專利名稱：一種癌胚抗原單抗及包含該抗體的芯片以及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種癌胚抗原單抗及包含該抗體的芯片以及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
癌胚抗原(CEA)是一種酸性蛋白，最初發(fā)現(xiàn)于結(jié)腸癌和胎兒腸組織中，故名癌胚抗原。癌旁正常粘膜CEA含量很少或為陰性。胃癌的CEA陽性率85. 58%。其中粘液腺癌及印戒細(xì)胞癌(粘液細(xì)胞癌)為100%。電鏡下見CEA同時分布于癌細(xì)胞膜，及癌細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白合成及轉(zhuǎn)運的細(xì)胞器(如核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基器及其分泌小泡)中。CEA升高常見于大腸癌、胰腺癌、胃癌、小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、甲狀腺髓樣癌等。但吸煙、妊娠期和心血管疾病、糖尿病、非特異性結(jié)腸炎等疾病，15% 53%的病人血清CEA也會升高，所以CEA不是惡性 腫瘤的特異性標(biāo)志，在診斷上只有輔助價值。此外，血清CEA水平與大腸癌的分期有明確關(guān)系，越晚期的病變，CEA濃度越高。除原發(fā)性結(jié)腸癌以外，腺胰癌、膽管癌、胃癌。食道癌、腺癌、肺癌、乳腺癌和泌尿系統(tǒng)的腫瘤陽性率也很高，一般在50 - 70%。良性腫瘤、炎癥和退行性疾病，如結(jié)腸息肉、潰瘍性結(jié)腸炎、胰腺炎和酒精性肝硬化變病人CEA也有部分升高，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于惡性腫瘤，一般小于20 μ g/L，CEA超過20ng/ml時往往提示有消化道腫瘤。所以測定CEA可以作為良性與惡性腫瘤的鑒別診斷依據(jù)。本項目主要應(yīng)用與在食管癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胃轉(zhuǎn)移癌等惡性腫瘤相關(guān)蛋白領(lǐng)域創(chuàng)立抗體芯片檢測技術(shù)平臺，自主研發(fā)48種惡性腫瘤標(biāo)志物抗體芯片檢測試劑盒(抗體芯片)完全是由中國人自主開發(fā)，應(yīng)用這一芯片，可通過多種方式、多種渠道、多層面檢測惡性腫瘤標(biāo)志物的效價和含量，將檢測靈敏度由Ug提高到ng級，從而達(dá)到更準(zhǔn)確、更全面的效果，其檢測結(jié)果可指導(dǎo)臨床治療。48種惡性腫瘤標(biāo)志物抗體芯片檢測試劑盒(抗體芯片)對促進(jìn)我國生物高技術(shù)前沿領(lǐng)域的發(fā)展具有重大鼓舞作用，對提升我國生物芯片技術(shù)、產(chǎn)品和市場的國際競爭力具有重大意義，此方法完全符合分子免疫學(xué)原理。目前國外幾乎所有的主要制藥公司都不同程度地采用了生物芯片技術(shù)來尋找藥物靶標(biāo)，查檢藥物的毒性或副作用及進(jìn)行藥物產(chǎn)品的定量和定性。用芯片技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模的藥物篩選可以省略大量的動物試驗，縮短藥物篩選所用時間，從而帶動創(chuàng)新藥物的研究和開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種癌胚抗原單抗及包含該抗體的芯片以及應(yīng)用。本發(fā)明的整體技術(shù)構(gòu)思是利用自主設(shè)計合成的癌胚抗原(CEA)多肽(序列為TQQAT PGPAYSGREI)經(jīng)免疫動物、細(xì)胞融合、亞克隆及酶聯(lián)免疫吸附實驗進(jìn)行特異性篩選技術(shù)，獲得高效價、高特異性抗人癌胚抗原單克隆抗體，由于此單抗效價高、特異性好，與另外47種與腫瘤相關(guān)的單克隆抗體點制的抗體芯片，結(jié)合CY3標(biāo)記的補體C3抗體與被檢產(chǎn)品建立了完整的檢測系統(tǒng)，用于檢測48種惡性腫瘤標(biāo)志物蛋白質(zhì)含量。此抗體芯片具有靈敏度高，特異性好、操作簡單、高通量等優(yōu)點，可用于臨床和體檢血清的監(jiān)測和質(zhì)控。
