專利名稱：抗人前列腺特異性膜抗原胞外區(qū)單鏈抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程抗體，涉及一種抗人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)的 人源性單鏈抗體及其在前列腺癌診斷和治療藥物開發(fā)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
前列腺癌是當(dāng)今嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一，對于它的早期診斷和治療， 尤其是轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)灶的早期診斷和治療是人們難以攻克的醫(yī)學(xué)難題。隨著腫瘤免疫學(xué)和分 子生物學(xué)的不斷發(fā)展，尤其是噬菌體表面展示技術(shù)的不斷完善，為前列腺癌的早期診斷和 根治帶來了新的機遇。目前，抗前列腺癌抗體在國外正在進行臨床試驗，這些抗體基本上都 是人源化的鼠源性抗體。盡管人源化可以在很大程度上減少鼠源性抗體的免疫原性，但不 可能徹底去除其免疫原性，因而在臨床治療中不可避免地會導(dǎo)致中和抗體的出現(xiàn)從而降低 其治療價值。從前列腺癌患者構(gòu)建的人源性單鏈抗體庫中直接篩選高親和力的單鏈抗體無 疑成為前列腺癌的早期診斷、導(dǎo)向治療藥物研究的重要手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用噬菌體抗體庫技術(shù)篩選一種人前列腺特異性膜抗原(PSMA) 胞外區(qū)特異性人源性單鏈抗體。本發(fā)明的另一個目的是上述單鏈抗體在前列腺癌早期診斷和導(dǎo)向治療中的應(yīng)用。 利用該特異性人源性單鏈抗體可以特異性的檢測人前列腺特異性膜抗原(PSMA)的表達水 平，作為診斷前列腺癌的一個標(biāo)準(zhǔn)；同時利用該人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)特異 性人源性單鏈抗體作為生物載體，結(jié)合優(yōu)化的抗腫瘤藥物靶向輸送到前列腺癌細(xì)胞，定向 殺滅癌細(xì)胞，在前列腺癌的治療中發(fā)揮重要作用。本發(fā)明采用噬菌體表面展示技術(shù)，從前列腺癌患者外周血單個核細(xì)胞提取mRNA 并從中擴增出人的全套抗體可變區(qū)基因，然后裝配成單鏈抗體基因片段并克隆到噬粒載體 并轉(zhuǎn)化大腸桿菌構(gòu)建成一個大庫容量的人源性單鏈抗體庫。然后用重組人前列腺特異性膜 抗原(PSMA)胞外區(qū)進行篩選得到其特異性的高親和力抗體。該抗體可在大腸桿菌中可溶 性表達，該抗體的氨基酸序列如下LPVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSffHSSNAI
AWHQLRPEKGLRYLMKVNSDGSHNWGDGIPDRF
SGSSSGAERYLIISSLQSEDEADYYCQTffGTGIH
VVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLQ
SGGGVVRPGRSLRLSCAASGFTFSNYAMHffVR
QAPGKGLEWVAVMSYDGNNKYYADSVKGRFTIS
RDNSKNTLYLQMSSLRAGDTAVYYCARDLDIAA
RFHYCAMDVWGQGTAVTVSS
該氨基酸序列被命名為SEQ ID NO1O
本發(fā)明的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)特異性人源性單鏈抗體的重鏈可 變區(qū)基因編碼124個氨基酸，序列如下EVQLLQSGGGVVRPGRSLRLSCAASGFTFS NYA
MHffVRQAPGKGLEffVAVMSYDGNNKYYADSVK
GRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAGDTAVYYCAR
DLDIAARFHYCAMDVWGQGTAVTVSS
