專(zhuān)利名稱(chēng)：一種可用以抗癌治療的超抗原融合蛋白質(zhì)及其生產(chǎn)方法
專(zhuān)利說(shuō)明一種可用以抗癌治療的超抗原融合蛋白質(zhì)及其生產(chǎn)方法 本發(fā)明涉及一類(lèi)可用以抗癌治療的基因重組的新型超抗原融合蛋白質(zhì)，描述了編碼此類(lèi)融合蛋白質(zhì)的多核苷酸和氨基酸的序列，以及它們?cè)诖竽c桿菌的表達(dá)和分離純化。目前對(duì)于癌癥疾病的藥物治療主要是以化學(xué)藥物為主，副作用大，化學(xué)藥物在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)也傷害了正常細(xì)胞，化學(xué)藥物缺乏針對(duì)癌細(xì)胞的特異性作用。
為了解決藥物的特異性問(wèn)題，抗體是一類(lèi)很有效的工具，是一種常用的癌細(xì)胞特異性定位導(dǎo)向載體，它可以特異地作用于癌細(xì)胞?？贵w本身可以封閉癌細(xì)胞，它的Fc片段能引起細(xì)胞毒作用?？贵w也可以接上一個(gè)毒素蛋白質(zhì)，引導(dǎo)毒素蛋白質(zhì)殺死癌細(xì)胞。
超抗原(Superantigen)也能引起細(xì)胞毒作用，它是一類(lèi)特殊的抗原分子，主要是一些細(xì)菌的毒素和逆轉(zhuǎn)錄病毒基因的產(chǎn)物，不需要抗原提呈細(xì)胞的加工處理，而以完整的蛋白質(zhì)形式直接與細(xì)胞膜上的MHC II類(lèi)分子結(jié)合形成復(fù)合物，識(shí)別TCR的Vb片段，激活比普通抗原多得多的T細(xì)胞(包括CD4+，CD8+)，并釋放大量細(xì)胞因子，對(duì)靶細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)而有力的細(xì)胞毒作用。
超抗原與人類(lèi)多種急、慢性疾病的發(fā)生有關(guān)，但在抗腫瘤研究中也發(fā)揮了獨(dú)特的作用，嘗試用它激活的T細(xì)胞來(lái)殺傷腫瘤，并取得了一定的成果，目前較有研究基礎(chǔ)的超抗原主要是金黃色葡萄球菌腸毒素A、B等。因?yàn)槌乖瓱o(wú)抗腫瘤的特異性，它也會(huì)作用于表達(dá)MHC II類(lèi)分子的正常細(xì)胞上，直接用于抗腫瘤會(huì)產(chǎn)生副作用，臨床使用有很多的限制。
為了解決超抗原的無(wú)抗腫瘤特異性問(wèn)題，人們將超抗原連接到抗體上，由抗癌抗體將超抗原金黃色葡萄球菌腸毒素A(Staphylococcal-enterotoxin A，SEA)定位到癌細(xì)胞上(M.Dohlsten，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，8945-8949，1994；J.Ihle，et al，Cancer Res.，55，623-628，1995)。
要使抗體成為藥物，就必須對(duì)于鼠源抗體進(jìn)行人源化的基因工程改造。由于抗體藥物的使用劑量很大，常常需要數(shù)十毫克/人/次，這就要求提高基因工程抗體的動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)水平以及發(fā)展大規(guī)模發(fā)酵技術(shù)。所以抗體藥物的研究開(kāi)發(fā)的周期和投資成本是非常巨大的。
除了抗體外，與癌細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)的細(xì)胞因子也被用于癌細(xì)胞的定位。例如表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal growth factor，EGF)被連接到RNA水解酶(H.Jinno，et al，Cancer Chemother.Pharmacol.，38，303-308，1996)和毒素(A.Schmidt，et al，Biochem.Biophys.Res.Commun.，277，499-506，2000)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Vascularendothelial cell growth factor，VEGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(Transforming growthfactor-α，TGF-α)也分別與毒素形成融合蛋白質(zhì)(Biochem.Biophys.Res.Commun.，277，499-506，2000；L.M.Veenendaal，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99，7866-7871，2002；A.Kihara and I.Pastan，Cancer Res.，54，5154-5159，1994)。而其它的細(xì)胞因子也有報(bào)告，例如白細(xì)胞介素-4(Interleukin-4)和白細(xì)胞介素-2(Interleukin-2)則分別被連接到毒素上(S.R.Husain，et al，Cancer Res.，58，3649-3653，1998；J.M.Dore，et al，F(xiàn)EBS Lett.，402，50-52，1997)。