一種癌胚抗原的單克隆抗體，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示，其輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示；或其重鏈可變區(qū)由SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失、或添加一個或幾個氨基酸衍生的與SEQ ID NO. I的氨基酸序列至少有95%的一致性，輕鏈可變區(qū)由SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失、或添加一個或幾個氨基酸衍生的與SEQ ID NO. 2的氨基酸序列至少有95%的一致性且所述單克隆抗體具有特異性結(jié)合癌胚抗原的特性。作為優(yōu)選，所述單克隆抗體包括單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體、以及上述抗體的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗體片段和含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽。本發(fā)明所述“抗體”應(yīng)該解釋為涵蓋具有所需特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任意特異性結(jié)合因子。因而，這個術(shù)語涵蓋了與之同源的抗體片段、衍生物、人源化抗體以及抗體的功能等同物和同源物，也包括含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽，無論是天然的還是合成產(chǎn)生的?？贵w的實例是免疫球蛋白亞型(如IgG，IgE, IgM, IgD和IgA)及其亞型亞類；也可以 是包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd ;和雙鏈抗體(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合體分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗體的克隆與表達(dá)在EP. A-0120694和EP. A. 0125023中描述。本發(fā)明所述單克隆抗體可以是，例如，單價的或是單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體、以及上述抗體的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗體片段和含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽?？贵w可以通過許多方式修飾，可用DNA重組技術(shù)來產(chǎn)生保留原來抗體特異性的其它抗體或嵌合分子。這種技術(shù)可以包括將編碼抗體的免疫球蛋白可變區(qū)或互補性決定區(qū)(⑶Rs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加框架區(qū)。參見，EP. A. 184187,GB2188638A或.EP. A. 239400。還可以對雜交瘤細(xì)胞或產(chǎn)生抗體的其它細(xì)胞進(jìn)行遺傳突變或其它改變，這可以改變或者不改變所產(chǎn)生抗體的結(jié)合特異性。用于本發(fā)明的單克隆抗體也可用雜交瘤方法制得，因為編碼本發(fā)明人源化抗體的DNA序列可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)手段，如根據(jù)本發(fā)明公開的氨基酸序列人工合成或用PCR法擴增得到，因而也可用重組DNA方法，可用本領(lǐng)域熟知的各種方法將該序列連入合適的表達(dá)載體中。最后，在適合本發(fā)明抗體表達(dá)的條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化所得的宿主細(xì)胞，然后本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)用熟知的常規(guī)分離純化手段純化得到本發(fā)明的單克隆抗體。如上所述，本發(fā)明還提供了用于實施本發(fā)明抗體的試劑、試劑盒或芯片。試劑、試劑盒或芯片至少包括如下一種或多種根據(jù)以上方法制成的抗體，編碼該抗體的核苷酸，或包含該抗體的真核細(xì)胞、原核細(xì)胞和病毒以及任選的緩沖溶液。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述的抗體芯片，還包含特異性結(jié)合以下抗原的抗體CK18、CK19、Cyclin-DU CD34、ER、PR、P53、Calcitonin、PSA、P63、CEA, S-100、Vimentin、AR、C-erbB-2、PCNA、Ki-67、HSP70、ΑΕΙ、AE3、P504S、CK34BE、CA 153、CA 125、CA 199、ECG2、IMPU Ras, CSK, Erbb2、p90、pl6、Calnuc、CyclinE、CDK2、CIAP、RalA、p62、CyclinBl、Koc、CK20、EMAλ CA72-4、E-Cadherin、C-KIT、Cathepsin、MDM2、Hepatocyte。本發(fā)明還提供包含所述抗體芯片的試劑盒，還包含信標(biāo)分子標(biāo)記的C3補體抗體，所述信標(biāo)分子優(yōu)選為CY3。