該氨基酸序列被命名為SEQ IDNO2。 本發(fā)明的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)特異性人源性單鏈抗體的輕鏈可 變區(qū)基因編碼112個氨基酸，序列如下L PVLTQSPSASASLGASVKLTC TLSSffHSSN A I
AffHQLRPEKGLRYLMKVNSDGSHNffGDGIPDR F
SGSSSGAERYLI ISSLQSEDEADYYCQTffGTG I H
VVFGGGTKLTVL
該氨基酸序列被命名為SEQ ID NO :3。
本發(fā)明的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)特異性人源性單鏈抗體由X753個核苷酸核且成，其序列如下
CTGCCTGTGCTGACTCAATCGCCCTCTGCCTCTGCCTCCCTGGGAGCCTCGGTCAAG
CTCACCTGCACTCTGAGCAGTTGGCACAGTAGCAACGCCATCGCATGGCATCAACT
GCGGCCAGAGAAGGGCCTTCGATATTTGATGAAAGTTAACAGTGATGGCAGCCACA
ACTGGGGAGACGGGATCCCTGATCGCTTCTCAGGCTCCAGCTCTGGGGCTGAGCGT
TACCTCATCATCTCCAGCCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGACC
TGGGGCACTGGCATTCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGG
CGGTGGCGGATCTGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGTGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGC
TGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCGGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCA
GCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGC
AAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATGTCATATGATGGAAATAATAAATACTACGC
AGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGT
ATCTGCAAATGAGCAGCCTGCGAGCTGGGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAGA
GATCTGGATATAGCAGCTCGTTTCCACTACTGCGCTATGGACGTCTGGGGCCAAGG
GACTGCGGTCACCGTCTCCTCA
本發(fā)明的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)特異性人源性單鏈抗體:重鏈可變區(qū)由372個核苷酸組成，其序列如下
GAGGTGCAGCTGCTGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCGGCCTGGGAGGTCCCTGAG
ACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGCTATGCACTGGGTCCG
CCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATGTCATATGATGGAAATA
ATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCC
AAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAGCAGCCTGCGAGCTGGGGACACGGCTGTATA
TTACTGTGCGAGA GATCTGGATATAGCAGCTCGTTTCCACTACTGCGCTATGGACGT
