抗原制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種包含生物抗原的抗原制劑，其中該制劑包含含有桐酸的脂肪酸酯作為主要成分的油。本發(fā)明同樣涉及所述油用于制備抗原制劑的用途。
【專利說明】抗原制劑
[0001]本發(fā)明涉及抗原制劑，其包含至少一種生物抗原。
[0002]包含生物抗原的制劑在本【技術(shù)領(lǐng)域】中是已知的，其例如可用于診斷目的或作為疫苗，以用于預(yù)防、減輕或治療由(微)生物如細菌、病毒、立克次氏體和寄生蟲引起的疾病。這種制劑含有至少一種生物來源的抗原(即具有與免疫應(yīng)答的最終產(chǎn)物(即抗體和/或T細胞上的表面受體)特異結(jié)合的能力的物質(zhì))。生物抗原例如可以是活的(任選減活的)微生物、死的微生物、生物的毒素(任選的呈滅活形式，即所謂的類毒素)或生物的任何其它代謝物，所述生物的亞單元(如例如所述生物的DNA)或所述生物的表面分子(如外表面蛋白質(zhì)、外膜蛋白、脂多糖、碳水化合物)等。在任何情況下，術(shù)語“生物抗原”涵蓋了活的或死的微生物，以及來自生物，如細菌、病毒、動物、原生生物、真菌等的生物分子(優(yōu)選為蛋白質(zhì)或多糖)。術(shù)語“來自”包括生物分子本身或由生物產(chǎn)生的前體。
[0003]抗原制劑中存在的抗原和抗體或T細胞之間的相互作用的量，不僅取決于抗原與相應(yīng)的抗體或T細胞受體的內(nèi)在結(jié)合特性，還取決于在制劑中的抗原的有關(guān)結(jié)合位點(一個或多個)(也稱為表位(一個或多個))的可用性。該可用性取決于在制劑中的抗原對呈遞的開啟，以及保持(preservation)。理想的制劑提供了最佳的抗原的呈遞并優(yōu)選地，保護抗原防御降解。在本領(lǐng)域中，包含惰性油如輕質(zhì)烴油(如MarC0152?)和角鯊?fù)榈闹苿┳畛Ｓ糜诳乖蔬f。對于人類應(yīng)用，維生素E醋酸酯被廣泛地使用。
[0004]仍然存在對提供良好抗原呈遞的可替換的制劑的需要。為此，已經(jīng)設(shè)計出根據(jù)前文所述的抗原制劑，其中該制劑包含含有桐酸的脂肪酸酯作為主要成分(按油本身的重量計一般超過50% )的油。令人驚訝的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本制劑中各種不同類型的抗原與抗體結(jié)合的可用性與現(xiàn)有技術(shù)的制 劑相比得到了改善，并且，所述呈遞可以通過使制劑經(jīng)受紫外線輻射而甚至進一步的改善。當將含有抗原的制劑經(jīng)受紫外線輻射時，后者與預(yù)測是完全矛盾的。眾所周知，紫外線輻射對于許多抗原，特別是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是有害的。所發(fā)現(xiàn)的抗原的改善的呈遞的原因不明。當與例如非可生物降解的油如輕質(zhì)烴油和角鯊?fù)橄啾葧r，桐酸的脂肪酸的使用所伴隨的優(yōu)點是它的可生物降解性(由于該油在體內(nèi)可以留下較少的痕跡)。本發(fā)明還涉及含有桐酸的脂肪酸酯作為主要成分的油在制造包含至少一種生物抗原的抗原制劑中的用途。
[0005]注意到，該油也可以用于與水相結(jié)合構(gòu)成乳劑。眾所周知，乳劑是分散體系，其含有至少兩種互不相混溶的液相。不變地，兩種互不相混溶的相中的一種是水相，而另一種是油相(其簡單地表示為與水不相混溶的液體)。水或油相是否成為分散相，這尤其取決于兩液相存在的量。乳劑(其中油以液滴形式分散在整個水相中)稱為水包油(ο/W)型乳劑。當水是分散相，并且油是分散介質(zhì)(也稱為連續(xù)介質(zhì))時，乳劑為油包水(w/ο)型。此外，特別是為了延緩活性成分的釋放，已經(jīng)研制了多重乳劑(multiple emulsions)。在這些類型的乳劑中存在三(或更多)相。這樣的乳劑為例如W/0/W或0/W/0型。已知，當乳化而不是簡單地懸浮在水性制劑中時，生物抗原可以引起更快且更好的免疫應(yīng)答。
[0006]該脂肪酸酯可以是桐酸的甘油三酯，其是一種桐酸的天然存在的酯的常見形式。這樣的油優(yōu)選含有60至90%之間的桐酸的脂肪酸酯。本發(fā)明中可以使用的一種典型的油來自于油桐種子油(也稱為“桐油”或“中國木油”)。該種子油可常規(guī)獲得且價廉。通過除去來自實際的種子油的雜質(zhì)，或通過添加成分(如粘度調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、去污劑等)，可以例如從這種天然存在的油制造一種改良的衍生油(來滿足特定需求)。在一個實施方案中，該油是實際的桐油，即從油桐樹得到的油。桐油含有超過50% (W/W)(—般在73至82% (ff/W)之間)的桐酸的酯，這使得它理想地適合于在根據(jù)本發(fā)明的制劑中使用。
[0007]在一個實施方案中，該制劑是一種該油在水性液體中的乳劑。優(yōu)選地，抗原存在于水性液體中。合適的抗原的例子是APX III毒素、牛呼吸道合胞病毒的抗原(例如該病毒的一個亞單元或作為整體的病毒)以及副流感3病毒的抗原(例如該病毒的一個亞單元或作為整體的病毒)。
[0008]在再一個實施方案中，將該制劑暴露于紫外線輻射。完全令人驚奇地，發(fā)現(xiàn)通過使制劑經(jīng)受紫外線輻射可以甚至進一步改善抗原呈遞。
[0009]本發(fā)明將在下列實施例中作進一步的說明。
[0010]實施例1配制在水包油乳劑中的RTX毒素APXIII。
[0011]實施例2配制在水包油乳劑中的滅活的BRS病毒。