以上的工作都使用細(xì)胞因子與蛋白質(zhì)毒素或RNA水解酶所組成的融合蛋白質(zhì)的形式，思想方法是出于同樣的戰(zhàn)略模式(E.B.Sweeney and J.R.Murphy，Essays Biochem.，30，119-131，1995)。在這些細(xì)胞因子的癌細(xì)胞定位的作用下，蛋白質(zhì)毒素和RNA水解酶才特異地殺傷癌細(xì)胞或者治療其它疾病。但是這個(gè)作用機(jī)制是不同于抗體的Fc片段以及超抗原，后兩者是動(dòng)員機(jī)體的免疫系統(tǒng)來(lái)激發(fā)抗癌的細(xì)胞毒作用。
癌細(xì)胞是由正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變而來(lái)的，癌細(xì)胞的抗原是自身抗原，所以癌細(xì)胞能夠逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。人們一直在尋找新的抗癌方法來(lái)提高癌癥病人的免疫力，特別是針對(duì)癌細(xì)胞的特異性免疫力。為了有效地開(kāi)發(fā)針對(duì)癌癥的特異性藥物，本發(fā)明利用超抗原和細(xì)胞因子的各自特性，構(gòu)建一種新型細(xì)胞因子-超抗原融合蛋白質(zhì)，促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子可以將融合蛋白質(zhì)定位到癌細(xì)胞上，而超抗原則在癌細(xì)胞周?chē)鹂拱┑拿庖叻磻?yīng)，即超抗原依賴(lài)的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(Superantigen-dependent-cellular-cytotoxicity，SDCC)。利用此方法就可以將這種類(lèi)型的融合蛋白質(zhì)特異地定位到癌細(xì)胞并在癌細(xì)胞周?chē)鹂拱┑募?xì)胞毒免疫反應(yīng)。
超抗原的種類(lèi)可以是金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal-enterotoxin，SE)家族的SEA，SEB，SEC，SED，SEE；鏈球菌毒素(Streptococcal pyrogenicexotoxin，SPE)的SPE-A，SPE-B，SPE-C；以及其它包括病毒蛋白質(zhì)在內(nèi)的各種來(lái)源的超抗原以及它們的自然和人為的變異體。這些蛋白質(zhì)同樣可以說(shuō)明本發(fā)明的思想。
細(xì)胞因子可以是表皮生長(zhǎng)因子EGF，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-α，白細(xì)胞介素IL-4以及白細(xì)胞介素IL-2；以及其它包括人和鼠等在內(nèi)的各種物種來(lái)源的與癌或其它疾病有關(guān)聯(lián)的細(xì)胞因子以及它們的自然變異體和人為的變異體。這些蛋白質(zhì)同樣可以說(shuō)明本發(fā)明的思想。
本發(fā)明選擇了一個(gè)嶄新的戰(zhàn)略，將超抗原連接到細(xì)胞因子上，這樣產(chǎn)生了新型的細(xì)胞因子-超抗原融合蛋白質(zhì)，作為一個(gè)模型，本發(fā)明使用表皮生長(zhǎng)因子EGF和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF分別與超抗原SEA來(lái)構(gòu)建這種新型的融合蛋白質(zhì)。
在此雖然只選擇超抗原SEA，當(dāng)然超抗原SEB和SEC以及其它超抗原也能夠說(shuō)明本發(fā)明的思想?？乖璖EA或其它超抗原的作用是激發(fā)機(jī)體內(nèi)的免疫反應(yīng)。
同樣，作為實(shí)驗(yàn)材料的表皮生長(zhǎng)因子EGF和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF只是利用它們癌細(xì)胞的定位作用，采用與癌細(xì)胞緊密相關(guān)的其它細(xì)胞因子也能夠說(shuō)明本發(fā)明的思想。
考慮到本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)可以由各種類(lèi)型的細(xì)胞因子與超抗原構(gòu)建，所以采用了一個(gè)通用的蛋白質(zhì)純化方法，即按照同樣的方法來(lái)純化各種融合蛋白質(zhì)。此方法是利用一個(gè)Cellulose binding domain(CBD)作為純化用的Tag，質(zhì)粒pET-34b(Novagen公司)含有這個(gè)CBD-Tag。
采用與癌緊密有關(guān)的細(xì)胞因子作為癌細(xì)胞定向的載體，是因?yàn)榘┘?xì)胞通常大量表達(dá)這些細(xì)胞因子的受體。以EGF為例，癌細(xì)胞膜上通常異常地大量表達(dá)EGF受體，EGF通過(guò)與EGF受體相互作用來(lái)促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。同樣癌組織也通過(guò)異常高表達(dá)VEGF受體來(lái)接受VEGF的信號(hào)，促進(jìn)癌組織血管異常生長(zhǎng)，從而使得整個(gè)癌組織不斷擴(kuò)大。