在具體實施方式
中，本發(fā)明還提供癌胚抗原抗體的制備方法，包括如下工藝步驟(I)細(xì)胞融合將自主設(shè)計合成的癌胚抗原多肽(序列為TQQAT PGPAYSGREI)免疫動物取其致敏的脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞懸液按10-100 1比例混合，加入聚乙二醇(美國Sigma公司出品)使細(xì)胞彼此融合，在兩種細(xì)胞的混合細(xì)胞懸液中滴加培養(yǎng)液，以HAT選擇性培養(yǎng)基(美國?？寺」境銎?進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；(2)篩選雜交瘤細(xì)胞待融合的細(xì)胞培養(yǎng)至第5-10天時，吸取96孔培養(yǎng)板的孔中出現(xiàn)克隆細(xì)胞簇的培養(yǎng)上清用酶聯(lián)免疫吸附實驗方法檢測抗體含量，經(jīng)有限稀釋進(jìn)行三次亞克隆篩選，依抗體的分泌情況篩選出高效價的抗體分泌孔，將孔中細(xì)胞擴大培養(yǎng)，然后進(jìn)行抗原特異性免疫組織化學(xué)原位測定，選高效價，高特異性的細(xì)胞株再擴大培養(yǎng)并凍存； (3)單克隆抗體特異性篩選選經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測抗體效價大于I :10000的陽性孔的上清，分別與48種惡性腫瘤標(biāo)志物抗原進(jìn)行特異性和效價篩選。(4)單克隆抗體純化保存將特異性好和效價高的克隆孔培養(yǎng)液吸出，使用AKTA-FPLC蛋白純化儀(美國通用公司制造)將IgG單克隆抗體培養(yǎng)上清溶液在A280nm時收集，I. 44 (吸光單位)濃度為l-10mg/ml。(5) CY3標(biāo)記抗體用CY3熒光素標(biāo)記補體C3抗體。(6)單克隆抗體微陣列點樣一張芯片點96個點，與另47種與腫瘤相關(guān)的單克隆抗體經(jīng)有限稀釋點于芯片上，每一種單抗兩個點，每一個點的含量O. 01-lng/ml。本發(fā)明的具體工藝步驟和各步驟中的工藝參數(shù)是步驟(I)中具有高活性的Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的比值按1:10-100的比例混合，加入PEG使細(xì)胞彼此融合，在兩種細(xì)胞的混合細(xì)胞懸液中，第I分鐘滴加4. 5ml培養(yǎng)液；間隔2分鐘滴加5ml培養(yǎng)液，然后加培養(yǎng)液50ml，以HAT選擇培養(yǎng)基按36%的孔為I個細(xì)胞/孔進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。步驟(2)中是將細(xì)胞培養(yǎng)至覆蓋0% 20%孔底時，吸取培養(yǎng)上清用酶聯(lián)免疫吸附實驗方法檢測抗體含量，依抗體的分泌情況篩選出高效價的抗體分泌孔，將孔中細(xì)胞再行克隆化，選高分泌特異性細(xì)胞株擴大培養(yǎng)或凍存。步驟(3)中采用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測抗體效價大于I :10000的陽性孔的上清，分別與48種惡性腫瘤標(biāo)志物抗原進(jìn)行特異性和效價篩選。步驟(4)中將特異性好和效價高的克隆孔培養(yǎng)液吸出，使用AKTA-FPLC蛋白純化儀(美國通用公司制造)將IgG單克隆抗體培養(yǎng)上清溶液在A280nm時收集，I. 44(吸光單位)濃度為 l-10mg/ml。步驟(5)中選用的是CY3對補體C3抗體的標(biāo)記步驟(6)中采用48種惡性腫瘤標(biāo)志物單克隆抗體微陣列點樣一張芯片點96個點，每一種單抗兩個點，每一個點的含量O. 01-lng/ml ο本發(fā)明所取得技術(shù)進(jìn)步在于所獲得的抗人癌胚抗原單克隆抗體分別經(jīng)AKTA蛋白純化儀FPLC純化，其效價高、特異性非常好，與另47種與腫瘤相關(guān)的單克隆抗體經(jīng)有限稀釋點于芯片上，與標(biāo)記的補體C3抗體和檢測樣本進(jìn)行雜交，借助目前先進(jìn)的芯片檢測儀器進(jìn)行檢測。此技術(shù)與傳統(tǒng)的檢測方法比較，具有快速、操作便捷、高通量檢測的特點；并可快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行定性檢測。