CTGGGGCCAAGGGACTGCGGTCACCGTCTCCTCA
本發(fā)明的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)特異性人源性單鏈抗體重鏈可變 區(qū)由GHV3-30，IGHD6-6和IGHJ6基因重排后形成的具有單一開放讀框的功能性可變區(qū)基 因。其中CDR3的核苷酸序列為GAT CTG GAT ATA GCA GCT CGT TTC，氨基酸序列為DLD I A A R F，由IGHD6-6和該抗體特有的序列組成。本發(fā)明的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)特異性人源性單鏈抗體輕鏈可變 區(qū)由339個核苷酸組成，其序列如下CTGCCTGTGCTGACTCAATCGCCCTCTGCCTCTGCCTCCCTGGGAGCCTCGGTCAAGCTCACCTGCACTCTGAGCAGTTGGCACAGTAGCAACGCCATCGCATGGCATCAACTGCGGCCAGAGAAGGGCCTTCGATATTTGATGAAAGTTAACAGTGATGGCAGCCACAACTGGGGAGACGGGATCCCTGATCGCTTCTCAGGCTCCAGCTCTGGGGCTGAGCGTTACCTCATCATCTCCAGCCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGACCTGGGGCACTGGCATTCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGC本發(fā)明的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)特異性人源性單鏈抗體輕鏈可變 區(qū)由IGLV4-69和IGLJ3基因片段重排后形成的具有單一開放讀框的功能性可變區(qū)基因。其 中CDR3的核苷酸序列為CAG ACC TGG GGC ACT GGC ATT，氨基酸序列為Q TW G T G I。本發(fā)明的抗人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)的人源性單鏈抗體可在前列腺 癌診斷和治療藥物開發(fā)中應(yīng)用。噬菌體抗體庫技術(shù)無需經(jīng)過雜交瘤技術(shù)，甚至無需經(jīng)過免疫過程即可直接獲得特 異性的高親和力抗體分子。單鏈抗體具有分子量小，穿透性強，半衰期短的優(yōu)勢，是理想的 腫瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的診斷試劑，也可以為導(dǎo)向藥物治療提供導(dǎo)向作用。而將篩選到的單 鏈抗體改造成全抗體后就會具有半衰期長，可直接介導(dǎo)補體及細(xì)胞免疫(ADCC)殺傷腫瘤 作用。因此，本發(fā)明中的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)特異性人源性單鏈抗體在前 列腺癌的早期診斷和導(dǎo)向治療中具有重要的價值。本發(fā)明的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)特異性人源性單鏈抗體可在噬菌 體表面呈現(xiàn)表達，也可以在大腸桿菌中可溶性表達。經(jīng)蛋白電泳和Western blot證實，IPTG 誘導(dǎo)后表達的可溶性單鏈抗體分子量約為30kD。經(jīng)ELISA和流式細(xì)胞儀分析表明該抗體 與重組人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)蛋白的親和力為Kd = 0. 2nM ；該抗體不僅可 以結(jié)合重組的PSMA胞外區(qū)，而且可以結(jié)合表面表達PSMA的NEK293細(xì)胞及前列腺癌細(xì)胞系 LNCaP。這為利用該抗體進行前列腺癌影像診斷和導(dǎo)向治療奠定了基礎(chǔ)。


