選自下述序列的肽Arg Leu Met Glu Pro lie Tyr Leu Val (SEQ ID NO 8) ；Lys Leu Val Glu Gly Leu Lys Arg Leu(SEQ ID NO :9) ；Tyr Leu Asn Glu lie Lys Asp Ser Val(SEQ ID NO :10) ；lie Leu Thr Asp lie Thr Lys Gly Val(SEQ ID NO: 11) ；Leu Met Met Tyr lie Ser Lys Met Val (SEQ ID NO :12) ；Lys Leu Pro Arg Thr Phe Cys Gln Leu (SEQ ID NO :13) ；Leu lie Leu Asp Pro lie Phe Lys Val (SEQ ID NO :14)； 以及上述中的1個(gè)氨基酸序列中，取代、缺失或添加多個(gè)、例如1 9個(gè)、優(yōu)選1 5個(gè)、1 4個(gè)、1 3個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選1 2個(gè)、更優(yōu)選1個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列，但并不限于這些肽。還可以包含上述氨基酸序列選自在上述中的1個(gè)氨基酸序列中取代、缺失、添加和/或插入多個(gè)、例如1 9個(gè)、優(yōu)選1 5個(gè)、1 4個(gè)、1 3個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選1 2個(gè)、 更優(yōu)選1個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列的肽。其中，特別優(yōu)選的HLA-A*0201限制性eEF2肽為 Arg Leu Met Glu Pro lie Tyr Leu Val(SEQ ID NO :8)或 lie Leu Thr Asp lie Thr Lys Gly Val (SEQ ID NO :11)。本發(fā)明的HLA_A*0201限制性eEF2肽特別可以是將第2位的氨基酸和/或第9位的氨基酸取代成其他氨基酸的肽。上述肽的2位的氨基酸的優(yōu)選例子有Leu或Met。上述肽的9位的氨基酸的優(yōu)選例子有Leu或Val。這樣的修飾型肽的例子有表15 21中記載的肽，優(yōu)選列舉在Leu lie Leu Asp Pro lie Phe Lys Val (SEQ ID NO 14)中將第2位的氨基酸Ile取代成Leu或Met、和/或?qū)⒌?位的氨基酸Val取代成 Leu 的肽。特別優(yōu)選的例子有Leu Leu Leu Asp Pro lie Phe Lys Val (SEQ ID NO :15)、 Leu Met Leu Asp Pro lie Phe Lys Val (SEQ ID NO :16)或 Leu Leu Leu Asp Pro lie Phe Lys Leu(SEQ ID NO :17)、Leu Met Leu Asp Pro lie Phe Lys Leu(SEQ ID NO :24)。 但即使是上述的任一種肽，也是以保持與HLA-A*0201分子的結(jié)合能力為條件。在本說(shuō)明書(shū)中，將保持與HLA-A*0201的結(jié)合能力的肽稱(chēng)作HLA-A*0201限制性eEF2肽。另外，本發(fā)明的 HLA-A*0201限制性eEF2肽可以具有使干擾素、活性升高的作用。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明的上述肽可用于HLA-A*0201陽(yáng)性對(duì)象以外的對(duì)象。因此，本發(fā)明提供包含上述任一個(gè)氨基酸序列的肽、以及包含該肽的藥物組合物。在又一方案中，本發(fā)明提供HLA_A*0206限制性eEF2肽。本發(fā)明還提供用于治療或預(yù)防HLA-A*0206陽(yáng)性對(duì)象的癌癥的、包含HLA_A*0206限制性eEF2肽的藥物組合物。本發(fā)明中使用的HLA-A*0206限制性eEF2肽是具有由來(lái)自eEF2蛋白的連續(xù)的氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列的肽或含有由來(lái)自eEF2蛋白的連續(xù)的氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列的肽。