而正常細(xì)胞膜上的這些受體的表達(dá)量沒(méi)有或很少，所以細(xì)胞因子也可以起著癌細(xì)胞的特異性定位作用。利用EGF和VEGF能認(rèn)識(shí)癌細(xì)胞的特性，把超抗原SEA分別連接到EGF和VEGF上，就能使得SEA集中在癌細(xì)胞的周?chē)?，特異地激發(fā)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生極其強(qiáng)大的針對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。單獨(dú)使用超抗原SEA會(huì)產(chǎn)生全身用藥的副作用，而采用融合蛋白質(zhì)就會(huì)使得只在癌組織周?chē)杏蒘EA所誘導(dǎo)的大量T殺傷細(xì)胞。
超抗原SEA與T細(xì)胞激活產(chǎn)生增殖和產(chǎn)生細(xì)胞毒作用呈劑量依賴(lài)關(guān)系，其范圍在每只小鼠0.1μg～100μg，最大效應(yīng)出現(xiàn)在注射后24小時(shí)，96小時(shí)內(nèi)消失，SDCC最大效應(yīng)濃度為每只小鼠1μg，效應(yīng)高峰在第48小時(shí)，96小時(shí)內(nèi)消失(G.Hedlund，et al，Cancer Immunol.Immunother.，36，89-93，1993)。
所以融合蛋白質(zhì)可以發(fā)揮類(lèi)似于抗體-SEA的作用，而采用這個(gè)方法能夠節(jié)約藥物開(kāi)發(fā)成本，例如小鼠抗體人源化和大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)。所以超抗原SEA的藥物就能大大地降低藥物生產(chǎn)和病人醫(yī)療成本，同樣含有超抗原SEA的本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)也可以大大地降低使用劑量。
SEA基因早在80年代就報(bào)道了(I.Y.Huang，et al，J.Biol.Chem.，262，7006-7013，1987；M.J.Betley and J.J.Mekalanos，J.Bacteriol.，170，34-41，1988)。
EGF基因也在80年代早期被發(fā)現(xiàn)了(J.Smith，et al，Nucleic Acids Res.，10，4467-4482，1982；A.Gray，et al，Nature，303，722-725，1983)，它的成熟形式是53氨基酸的多肽。
VEGF基因是在80年代后期被發(fā)現(xiàn)(D.W.Leung，et al，Science，246，1306-1309，1989；P.J.Keck，et al，Science，246，1309-1312，1989)，由于mRNA的不同剪切，它的成熟形式有多種形式，長(zhǎng)度可以是189、165以及121氨基酸的多肽(E.Tischer，et al，J.Biol.Chem.，266，11947-11954，1991)。
EGF-SEA和VEGF-SEA僅僅是用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的材料，而本發(fā)明的思想范圍可以拓展，例如可以采用各種類(lèi)型的細(xì)胞因子和超抗原以及它們的變異體，對(duì)融合蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，這些變異體可以完善其生物學(xué)功能以及減少其可能產(chǎn)生的副作用。
融合蛋白質(zhì)可以是EGF-SEA和VEGF-SEA形式，也可以是SEA-EGF和SEA-VEGF形式，在空間上兩種蛋白質(zhì)是獨(dú)立的，所以?xún)煞N形式都可以使得細(xì)胞因子和超抗原獨(dú)立地發(fā)揮作用。
連接這兩種蛋白質(zhì)的Linker的氨基酸組分和長(zhǎng)度則可以是各種形式，過(guò)短的Linker會(huì)造成細(xì)胞因子和超抗原因過(guò)分接近而產(chǎn)生空間阻礙，合適的Linker對(duì)于充分發(fā)揮細(xì)胞因子和超抗原的作用是至關(guān)重要的。
以上的各種融合蛋白質(zhì)基因可以轉(zhuǎn)入動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母、細(xì)菌等生物體在內(nèi)的重組工程化宿主細(xì)胞，表達(dá)方式可以是分泌和不分泌等各種形式。無(wú)細(xì)胞體外翻譯系統(tǒng)也可以用來(lái)進(jìn)行融合蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。
融合蛋白質(zhì)也可以通過(guò)化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)等化學(xué)反應(yīng)手段分別將細(xì)胞因子和超抗原的多肽片段進(jìn)行連接，例如共價(jià)鍵連接，從而構(gòu)建成融合蛋白質(zhì)。
對(duì)于融合蛋白質(zhì)可以進(jìn)行化學(xué)修飾、缺損融合蛋白質(zhì)的一部分多肽片段以及將其它多肽連接在這些蛋白質(zhì)上等一系列的改造。
純化后的融合蛋白質(zhì)可以通過(guò)一系列蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性過(guò)程來(lái)完善其包括二硫鍵在內(nèi)的空間結(jié)構(gòu)，從而提高它的生物活性。
本發(fā)明闡述的是一種新的抗癌方法，即把細(xì)胞因子和超抗原構(gòu)建成融合蛋白質(zhì)，由細(xì)胞因子將超抗原定位到癌細(xì)胞上，從而在癌細(xì)胞周?chē)l(fā)生抗癌的細(xì)胞毒免疫反應(yīng)。