本發(fā)明所公開的方法是將自主設(shè)計合成的癌胚抗原多肽經(jīng)細(xì)胞融合、克隆化培養(yǎng)、以及大量的組織細(xì)胞原位特異性篩選從而獲得高效價、高特異性的抗人癌胚抗原單克隆抗體，此抗體與47種與腫瘤相關(guān)的單克隆抗體制成的抗體芯片可直接應(yīng)用于臨床檢測和基礎(chǔ)研究。單克隆抗體在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中具有極大的應(yīng)用價值，是親和層析中重要的配體，是免疫組化中主要的抗體，是免疫檢驗中的新型試劑，是生物治療的導(dǎo)向武器。作為惡性腫瘤標(biāo)志物的檢測試劑，抗人惡性腫瘤標(biāo)志物單克隆抗體可以充分發(fā)揮其優(yōu)勢。單克隆抗體其特異性強，可將抗原抗體反應(yīng)的特異性大大提高，減少了可能的交叉反應(yīng)，使試驗結(jié)果可信度更大。單克隆抗體的均一性和生物活性單一性使抗原抗體反應(yīng)結(jié)果便于質(zhì)量控制，利于標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。
具體實施方式
本發(fā)明公開了一種癌胚抗原單抗及包含該抗體的芯片以及應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。在進(jìn)一步闡述本發(fā)明之前，我們有必要認(rèn)識到，本發(fā)明并不局限于描述的特定的實施方案，也就是說，在具體形式上可能存在著變化。還有一點需要提醒的是，由于本發(fā)明的范圍受附加的權(quán)利要求書的限制，因此，本文使用的術(shù)語只是為了描述特定實施方案的目的，而不是為了限制本發(fā)明的目的。術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”在本文中可以互換使用。這些術(shù)語均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的術(shù)語，具體是指由能特異結(jié)合抗原的一種或多種多肽構(gòu)成的蛋白質(zhì)。抗體的一種形式構(gòu)成了抗體的基本結(jié)構(gòu)單元。這種形式是四聚物，它由兩對完全相同的抗體鏈構(gòu)成，每一對都有一個輕鏈和一個重鏈。在每對抗體鏈中，輕鏈和重鏈的可變區(qū)聯(lián)合在一起共同負(fù)責(zé)結(jié)合抗原，而恒定區(qū)則負(fù)責(zé)抗體的效應(yīng)器功能。目前已知的免疫球蛋白多肽包括K和λ輕鏈，以及α，Y(IgG1, IgG2, IgG3,IgG4), δ，ε和μ重鏈或它們的其它類型等價物。全長的免疫球蛋白“輕鏈”(大約25kDa或大約214個氨基酸)包含一個由NH2-末端上大約110個氨基酸形成的可變區(qū)，以及一個COOH-末端上的K或λ恒定區(qū)。全長的免疫球蛋白“重鏈”(大約50kDa或大約446個氨基酸)，同樣包含一個可變區(qū)(大約116個氨基酸)，以及重鏈恒定區(qū)之一，例如Y (大約330個氨基酸)。術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”包括任何同型體的抗體或免疫球蛋白，或保持與抗原特異結(jié)合的抗體片段，包括但不限于Fab，F(xiàn)v, scFv和Fd片段、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體以及包含抗體的抗原結(jié)合部分和非抗體蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)?？贵w可以被標(biāo)記和檢測，例如，可以通過放射性同位素、能產(chǎn)生可檢測物的酶、熒光蛋白質(zhì)、生物素等等進(jìn)行標(biāo)記并被檢測?？贵w還可以結(jié)合于固相載體，包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等等。該術(shù)語還包括Fab’、Fv、F(ab’)2和/或其它能與抗原特異性結(jié)合的抗體片段和單克隆抗體?？贵w還可以以多種形式存在，例如包括Fv、Fab和(Fab' )2，以及雙功能雜合抗體(例如文獻(xiàn)，Lanzavecchia等，Eur. J. Immunol. , 1987 ；17,105)以及以單鏈形式(例如，Huston 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，1988 ；85, 5879 和 Bird 等，Science, 1988 ；242,423，在此引用作為參考)存在。免疫球蛋白的重鏈或輕鏈可變區(qū)由三個超變區(qū)(也稱為“互補決定區(qū)”或⑶R)組成，這些超變區(qū)被框架區(qū)(FR)間隔?？