在本發(fā)明所使用的HLA-A*0206限制性eEF2肽中，作為優(yōu)選的肽，可以例示上述氨基酸序列為Arg Leu Met Glu Pro lie Tyr Leu Val (SEQ ID NO :8) ；Lys Leu Val Glu Gly Leu Lys Arg Leu(SEQ ID NO :9) ；Tyr Leu Ash Glu lie Lys Asp Ser Val (SEQ ID NO :10) ；lie Leu Thr Asp lie Thr Lys Gly Val (SEQ ID NO :11) ；Leu Met Met Tyr lie Ser Lys Met Val (SEQ ID NO 12) ；Lys Leu Pro Arg Thr Phe Cys Gln Leu(SEQ ID NO :13) ；Leu lie Leu Asp Pro lie Phe Lys Val (SEQ ID NO :14)的肽；以及上述氨基酸序列選自在上述中的1個(gè)氨基酸序列中取代、缺失和/或添加多個(gè)、例如1 9個(gè)、優(yōu)選1 5個(gè)、1 4個(gè)、1 3個(gè)、 進(jìn)一步優(yōu)選1 2個(gè)、更優(yōu)選1個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列的肽，但并不限于這些肽。還可以包含上述氨基酸序列選自在上述中的1個(gè)氨基酸序列中取代、缺失、添加和/或插入多個(gè)、例如1 9個(gè)、優(yōu)選1 5個(gè)、1 4個(gè)、1 3個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選1 2個(gè)、更優(yōu)選1個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列的肽。但即使是上述的任一種肽，也是以保持與HLA-A*0206分子的結(jié)合能力為條件。在本說(shuō)明書(shū)中，將保持與HLA-A*0206的結(jié)合能力的肽稱(chēng)作HLA_A*0206 限制性eEF2肽。另外，本發(fā)明的HLA-A*0206限制性eEF2肽可以具有使干擾素γ活性升高的作用。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明的上述肽可用于HLA-A*0206陽(yáng)性對(duì)象以外的對(duì)象。因此， 本發(fā)明提供包含上述任一種氨基酸序列的肽、以及包含該肽的藥物組合物。[表1]
權(quán)利要求
1.檢測(cè)對(duì)象的癌癥的方法，該方法包括測(cè)定在由該對(duì)象得到的試樣中eEF2多肽、 eEF2抗體或eEF2基因的轉(zhuǎn)錄物的存在或量的步驟。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中，上述癌癥選自肺腺癌、非小細(xì)胞性肺癌、小細(xì)胞性肺癌、頭頸部扁平上皮癌、食道癌、食道扁平上皮癌、胃癌、大腸癌、胰管癌、神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和惡性淋巴瘤。
3.雙鏈siRNA，該雙鏈siRNA抑制癌細(xì)胞的增殖，其中，有義鏈由SEQID NO :2所示的 RNA序列構(gòu)成，反義鏈由SEQ ID NO 3所示的RNA序列構(gòu)成。
4.權(quán)利要求3所述的雙鏈siRNA，其中，上述癌細(xì)胞來(lái)自選自胃癌、肺癌、胰癌、神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和惡性淋巴瘤的癌。
5.藥物組合物，其用于治療或預(yù)防癌癥，該藥物組合物含有權(quán)利要求3或4所述的雙鏈 siRNA作為有效成分。
6.用于治療或預(yù)防癌癥的方法，其特征在于給予對(duì)象有效量的權(quán)利要求5所述的藥物組合物。
7.權(quán)利要求3或4所述的雙鏈siRNA在制造用于治療或預(yù)防癌癥的藥物中的應(yīng)用。
8.shRNA，該shRNA抑制癌細(xì)胞的增殖，并以由SEQ ID N0:18或SEQ ID N0:19所示的 DNA序列轉(zhuǎn)錄的mRNA為靶。
9.核酸，該核酸是權(quán)利要求8所述的shRNA所轉(zhuǎn)錄的核酸，其具有SEQID N0:20或SEQ ID NO 22所示的DNA序列。
10.載體，該載體包含權(quán)利要求9所述的核酸。
11.藥物組合物，其用于治療或預(yù)防癌癥，該藥物組合物含有權(quán)利要求8所述的shRNA、 權(quán)利要求9所述的核酸或權(quán)利要求10所述的載體。
12.用于治療或預(yù)防癌癥的方法，其特征在于給予對(duì)象有效量的權(quán)利要求11所述的藥物組合物。
13.權(quán)利要求8所述的shRNA、權(quán)利要求9所述的核酸或權(quán)利要求10所述的載體在制造用于治療或預(yù)防癌癥的藥物中的應(yīng)用。
14.藥物組合物，其用于治療或預(yù)防HLA-A1402陽(yáng)性對(duì)象的癌癥，該藥物組合物中包含 eEF2肽，所述eEF2肽具有由來(lái)自eEF2蛋白的連續(xù)的氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列，上述氨基酸序列選自下述(a) (e)(a)ArgPhe Tyr Ala Phe Gly Arg Val Phe 即 SEQ ID NO 4 ；(b)AlaPhe Gly Arg Val Phe Ser Gly Leu 艮口 SEQ ID NO 5 ；(c)ArgPhe Asp Val His Asp Val Thr Leu 艮口 SEQ ID NO 6 ；(d)AlaTyr Leu Pro Val Asn Glu Ser Phe 即 SEQ ID NO 7 ；以及(e)在(a) (d)所示的氨基酸序列中，取代、缺失或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列。