融合蛋白質(zhì)不但可以起著和抗體相似的特異性抗癌作用，而且由超抗原所激發(fā)的T細(xì)胞殺傷效果要大于抗體，使用劑量卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于抗體藥物的用量，這樣就可以大大地降低生產(chǎn)成本。
作為藥物形式應(yīng)用的融合蛋白質(zhì)可應(yīng)用于抗癌和免疫疾病等醫(yī)學(xué)的臨床方面，它們和防腐劑、乳化劑、脂質(zhì)體、分散劑、安定化劑等一起制成各種注射、口服、敷貼以及手術(shù)處理等藥物的給藥形式。
除了融合蛋白質(zhì)本身可以作為藥物外，編碼融合蛋白質(zhì)的核苷酸片段或載體還可以作為基因治療形式來(lái)應(yīng)用。例如將這些核苷酸片段注射動(dòng)物體內(nèi)并被轉(zhuǎn)入細(xì)胞，從而表達(dá)融合蛋白質(zhì)。

圖1是表示用PCR方法構(gòu)建EGF-SEA融合蛋白質(zhì)基因的構(gòu)建圖。
圖2是表示用PCR方法構(gòu)建VEGF-SEA融合蛋白質(zhì)基因的構(gòu)建圖。
圖3表示了EGF-SEA融合蛋白質(zhì)純化后的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果。
圖4表示了VEGF-SEA融合蛋白質(zhì)純化后的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果。
圖1中的實(shí)驗(yàn)過(guò)程是首先經(jīng)過(guò)第一次PCR反應(yīng)分別取得EGF和SEA基因的DNA多核苷酸片段，然后利用Overlap extension PCR方法將這兩個(gè)片段連接在一起，這樣就將形成的EGF-SEA融合蛋白質(zhì)的基因片段插入一個(gè)大腸桿菌表達(dá)用的載體并進(jìn)行融合蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。
圖2中的實(shí)驗(yàn)過(guò)程是首先經(jīng)過(guò)第一次PCR反應(yīng)分別取得VEGF和SEA基因的DNA多核苷酸片段，然后利用Overlap extension PCR方法將這兩個(gè)片段連接在一起，這樣就將形成的VEGF-SEA融合蛋白質(zhì)的基因片段插入一個(gè)大腸桿菌表達(dá)用的載體并進(jìn)行融合蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。本發(fā)明采用的是EGF-Linker-SEA和VEGF-Linker-SEA的形式，Linker是一個(gè)短的多肽，它將EGF和VEGF分別與SEA連接在一起。
根據(jù)已知的SEA、EGF和VEGF基因序列，設(shè)計(jì)一系列的引物，通過(guò)多聚酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)分離這些基因，再用PCR方法將EGF和VEGF分別與Linker和SEA形成一個(gè)融合蛋白質(zhì)的DNA片段。然后將這個(gè)基因片段插入一個(gè)大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒，在T7啟動(dòng)子的控制下，融合蛋白質(zhì)大量表達(dá)，最后將表達(dá)的融合蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。
本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中所使用的編碼蛋白質(zhì)和多肽的形式(1)成熟形式的SEA；(2)53氨基酸的EGF；(3)121氨基酸的VEGF；(4)用于連接細(xì)胞因子和超抗原的Linker，它的多核苷酸組成是GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG，編碼了15氨基酸的GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer多肽。
使用的大腸桿菌質(zhì)粒是pET-34b(Novagen公司)，長(zhǎng)度約為6kb，它含有啟始密碼子ATG以及終止信號(hào)TAA，在這兩者之間有多個(gè)限制酶位點(diǎn)以及用于分離純化的CBD-Tag，在此采用的是SrfI和NotI限制酶位點(diǎn)，另外作為選擇用的抗生素是卡那霉素，T7啟動(dòng)子控制基因表達(dá)。
實(shí)施例1、分離超抗原SEA基因按照常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法(T.Maniatis，et al，Molecular cloning，Alaboratory manual，Second edition，Cold spring harbor laboratory，1989)，用酚/氯仿抽提法從金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus FRI337)的DNA，根據(jù)文獻(xiàn)上的超抗原SEA基因的序列(M.J.Betley and J.J.Mekalanos，J.Bacteriol.，170，34-41，1988)設(shè)計(jì)引物(1)含有SrfI限制酶切點(diǎn)的正向引物，5’-GAGCCCGGGCAGCGAGAAAAGCGAAGAAATAAAT-3’；(2)含有NotI限制酶切點(diǎn)的反向引物，5’-GTGCGGCCGCACTTGTATATAAATATATATCAATATGCAT-3’。用此引物將SEA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。模板的量為0.1微升，PCR反應(yīng)的循環(huán)條件95℃30秒→55℃30秒→72℃120秒，一共是30個(gè)循環(huán)反應(yīng)，最后是72℃10分鐘。DNA片段的長(zhǎng)度大約是700bp。