蚣軈^(qū)和互補決定區(qū)的范圍已被精石角定義(參見"Sequences of Proteins of Immunological Interest, " E. Kabat 等，U. S. Department of Health and Human Services, 1991)。此處所討論的所有抗體氨基酸序列的排序都參照Kabat系統(tǒng)。同一物種不同的輕鏈和重鏈框架區(qū)序列相對保守?？贵w的框架區(qū)用于定位和校準(zhǔn)CDR。CDR主要負(fù)責(zé)結(jié)合抗原的表位。嵌合抗體是其重鏈和輕鏈基因經(jīng)過構(gòu)建的抗體，特別是利用基因工程改造的屬于不同物種的抗體可變區(qū)和恒定區(qū)基因。例如，可以將鼠單克隆抗體基因的可變區(qū)片段連接到人抗體恒定區(qū)片段如Y I和Y3。例如治療用嵌合抗體是一種嵌合蛋白質(zhì)，它由來源于兔抗體可變區(qū)片段或抗原結(jié)合區(qū)片段和人抗體恒定區(qū)或效應(yīng)區(qū)結(jié)合(如由A. T. C. C.保藏登記號CRL 9688的細(xì)胞制備的抗Tac嵌合抗體)，當(dāng)然，嵌合抗體的基因來源也可以使用其它哺乳動物物種?？梢岳斫獗景l(fā)明設(shè)計和生產(chǎn)的人源化抗體可能會替代某些保守性氨基酸，這些氨 基酸對抗原結(jié)合或抗體其他功能基本上沒有影響。換而言之，gly和ala ;val、ile和Ieu ；asp和glu ；asn和gin ；ser和thr ；lys和arg ；phe和tyr,以上各組合內(nèi)部的氨基酸可相互取代?？贵w重鏈或輕鏈的“可變區(qū)”是該鏈的N端成熟區(qū)域。所有區(qū)域、CDR和殘基編號均以序列比對、按已有的結(jié)構(gòu)知識為基礎(chǔ)進(jìn)行定義。框架區(qū)和CDR殘基的鑒定和編號按 Chothia 和他人所述(Chothia, Structural determinants in the sequences ofimmunoglobulin variable domain. J Mol Biol. 1998 ;278,457)。VH是抗體重鏈的可變區(qū)。VL是抗體輕鏈的可變區(qū)，它可能具有K和λ同種型。K-I抗體具有K -I同種型而Κ-2抗體具有K -2同種型，V λ是可變的λ輕鏈?！跋鄳?yīng)的氨基酸”，是指當(dāng)兩個或多個氨基酸序列比對時，位于相同位置(也就是它們彼此對應(yīng))的氨基酸殘基。抗體序列比對和編號的方法在Chothia，見上，Kabat，見上和其他中得到詳盡闡述。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知(參見如Kabat 1991 Sequences of Proteinsof Immunological Interest, DHHS, Washington, DC),有時可以在抗體的一個或兩個氨基酸中制造一個、兩個或三個缺口和/或插入1、2、3或4個殘基或者至多約15個殘基(特別是在L3和H3⑶R中)，從而完成一次比對?！翱扇〈恢谩保傅氖强贵w的一個特殊位置，其可以被不同的氨基酸取代而不會使抗體的結(jié)合活性顯著降低。鑒定可取代位置的方法和它們可以被如何取代在下面將進(jìn)行更加詳細(xì)的描述?？扇〈恢靡部梢苑Q為“變異耐受位置”。為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實施例I :本發(fā)明所述單克隆抗體的制備抗體的制備方法，包括如下工藝步驟(I)細(xì)胞融合將具有較高活性Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞分別與自主設(shè)計合成的癌胚抗原多肽(序列為TQQAT PGPAYSGREI)致敏的脾細(xì)胞懸液按I :10-100比例混合，加入聚乙二醇(美國Sigma公司出品)使細(xì)胞彼此融合，在兩種細(xì)胞的混合細(xì)胞懸液中滴加培養(yǎng)液，以HAT選擇性培養(yǎng)基(美國海克隆公司出品)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；(2)篩選雜交瘤細(xì)胞待融合的細(xì)胞培養(yǎng)至第5-10天時，吸取96孔培養(yǎng)板的孔中出現(xiàn)克隆細(xì)胞簇的培養(yǎng)上清用酶聯(lián)免疫吸附實驗方法檢測抗體含量，經(jīng)有限稀釋進(jìn)行三次亞克隆篩選，依抗體的分泌情況篩選出高效價的抗體分泌孔，將孔中細(xì)胞擴大培養(yǎng)，然后進(jìn)行抗原特異性免疫組織化學(xué)原位測定，選高效價，高特異性的細(xì)胞株再擴大培養(yǎng)并凍存；(3)單克隆抗體特異性篩選選經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測抗體效價大于I :10000的陽性孔的上清，分別與48種惡性腫瘤標(biāo)志物抗原進(jìn)行特異性和效價篩選。(4)單克隆抗體純化保存將特異性好和效價高的克隆孔培養(yǎng)液吸出，使用AKTA-FPLC蛋白純化儀(美國通用公司制造)將IgG單克隆抗體培養(yǎng)上清溶液在A280nm時收集，I. 44 (吸光單位)濃度為l-10mg/ml。(5) CY3標(biāo)記抗體用CY3熒光素標(biāo)記補體C3抗體。