圖1是本發(fā)明的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)特異性人源性單鏈抗體的 純化；泳道1 :Marker ；泳道2 流穿液；泳道3 第一遍洗滌；泳道4 第二遍洗滌；泳道5 純化的單鏈抗體。圖2是本發(fā)明的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)特異性人源性單鏈抗體與 重組人PSMA胞外區(qū)親和力測定。圖3是本發(fā)明的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)特異性人源性單鏈抗體與細(xì)胞表面表達的天然PSMA結(jié)合活性的鑒定；A 只用抗V5-APC染NEK293細(xì)胞；B 用本發(fā)明的單鏈抗體和抗V5-APC染NEK293 細(xì)胞；C 只用抗V5-APC染PSMA轉(zhuǎn)染的NEK293細(xì)胞；D 用本發(fā)明的單鏈抗體和抗V5-APC 染PSMA轉(zhuǎn)染的NEK293細(xì)胞；E 只用抗V5-APC染LNCaP細(xì)胞；F 用本發(fā)明的單鏈抗體和抗 V5-APC 染 LNCaP 細(xì)胞。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)特異性人源性單鏈抗體的 實施例進行詳細(xì)說明。實施例(一)淋巴細(xì)胞的分離收集50位前列腺癌患者的外周血共500ml，加入等體積的淋巴細(xì)胞分離液離心分 層，2500g，10min。小心吸取中層淋巴細(xì)胞，離心，2500g，lOmin。棄上清，用lmlTrizol/5ml 外周血裂解淋巴細(xì)胞，至溶液徹底透明為止。-80°C保存。(二)RNA 的提取取_70°C保存的淋巴細(xì)胞裂解液融化至室溫，加入0. 2ml氯仿/mlTrizol，votex振 蕩15s，室溫靜置3min，12000g，5min。吸上層清亮水相，注意勿混入中層蛋白及DNA層。加 Λ 0. 5ml 異丙醇 /ml Trizol，顛倒混勻，_20°C沉淀 30_60min，12000g 離心 IOmin0 保留沉 淀，70%的乙醇洗滌一遍，空氣中晾干，DEPC水溶解沉淀RNA。(三)mRNA的純化純化步驟為本領(lǐng)域的慣常技術(shù)，按(美國OMEGA)試劑盒說明書進行.(四)反轉(zhuǎn)錄取13yg mRNA于70°C保溫lOmin，使其打開二級結(jié)構(gòu)，然后迅速置于冰上，按說明 書依次加入各試劑，隨機6聚體進行反轉(zhuǎn)錄。室溫靜置IOmin使引物延伸，然后42°C 60mi 進行反轉(zhuǎn)錄，最后95°C 5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，冰浴5min，-20°C保存。(五)全套可變區(qū)基因擴增將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分成3份作為模板進行第一輪PCR，將VH、VL、VK的3’端引物分 別混合后與5’端各引物分別進行擴增。反應(yīng)條件為94°C 5min熱啟動，94°C Imin變性， 55 0C Imin退火，72°C Imin延伸，共35cycles。最后進一步延伸7min。反應(yīng)體系為100μ1。 將第一輪PCR的產(chǎn)物VH混合，VL和VK以1 2混合，分別作電泳純化回收，100倍稀釋后 作為第二輪PCR反應(yīng)的模板進行第二輪PCR反應(yīng)引入更長的保護序列及重疊延伸序列，條 件為:94°C 5min熱啟動，94°C Imin變性，55°C Imin退火，72°C Imin延伸，共25循環(huán)。反應(yīng) 體系為100 μ 1。(六)scFv(單鏈抗體)片斷的隨機拼接及擴增將VH、VL和VK基因片斷分別行2%的瓊脂糖凝膠電泳分離、回收，然后按 VH VK VL Llinker = 3 2 1 3的比例混合進行重疊延伸以裝配scFv片斷， 條件為94°C Imin變性，55°C Imin退火，72°C Imin延伸，共7個循環(huán)。將重疊延伸產(chǎn)物行 1 100稀釋，以此作模板，以VL 5’端和VH 3’端的保護序列為引物擴增scFv片斷，PCR 反應(yīng)條件是94°C 5min熱啟動，94°C Imin變性，65°C Imin退火，72°C Imin延伸，10個循環(huán)后，再將退火溫度降到58°C后進行15個循環(huán)。