15.權(quán)利要求14所述的藥物組合物，其中，氨基酸序列為AlaTyr Leu Pro Val Asn Glu Ser Phe 艮口 SEQ ID NO :7。
16.藥物組合物，其用于治療或預(yù)防對(duì)象的癌癥，該藥物組合物中含有編碼權(quán)利要求 14所述的肽的多核苷酸。
17.權(quán)利要求14 16中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中，上述癌癥選自肺腺癌、小細(xì)胞性肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、胰管癌、惡性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、惡性淋巴瘤和頭頸部扁平上皮癌。
18.用于治療或預(yù)防癌癥的方法，其特征在于對(duì)HLA-A1402陽(yáng)性對(duì)象給予有效量的權(quán)利要求14 17中任一項(xiàng)所述的藥物組合物。
19.權(quán)利要求14所述的肽在制造用于治療或預(yù)防癌癥的藥物中的應(yīng)用。
20.藥物組合物，其用于治療或預(yù)防HLA-A*0201陽(yáng)性對(duì)象的癌癥，該藥物組合物中包含 eEF2肽，所述eEF2肽具有由來(lái)自eEF2蛋白的連續(xù)的氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列，上述氨基酸序列選自下述(a) (h)(a)Arg Leu Met Glu Pro lie Tyr Leu Val 艮口 SEQIDNO8 ；(b)Lys Leu Val Glu Gly Leu Lys Arg Leu 即 SEQIDNO9 ；(c)Tyr Leu Asn Glu lie Lys Asp Ser Val 即 SEQIDNO10 ；(d)Ile Leu Thr Asp lie Thr Lys Gly Val 即 SEQIDNO11 ；(e)Leu Met Met Tyr lie Ser Lys Met Val 即 SEQIDNO12 ；(f)Lys Leu Pro Arg Thr Phe Cys Gln Leu 即 SEQIDNO13 ；(g)Leu lie Leu Asp Pro lie Phe Lys Val 艮口 SEQIDNO:14;以及(h)在(a) (g)所示的氨基酸序列中，取代、缺失或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列。
21.權(quán)利要求20所述的藥物組合物，其中，氨基酸序列為ArgLeu Met Glu Pro lie Tyr Leu Val 即 SEQ ID NO :8 或 lie Leu Thr Asp lie Thr Lys Gly Val 即 SEQ ID NO 11。
22.權(quán)利要求20所述的藥物組合物，其中，氨基酸序列為在Leulie Leu Asp Pro Ile Phe Lys Val即SEQ ID NO 14中將第2位氨基酸Ile取代成Leu或Met、和/或?qū)⒌?位氨基酸Val取代成Leu而得到的氨基酸序列。
23.藥物組合物，其用于治療或預(yù)防對(duì)象的癌癥，該藥物組合物包含編碼權(quán)利要求20 所述的肽的多核苷酸。
24.權(quán)利要求20 23中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中，上述癌癥選自肺腺癌、小細(xì)胞性肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、胰管癌、惡性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、惡性淋巴瘤和頭頸部扁平上皮癌。
25.用于治療或預(yù)防癌癥的方法，其特征在于給予對(duì)象有效量的權(quán)利要求20 M中任一項(xiàng)所述的藥物組合物。
26.權(quán)利要求20所述的肽在制造用于治療或預(yù)防癌癥的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供使用在多種癌癥中表達(dá)的蛋白來(lái)檢測(cè)癌癥的方法、以及用于治療或預(yù)防以該蛋白為靶的癌癥的藥物組合物。本發(fā)明還提供包含來(lái)自該蛋白的癌抗原肽的藥物組合物。詳細(xì)而言，該方法包括測(cè)定在由對(duì)象得到的試樣中eEF2多肽或eEF2抗體的存在或量的步驟。
文檔編號(hào)A61P43/00GK102348796SQ201080011749
公開(kāi)日2012年2月8日 申請(qǐng)日期2010年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月8日
發(fā)明者尾路祐介, 杉山治夫 申請(qǐng)人:株式會(huì)社癌免疫研究所