(6)48種惡性腫瘤標(biāo)志物單克隆抗體微陣列點樣一張芯片點96個點，每一種單抗兩個點，每一個點的含量O. 01-lng/ml。步驟(I)進(jìn)行完畢后采用酶聯(lián)免疫吸附實驗方法測定抗血清，該方法由如下操作步驟組成a、包被以50mmol/L、pH=9的碳酸鹽緩沖液將步驟(I)中的癌胚抗原合成肽包被96孔聚乙烯板，4微克/孔，真空抽干，密封4°C保存?zhèn)溆?。b、封閉每孔加入pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液200 μ I洗滌、內(nèi)含1%山羊血清；C、加樣每孔加入細(xì)胞融合后7天的細(xì)胞培養(yǎng)上清液50-100 μ I (1:5000-10000稀釋)，每板設(shè)一正常對照、陽性對照及空白(磷酸鹽緩沖液)，洗滌；d、加入酶標(biāo)二抗每孔100-200 μ 1，洗滌；e、顯色每孔加入底物50-100 μ I ；f、比色以空白調(diào)零，405nm波長測定光密度(0.D)；g、結(jié)果判斷:P/N=測定標(biāo)本O. D均值/陰性血清O. D均值，P/N彡2. I為陽性。步驟(2)待融合的細(xì)胞培養(yǎng)至第5-10天時，吸取96孔培養(yǎng)板的孔中出現(xiàn)克隆細(xì)胞簇的培養(yǎng)上清用酶聯(lián)免疫吸附實驗方法檢測抗體含量，經(jīng)有限稀釋進(jìn)行三次亞克隆篩選，依抗體的分泌情況篩選出高效價的抗體分泌孔，將孔中細(xì)胞擴大培養(yǎng)，然后進(jìn)行抗原特異性免疫組織化學(xué)原位測定，選高效價，高特異性的細(xì)胞株再擴大培養(yǎng)并凍存；步驟(3)選經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測抗體效價大于I :10000的陽性孔的上清，分別與48種惡性腫瘤標(biāo)志物抗原進(jìn)行特異性和效價篩選。步驟(4)將特異性好和效價高的克隆孔培養(yǎng)液吸出，使用AKTA-FPLC蛋白純化儀(美國通用公司制造)將IgG單克隆抗體培養(yǎng)上清溶液在A280nm時收集，I. 44 (吸光單位)濃度為 l-10mg/ml。實施例2 :抗體芯片的制備方法
在實施例I基礎(chǔ)上增加如下工藝步驟步驟(5)用CY3突光素標(biāo)記補體C3抗體。步驟(6) —張芯片點96個點，每一種單抗兩個點，每一個點的含量O. 01-lng/ml ο實施例3 :本發(fā)明所述單抗各項指標(biāo)檢測將實施例I篩選的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單抗進(jìn)行序列分析，其重鏈可變區(qū)如下VKLQESGPGL VAPSQSLSMS CTVSGFSLSS YGVHffVRQPPGKGLEffLGVI WAGGTTNYNSALMSRLSISK DNSKSQVLLKMNSLQTDDTA MYYCATTTMI TLMDYffGQGT TVTVSSA^n SEQ ID No. I所示)其輕鏈可變區(qū)如下 DVQLNQAKSS LSASL⑶RVT ISCRASQDIS NYLNffYQQKP DGTVKLLIYY TSRLHSGVPPRFSGSGSGTD YSLTISNLEQ DIATYFCQQGNTVPffTFGG GTKLEIS (如 SEQ ID No. 2 所示)實施例4 :指標(biāo)檢測本發(fā)明實施例I制備的癌胚抗原的單克隆抗體其各項指標(biāo)如下I、高活性的Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的比值按1:10-100的比例混合2、陽性克隆孔酶聯(lián)免疫吸附實驗效價大于I :100003、一張芯片點96個點，每一種單抗兩個點，每一個點的含量O. 