[0012]實施例3配制在水包油乳劑中的滅活的P1-3病毒。
[0013]實施例4配制在另一種水包油乳劑中的RTX毒素APXIII。
[0014]實施例1
[0015]作為第一個實施例制劑，其用細菌重復(fù)序列毒素APX III制成，所述細菌重復(fù)序列毒素APX III是由豬病原體胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleurpneumoniae)(也稱為APP)產(chǎn)生的。該抗原作為一種疫苗成分用于市售的疫苗Porcilis APP?(可從IntervetSchering-Plough Animal Health, Boxmeer, The Netherlands 獲得)中，并可用于診斷測試中以驗證豬是否已經(jīng)被APP血清型2、3、4、6或8(此血清型生產(chǎn)AxpIII)中的任意種感染。
[0016]通過在159.21克的PBS緩沖液(50°C )中磁力混合40.79克的吐溫80，直至獲得澄清的溶液，制備吐溫 80 (Uniqema Nederland BV, Gouda, The Netherlands)在 0.01M憐酸鹽緩沖液(PBS)中的溶液。將該溶液冷卻至約8°C。向53.07g的該溶液中，緩慢加入50g溫度約 20°C 的桐油(Vliegenthart BV, Tiel, The Netherlands),并在氮氣氛下，用 14N 轉(zhuǎn)子/定子ultra turrax混合器(IKA, Staufen, Germany)混合。在約每分鐘11000轉(zhuǎn)的混合速度下，在3分12秒內(nèi)完成油的加入。此后，在約每分鐘22000轉(zhuǎn)下，將乳劑另外攪拌10分鐘。在此過程中，乳劑的溫度從16°C升至32°C。發(fā)現(xiàn)80%的油滴具有低于2μπι的直徑(在顯微鏡下測定)。
[0017]向9.25克乳劑中加入50.58克的APXIII抗原的水性(0.01M PBS)混懸液，以獲得最終的APXIII制劑。在該最終制劑中意圖達到的抗原濃度為25U/ml。
[0018]為構(gòu)建對照制劑，將50.58克相同的APXIII抗原混懸液加入到9.25克的0.01MPBS中(因此也意圖達到25U/ml的APXIII的濃度)。
[0019]使用對抗APX III的抗體，通過抗原質(zhì)量ELISA (antigenic mass ELISA)來測定制劑的滴度。為了驗證制劑是否可以使毒素抵御降解，進行了一項測試，其中將該制劑暴露于紫外線福射。在該測試中，使用Mirasol PRT系統(tǒng)(5.1版Illuminator,可得自CaridianBCT, Lakewood, Colorado, USA)。將待暴露的約57ml樣品轉(zhuǎn)移到一個塑料袋中(用Mirasol設(shè)備來使其標準化)。在此之后，同樣加入120毫升的氧氣。按照制造商的說明書，將包含其內(nèi)容物的袋子置于Mirasol設(shè)備上，并進行(標準)紫外線照射程序?？偟恼丈鋾r間為15分鐘。紫外線處理后通過用氮氣沖洗除去氧氣。
[0020]表1描述了在制劑中確定的滴度。滴度為兩次測量的平均值。
[0021]顯而易見，在de ELISA測試中，該油對抗原的呈遞具有積極效果:憑借該油的存在，滴度增加了 13單位/ml。似乎APXIII的相關(guān)結(jié)合位點的可用性由于桐油的存在而增加了。引人注目的是，由于用紫外線輻射暴露，滴度從43U/ml增加至69U/ml。
[0022]表1有或無紫外線暴露的各種制劑的APXIII滴度
[0023]
【權(quán)利要求】
1.一種包含生物抗原的抗原制劑，其特征在于，該制劑包含含有桐酸的脂肪酸酯作為主要成分的油。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其特征在于，該酯是桐酸的甘油三酯。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的制劑，其特征在于，該油包含60%至90%(ff/W)的桐酸的脂肪酸酯。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的制劑，其特征在于，該油來自于油桐種子油。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制劑，其特征在于，該油是桐油。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的制劑，其特征在于，該制劑是一種該油在水性液體中的乳劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制劑，其特征在于，該抗原存在于水性液體中。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制劑，其特征在于，該抗原選自APXIII毒素、牛呼吸道合胞病毒抗原和副流感3病毒抗原。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的制劑，其特征在于，將該制劑暴露于紫外線輻射。
10.含有桐酸的脂肪酸酯作為主要成分的油在制造包含至少一種生物抗原的抗原制劑中的用途。`
【文檔編號】A61K47/14GK103533922SQ201280019849
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2012年4月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月22日
【發(fā)明者】E·莫姆巴格 申請人:英特維特國際股份有限公司