將這個(gè)DNA產(chǎn)物進(jìn)行低融點(diǎn)膠的電泳，回收DNA片段，再對(duì)這個(gè)片段進(jìn)行SrfI和NotI限制酶處理后，得到的基因片段插入pET-34b質(zhì)粒，DNA連接酶的反應(yīng)是16℃12小時(shí)。最后進(jìn)行DNA測(cè)序。
實(shí)施例2、分離表皮生長(zhǎng)因子EGF基因根據(jù)已報(bào)告的表皮生長(zhǎng)因子EGF基因序列設(shè)計(jì)引物(J.Smith，et al，NucleicAcids Res.，10，4467-4482，1982)(1)含有SrfI限制酶切點(diǎn)的正向引物，5’-GAGCCCGGGCAATTCCGATAGCGAGTGT-3’；(2)含有NotI限制酶切點(diǎn)的反向引物，5’-GTGCGGCCGCTCTAAGTTCCCACCATTT-3’。利用PCR方法從Human breast carcinoma cDNA基因文庫(kù)(Clontech公司)中分離EGF基因，它編碼一個(gè)53氨基酸的多肽。模板的量為0.1微升，PCR反應(yīng)的循環(huán)條件95℃30秒→55℃30秒→72℃30秒，一共是30個(gè)循環(huán)反應(yīng)，最后是72℃10分鐘。DNA片段的長(zhǎng)度大約是170bp。
將這個(gè)DNA產(chǎn)物進(jìn)行低融點(diǎn)膠的電泳，回收DNA片段，再對(duì)這個(gè)片段進(jìn)行SrfI和NotI限制酶處理后，然后將基因片段插入pET-34b質(zhì)粒，DNA連接酶的反應(yīng)是16℃12小時(shí)。最后進(jìn)行DNA測(cè)序。
實(shí)施例3、分離血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF從報(bào)告的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF基因序列(P.J.Keck，et al，Science，246，1309-1312，1989；E.Tischer，et al，J.Biol.Chem.，266，11947-11954，1991)中設(shè)計(jì)VEGF-121的引物(1)含有SrfI限制酶切點(diǎn)的正向引物，5’-GAGCCCGGGCGCACCCATGGCAGAAGGAGGA-3’；(2)含有NotI限制酶切點(diǎn)的反向引物，5’-GTGCGGCCGCCCGCCTCGGCTTGTCACATTTTTCTTGTCTTGCTCTATCTTTCTT-3’。利用PCR方法從Human breast carcinoma cDNA基因文庫(kù)(Clontech公司)中分離VEGF-121基因，它編碼一個(gè)121氨基酸的多肽。模板的量為0.1微升，PCR反應(yīng)的循環(huán)條件95℃30秒→55℃30秒→72℃50秒，一共是30個(gè)循環(huán)反應(yīng)，最后是72℃10分鐘。DNA片段的長(zhǎng)度大約是370bp。
將這個(gè)DNA產(chǎn)物進(jìn)行低融點(diǎn)膠的電泳，回收DNA片段，再對(duì)這個(gè)片段進(jìn)行SrfI和NotI限制酶處理后，然后將基因片段插入pET-34b質(zhì)粒，DNA連接酶的反應(yīng)是16℃12小時(shí)。最后進(jìn)行DNA測(cè)序。
實(shí)施例4、用含有Linker的引物構(gòu)建EGF和SEA的融合蛋白質(zhì)的基因通過(guò)Overlap extension PCR方法(R.M.Horton，et al，Methods Enzymol.，217，270-279，1993)，采用編碼一個(gè)15氨基酸多肽(GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)的多核苷酸片段來(lái)連接EGF和SEA。
第一組引物1、含有SrfI限制酶切點(diǎn)的EGF基因正向引物，5’-GAGCCCGGGCAATTCCGATAGCGAGTGTCCT-3’；2、含有一部分Linker的EGF基因反向引物，5’-GCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC-TCTAAGTTCCCACCATTTCAG-3’，下線(xiàn)表注的是Linker的一部分序列。
第二組引物1、一部分Linker的成熟SEA基因正向引物，5’-TCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG-AGCGAGAAAAGCGAAGAAATAAATGAA-3’，下線(xiàn)表注的是Linker的一部分序列；2、含有NotI限制酶切點(diǎn)的SEA基因反向引物，5’-GTGCGGCCGCACTTGTATATAAATATATATCAATATGCAT-3’。