PCR產(chǎn)物即為單鏈抗體基因片斷，用1.5%的 瓊脂糖凝膠回收。(七)scFv與噬粒載體的連接及單鏈抗體庫的制備1.電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備從M9平板上挑取TGl單克隆搖菌過夜，1 100轉(zhuǎn)接于500ml LB，振搖2. 5h，OD6tltl 的值在0. 5-0. 6之間，離心收菌，3000rpm, IOmin0用等體積的冰冷ImM的HEPES洗滌兩遍， 3000rpm, lOmin，用1/10體積的冰冷10%甘油洗滌兩遍，4000rpm，lOmin，用與沉淀等體積 的冰冷10%甘油重懸沉淀，每管50μ 1于-80°c保存。注感受態(tài)制備均在0-4°C進行。2.單鏈抗體庫的制備將上述純化的單鏈抗體基因片段用Sfi I/Not I酶切，并與經(jīng)相同酶切開的噬粒 載體PCANTAB5E連接。將連接產(chǎn)物于70°C孵育IOmin滅活T4DNA連接酶，然后電轉(zhuǎn)化大腸 桿菌TGl。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌涂布到含葡萄糖和100mg/L氨芐的2YT平板上，30°C培養(yǎng)過 夜，次日用含15%甘油的2YT將克隆刮下來凍存到-80°C保存。3.抗體庫的噬菌體表面呈現(xiàn)接種3X IOiq的細(xì)菌抗體庫于1500ml 2YTGA(2YT+1 %葡萄糖+amp)中，37°C振搖 至0D600 = 0. 5。取150ml (0D600 = 0. 1的細(xì)菌濃度是8 X IO7)用輔助性噬菌體M13K07以 20 1的比例于37°C靜置水浴30min進行感染。然后3300g，IOmin室溫離心，棄上清，將細(xì) 菌沉淀再分別接到30°C預(yù)熱的1500ml的2YTGAK(2YT+1 %葡萄糖+amp+kan)中，30°C振搖 過夜(應(yīng)達到12小時)。次日，IOmin離心(4°C )，收上清。在上清中加入1/5體積的PEG/ NaCl (20%的PEG6000，2. 5M的NaCl)，混勻，4°C靜置1小時以上沉淀噬菌體。然后IOOOOrpm 于4°C離心15min，收集噬菌體沉淀并重懸于5ml PBS中。IOOOOrpm再次離心15min，取上 清(沉淀為殘留的細(xì)菌碎片及PEG)，放于4°C備篩庫用。同時取Iul倍比稀釋進行滴度分 析。(八)噬菌體抗體庫滴度測定從M9培養(yǎng)基上挑取TGl單克隆于5ml 2YT，振搖過夜。取0. 5ml過夜菌接種于50ml 2YT (100ml三角燒瓶)中，37°C振搖至0D600 = 0. 2。將噬菌體抗體庫做十倍倍比稀釋，從 各個稀釋度各取10 μ 1加入到200 μ 1 0D600 = 0. 2的TGl中，混勻，37°C水浴30min。將這 200 μ 1細(xì)菌和噬菌體的混合液涂布到含氨芐的2ΤΥ瓊脂平板上。倒置放于37°C，第二天根 據(jù)克隆數(shù)計算噬菌體庫的滴度。(九)輔助性噬菌體M13K07的制備從M9培養(yǎng)基上挑取TGl單克隆于5ml 2YT，振搖過夜。取0. 5ml過夜菌接種于 50ml2YT (100ml三角燒瓶)中，37°C振搖至0D600 = 0. 2。將M13K07十倍倍比稀釋，從各 個稀釋度各取10 μ 1加入到200 μ 1 0D600 = 0. 2的TGl中，混勻，37°C水浴30min。將這 200 μ 1細(xì)菌和噬菌體的混合液加入到3ml不燙手的上層瓊脂膠中，稍微晃一下，立即倒入 37°C預(yù)熱的用2TY配制的瓊脂平板上。倒置放于37°C，第二天可出現(xiàn)噬斑。挑取單個噬斑 接種于3-4ml 0D600 = 0. 5的TGl中(制備方法同前，即前一晚從M9上挑克隆，搖菌過夜， 第二天1 100轉(zhuǎn)接于50ml 2YT中，振搖約2-2. 5小時)，37°C振搖2小時。將這3_4ml 感染了 M13K07的TGl接種于500ml 2YT中，37°C振搖1小時。加入卡那(50-70 μ g/ml)， 繼續(xù)于37°C振搖8-16小時，IOOOOrpm,離心15min，收上清。上清中加入1/5體積的PEG/NaCl(20%&PEG6000，2. 