01-lng/ml ο4、48種惡性腫瘤標(biāo)志物單克隆抗體如下CK18、CK19、Cyclin-DU CD34、ER、PR、P53、Calcitonin、PSA、P63、CEA, S-100、Vimentin、AR、C-erbB-2、PCNA、Ki-67、HSP70、AEl、AE3、P504S、CK34BE、CA153、CA125、CA199、ECG2、IMPURas,CSK、Erbb2、p90、pl6、Calnuc、CyclinE、CDK2、CIAP、RalA、p62、CyclinBUKocλ CK20、EMAλ CA72-4、E-Cadherin、C-KIT、Cathepsin、MDM2、Hepatocyte此抗體芯片經(jīng)30例惡性腫瘤患者血清檢測，陽性表達(dá)的抗體與文獻(xiàn)報道的一致，與10例獻(xiàn)血員的正常血清檢測其陰性表達(dá)的抗體與文獻(xiàn)報道一致。表明此芯片特異性高，適合提供給醫(yī)療及科研機構(gòu)進(jìn)行惡性腫瘤標(biāo)志物的鑒定和質(zhì)控評價，此抗體還可制成免疫組化或酶聯(lián)免疫吸附實驗試劑盒開展醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種癌胚抗原的單克隆抗體，其特征在于，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示，其輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示；或其重鏈可變區(qū)由SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失、或添加一個或幾個氨基酸衍生的與SEQ ID NO. I的氨基酸序列至少有95%的一致性，輕鏈可變區(qū)由SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失、或添加一個或幾個氨基酸衍生的與SEQ ID NO. 2的氨基酸序列至少有95%的一致性且所述單克隆抗體具有特異性結(jié)合癌胚抗原的特性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體包括單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體、以及上述抗體的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗體片段和含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽。
3.權(quán)利要求I至2任一項所述的單克隆抗體在制備癌胚抗原的檢測試劑中的用途。
4.一種試劑，包含權(quán)利要求I至2任一項所述的單克隆抗體。
5.一種試劑盒，包含權(quán)利要求I至2任一項所述的單克隆抗體。
6.一種抗體芯片，包含權(quán)利要求I至2任一項所述的單克隆抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗體芯片，其特征在于，還包含特異性結(jié)合以下抗原的抗體CK18、CK19、Cyclin-Dl、CD34、ER、PR、P53、Calcitonin、PSA、P63、CEA、S-100、Vimentin、AR、C-erbB-2、PCNA、Ki_67、HSP70、ΑΕΙ、AE3、P504S、CK34BE、CA153、CA125、CA199、ECG2、IMPURas, CSK、Erbb2、ρ90、ρ16、Calnuc, CyclinE, CDK2、CIAP、RalA, ρ62、CyclinBl、Koc、CK20、EMAλ CA72-4、E-Cadherin、C-KIT、Cathepsin、MDM2、Hepatocyte。
8.包含權(quán)利要求6或7所述抗體芯片的試劑盒，其特征在于，還包含信標(biāo)分子標(biāo)記的C3補體抗體，所述信標(biāo)分子優(yōu)選為CY3。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種癌胚抗原的單克隆抗體及包含該抗體的芯片。本發(fā)明所述單克隆抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明所述單克隆抗體的均一性和生物活性單一性使抗原抗體反應(yīng)結(jié)果便于質(zhì)量控制，利于標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。包含此抗體芯片可直接應(yīng)用于醫(yī)療及科研機構(gòu)對多種腫瘤進(jìn)行疾病的診斷和預(yù)防，解決了傳統(tǒng)技術(shù)存在的費時、費力、結(jié)果重復(fù)性差等技術(shù)問題，在臨床診斷領(lǐng)域中具有極高的應(yīng)用價值，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N33/577GK102838676SQ201210363829
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月26日
發(fā)明者李彬 申請人:李彬