首先用第一組和第二組的引物分別合成EGF基因和SEA基因的DNA片段，模板是實(shí)施2和實(shí)施1的經(jīng)過(guò)DNA測(cè)序的基因，這是第一步PCR反應(yīng)。然后進(jìn)行電泳，切割含有DNA片段的凝膠，這樣就去除了PCR反應(yīng)的引物。
取出以上微量的兩種基因片段的DNA回收液并將這兩者混合，加入DNA多聚酶，將兩個(gè)DNA片段連在一起，這個(gè)片段就是新一輪PCR反應(yīng)的模板，再加入第一組引物(1)和第二組引物(2)，反應(yīng)條件是95℃30秒→55℃30秒→72℃150秒，一共是3個(gè)循環(huán)反應(yīng)。
再加入引物(1)含有SrfI限制酶切點(diǎn)的EGF基因正向引物，5’-GAGCCCGGGCAATTCCGATAGCGAGTGTCCT-3’；(2)含有NotI限制酶切點(diǎn)的SEA基因反向引物，5’-GTGCGGCCGCACTTGTATATAAATATATATCAATATGCAT-3’。最后進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)的循環(huán)條件95℃30秒→55℃30秒→72℃150秒，一共是30個(gè)循環(huán)反應(yīng)，最后是72℃10分鐘。
這樣就構(gòu)建成了EGF和SEA的融合蛋白質(zhì)的基因片段。
實(shí)施例5、用含有Linker的引物構(gòu)建VEGF和SEA的融合蛋白質(zhì)的基因與實(shí)施例4類(lèi)似，采用Overlap extension PCR方法。
第一組引物1、含有SrfI限制酶切點(diǎn)的正向引物，5’-GAGCCCGGGCGCACCCATGGCAGAAGGAGGA-3’；2、含有一部分Linker的VEGF基因反向引物，5’-GCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC-CCGCCTCGGCTTGTCACATTTTTC-3’，下線(xiàn)表注的是Linker的一部分序列。
第二組引物1、一部分Linker的成熟SEA基因正向引物，5’-TCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG-AGCGAGAAAAGCGAAGAAATAAATGAA-3’，下線(xiàn)表注的是Linker的一部分序列；2、含有NotI限制酶切點(diǎn)的SEA基因反向引物，5’-GTGCGGCCGCACTTGTATATAAATATATATCAATATGCAT-3’。
首先用第一組和第二組的引物分別合成VEGF基因和SEA基因的DNA片段，模板是實(shí)施3和實(shí)施1的經(jīng)過(guò)DNA測(cè)序的基因，這是第一步PCR反應(yīng)。然后進(jìn)行電泳，切割含有DNA片段的凝膠，這樣就去除了PCR反應(yīng)的引物。
取出以上微量的兩種基因片段的DNA回收液并將這兩者混合，加入DNA多聚酶，將兩個(gè)DNA片段連在一起，這個(gè)片段就是新一輪PCR反應(yīng)的模板，再加入第一組引物(1)和第二組引物(2)，反應(yīng)條件是95℃30秒→55℃30秒→72℃150秒，一共是3個(gè)循環(huán)反應(yīng)。
再加入引物(1)含有SrfI限制酶切點(diǎn)的VEGF基因正向引物，5’-GAGCCCGGGC GCACCCATGGCAGAAGGAGGA-3’；(2)含有NotI限制酶切點(diǎn)的SEA基因反向引物，5’-GTGCGGCCGCACTTGTATATAAATATATATCAATATGCAT-3’。最后進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)的循環(huán)條件95℃30秒→55℃30秒→72℃150秒，一共是30個(gè)循環(huán)反應(yīng)，最后是72℃10分鐘。
這樣就構(gòu)建成了VEGF和SEA的融合蛋白質(zhì)的基因片段。
實(shí)施例6、在大腸桿菌中分別表達(dá)EGF-SEA和VEGF-SEA的融合蛋白質(zhì)的基因(A)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒并進(jìn)行DNA序列測(cè)定將實(shí)施例4和實(shí)施例5的融合蛋白質(zhì)基因的DNA片段用SrfI和NotI限制酶處理，同時(shí)pET-34b質(zhì)粒也用SrfI和NotI限制酶處理，再用DNA連接酶分別把這兩個(gè)DNA片段連接到pET-34b質(zhì)粒上，DNA連接酶的反應(yīng)是16℃12小時(shí)。這樣就得到了含有兩種融合蛋白質(zhì)基因的質(zhì)粒。
用氯化鈣制備成感受態(tài)大腸桿菌BL21，通過(guò)Heat shock方法把這兩種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，卡那霉素的濃度為5mg/L。然后篩選有卡那霉素抗性的單菌落。用常規(guī)方法(T.Maniatis，et al，Molecular cloning，A laboratory manual，Second edition，Cold spring harborlaboratory，1989)制備和純化質(zhì)粒，并鑒定大腸桿菌中的質(zhì)粒的限制酶圖譜，以確定融合蛋白質(zhì)基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌。
這樣就分別得到了含有EGF-SEA和VEGF-SEA融合蛋白質(zhì)基因的兩種大腸桿菌的菌株，菌株用含有15％甘油的培養(yǎng)基保存于-70℃。
最后將兩種質(zhì)粒中的EGF-SEA和VEGF-SEA融合蛋白質(zhì)基因的DNA序列進(jìn)行測(cè)定。
序列表中的序列1是表皮生長(zhǎng)因子(EGF)-Linker-超抗原-(SEA)融合蛋白質(zhì)基因的序列從第1位氨基酸到第53位氨基酸的多肽是EGF，從第54位氨基酸到第68位氨基酸的多肽是Linker，從第69位氨基酸到第301位氨基酸的多肽是SEA。序列2是序列1的氨基酸序列。
序列表中的序列3是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)-Linker-超抗原-(SEA)融合蛋白質(zhì)基因的序列從第1位氨基酸到第121位氨基酸的多肽是VEGF，從第122位氨基酸到第136位氨基酸的多肽是Linker，從第137位氨基酸到第369位氨基酸的多肽是SEA。序列4是序列3的氨基酸序列。
(B)融合蛋白質(zhì)基因的表達(dá)在37℃下分別含有兩種質(zhì)粒的大腸桿菌在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，由于這兩種融合蛋白質(zhì)基因是在T7啟動(dòng)子的控制下，再在培養(yǎng)液中加入1mMIPTG，進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，它們就可以大量表達(dá)。
附圖1和附圖2分別表示了構(gòu)建和表達(dá)EGF-SEA和VEGF-SEA融合蛋白質(zhì)基因的實(shí)驗(yàn)過(guò)程。
實(shí)施例7、分離和純化EGF-SEA和VEGF-SEA融合蛋白質(zhì)將實(shí)施例6中的兩種大量表達(dá)EGF-SEA和VEGF-SEA融合蛋白質(zhì)的大腸桿菌培養(yǎng)液進(jìn)行離心(5000rpm，30min)，收集菌體并用50mM磷酸緩沖液(pH7.0)洗滌，然后用超聲波方法破碎大腸桿菌。再進(jìn)行離心(10000rpm，30min)，收集上清液，這樣就得到了含有融合蛋白質(zhì)的粗抽提液。
pET-34b質(zhì)粒含有一個(gè)CBD序列片段，它可以作為分離純化用的Tag，利用這個(gè)CBD的特性，可以使用纖維素樹(shù)脂來(lái)直接分離純化被表達(dá)的外源蛋白質(zhì)，這個(gè)方法具有通用性，用于分離純化的材料是CBIND ReadyRun Column(Novagen公司)。將粗抽提液上樣于纖維素樹(shù)脂的層析柱，當(dāng)含有CBD的融合蛋白質(zhì)被吸附到纖維素層析柱后，先用20mM磷酸緩沖液(pH7.0)洗去雜蛋白質(zhì)，然后用含有1％纖維二糖的磷酸緩沖液洗脫融合蛋白質(zhì)，收集含有融合蛋白質(zhì)的洗脫液。
在洗脫液里加入Enterokinase以切除CBD部分，然后進(jìn)行透析，透析在4℃低溫以及20mM磷酸緩沖液(pH7.0)中進(jìn)行，這樣就去除了纖維二糖。將透析后的溶液再進(jìn)行纖維素處理，游離的CBD部分被吸附到纖維素上，而不含CBD的融合蛋白質(zhì)則不會(huì)被吸附，從而就得到了沒(méi)有CBD部分的高純度融合蛋白質(zhì)。附圖3和附圖4是兩種融合蛋白質(zhì)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果，附圖3表示了精制后的EGF-SEA，而附圖4則表示了精制后的VEGF-SEA。
測(cè)定了這兩種蛋白質(zhì)的N末端的氨基酸序列，它們分別與EGF和VEGF的N末端氨基酸相同。
核苷酸和/或氨基酸序列表<110>孫嘉琳<120>一種可用以抗癌治療的超抗原融合蛋白質(zhì)及其生產(chǎn)方法<160>4<210>1<211>903<212>DNA<213>Human and Staphylococcus aureus<400>1aat tcc gat agc gag tgt cct ctg agt cac gat ggt tac tgt cta 45Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu1 5 10 15cat gac ggc gtc tgt atg tat att gag gct cta gac aag tac gcg 90His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala20 25 30tgt aat tgc gtt gtt ggc tac atc ggt gag cgc tgt cag tat cga 135Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg35 40 45gat ctg aaa tgg tgg gaa ctt aga ggt gga ggc ggt tca ggc gga 180Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly50 55 60ggt ggc tct ggc ggt ggc gga tcg agc gag aaa agc gaa gaa ata 225Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Lys Ser Glu Glu Ile65 70 75aat gaa aaa gat ttg cga aaa aag tct gaa ttg cag gga aca gct 270Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser Glu Leu Gln Gly Thr Ala80 85 90tta ggc aat ctt aaa caa atc tat tat tac aat gaa aaa gct aaa 315Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr Asn Glu Lys Ala Lys95 100 105
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權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，其特征在于同時(shí)含有促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子和能起抗癌的免疫反應(yīng)的超抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子為下述物質(zhì)之一細(xì)胞因子可以是表皮生長(zhǎng)因子EGF、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-α、白細(xì)胞介素-4和白細(xì)胞介素-2以及其它包括人和鼠等在內(nèi)的各種物種來(lái)源的與癌或其它疾病有關(guān)聯(lián)的細(xì)胞因子以及它們的自然變異體和人為的變異體，氨基酸序列有70％以上的相同性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的能起抗癌的免疫反應(yīng)的超抗原為下述物質(zhì)之一金黃色葡萄球菌腸毒素家族的SEA、SEB、SEC、SED、SEE，鏈球菌毒素的SPE-A、SPE-B、SPE-C，以及其它包括病毒蛋白質(zhì)在內(nèi)的各種來(lái)源的超抗原以及它們的自然和人為的變異體，氨基酸序列有70％以上的相同性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子為表皮生長(zhǎng)因子EGF和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF之一。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的能起抗癌的免疫反應(yīng)的超抗原為金黃色葡萄球菌腸毒素家族的SEA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于由能起抗癌的免疫反應(yīng)的超抗原金黃色葡萄球菌腸毒素家族的SEA跟促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子表皮生長(zhǎng)因子EGF和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF之一融合而成。
7.一種重組載體，其特征在于含有編碼權(quán)利要求1、權(quán)利要求2、權(quán)利要求3、權(quán)利要求4、權(quán)利要求5或者權(quán)利要求6所述的融合蛋白的氨基酸序列。
8.一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于宿主細(xì)胞被權(quán)利要求7所述的重組載體轉(zhuǎn)化。
9.一種生產(chǎn)融合蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于培養(yǎng)權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)化體，收集目標(biāo)物質(zhì)。
10.一種生產(chǎn)融合蛋白的純化方法，其特征在于權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)化體經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，利用Tag技術(shù)手段純化融合蛋白。
11.融合蛋白在癌癥以及免疫疾病等方面的治療藥物的應(yīng)用。
全文摘要
一種可用以抗癌治療的超抗原融合蛋白質(zhì)及其生產(chǎn)方法，本發(fā)明提出了一種構(gòu)建細(xì)胞因子和超抗原的融合蛋白質(zhì)的方法以及這種融合蛋白質(zhì)在大腸桿菌中表達(dá)和純化的方法。作為一種方法論，使用的材料是表皮生長(zhǎng)因子EGF和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF以及金黃色葡萄球菌腸毒素SEA，所構(gòu)建的是EGF－SEA和VEGF－SEA兩種融合蛋白質(zhì)形式。以上融合蛋白質(zhì)可應(yīng)用于癌癥治療，這個(gè)戰(zhàn)略就是利用與癌細(xì)胞緊密關(guān)連的細(xì)胞因子將超抗原定位到癌細(xì)胞上，從而在癌細(xì)胞周?chē)禺惖丶ぐl(fā)抗癌的免疫反應(yīng)。
文檔編號(hào)C07K14/485GK1629194SQ200310109829
公開(kāi)日2005年6月22日 申請(qǐng)日期2003年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月21日
發(fā)明者孫嘉琳 申請(qǐng)人:孫嘉琳