5M 的 NaCl)，混勻，4°C靜置 1 小時以上，lOOOOrpm，離心 15min。用 20ml含15%甘油的PBS重懸噬菌體，lOOOOrpm，離心15-20min，收集上清(沉淀為細(xì)菌碎片 及PEG)。噬菌體溶液經(jīng)0. 45 μ m濾膜過濾消毒后分裝，凍存于_80°C，同時用噬斑的方法測 其滴度。(十)特異性抗體的篩選用5ml 50ug/ml的抗原(第一輪)包被25cm2培養(yǎng)瓶，4°C過夜(包被液為200mM 的碳酸氫鈉緩沖液，PH9. 6)，第二輪以后包被的抗原濃度降低到5ml lOug/ml。PBST洗滌 后加入5ml含1 X IO14噬菌體的4% MPBS,脫色搖床上輕晃30min后室溫水平放置90min以 上進行抗原抗體的結(jié)合。然后用PBS和PBST各洗20遍，最后將生長至對數(shù)生長期的IOml TGl加入培養(yǎng)瓶并于30°C水浴30min讓結(jié)合于抗原的噬菌體感染TG1。被感染的TGl經(jīng)離 心后涂布于15cm 2YTGA平板上，30°C過夜。再用輔助性噬菌體超感染的方法從被感染并擴 增了的TGl制備噬菌體，進行第二輪篩選。如此反復(fù)進行“吸附_洗脫_感染_繁殖”的篩 選過程共4輪。(十一)單克隆噬菌體抗體抗原結(jié)合活性的鑒定1.單克隆噬菌體抗體的制備從最后一輪篩選的板子上挑選單個克隆于裝有2YTGA的96孔培養(yǎng)板中，37°C振搖 過夜，次日1 100轉(zhuǎn)接于新的2YTGA中，37°C振搖2. 5小時，用M13K07以20 1的比例進 行超感染，3500轉(zhuǎn)，離心lOmin，用200ul 2YTGAK重懸細(xì)菌沉淀，30°C振搖過夜。次日11000 轉(zhuǎn)離心15min，取上清進行phage ELISA鑒定。2. Phage ELISA鑒定抗原抗體結(jié)合活性用PSMA于4°C過夜包被ELISA板，每孔50ul，濃度為lug/ml。次日用含5%脫脂奶 粉的PBS加滿孔室溫封閉2小時，PBST洗5遍，用含2%脫脂奶粉的PBS稀釋抗體，將稀釋 好的抗體室溫放置30分鐘。用PBST洗板6次然后加入抗體200ul，室溫孵育2小時，PBST 洗板，6次。加入HRP標(biāo)記的抗M13噬菌體的抗體200ul，稀釋度為1 5000。室溫孵育1 小時，PBST洗板8次后加TMB顯色·(十二)可溶性單鏈抗體的表達陽性噬菌體需要感染HB2151才能進行可溶性表達。陽性克隆的噬菌體作10或 100倍倍比稀釋后過0. 45的濾膜(過濾膜這一步是為了去除混雜在噬菌體里的TGl大腸桿 菌.TGl比HB2151有生長優(yōu)勢，所以要去掉它)，取稀釋好的10 μ 1去感染200 μ 1對數(shù)生長 期的ΗΒ2151。方法如下生長于Μ9培養(yǎng)基上的ΗΒ2151單克隆于5ml2YTG中，次日1 100 轉(zhuǎn)接于50ml 2YTG，37°C振搖至0D600 = 0. 5。加入10 μ 1經(jīng)濾過的、倍比稀釋過的噬菌體， 混勻，37°C水浴30min。鋪涂有奈定酮酸和氨芐的2YTG瓊脂板，37°C過夜。挑單克隆于5ml 2YTGA(含葡萄糖)中，37°C搖過夜。次日1 100轉(zhuǎn)接于50ml含0. 1 %葡萄糖的2YTGA 中，37°C振搖至0D600 = 0. 9 (大約3小時40分)，加入IPTG至終濃度為ImM，30°C振搖過 夜，取上清做行聚丙烯酰氨凝膠電泳分析表達情況，用ELISA鑒定可溶性表達的單鏈抗體 的抗原結(jié)合活性。(十四)可溶性單鏈抗體的純化由于單鏈抗體是與6個組氨酸的標(biāo)簽融合表達的，所以可溶性表達上清可以用鎳 柱進行親和純化，具體步驟為用PBS平衡親和柱，樣品上柱，50mM的咪唑洗脫非特異的結(jié)合蛋白，500mM的咪唑洗脫下結(jié)合于鎳柱上的單鏈抗體，用分子篩去除咪唑，緩沖液置換為 PBS0 (見圖 1)(十五)可溶性單鏈抗體的親和力鑒定用lug/m 1和0. 5ug/ml兩種不同濃度的PSMA包被ELISA板，然后加入從lug/ml 到lpg/ml十倍倍比稀釋的純化過的單鏈抗體，然后加入抗V5-HRP抗體(單鏈抗體與V5標(biāo) 簽融合表達)，最后用TMB顯示。根據(jù)ELISA讀數(shù)繪制親和力曲線，然后求出0D50時Iug/ ml和0. 5ug/ml PSMA對應(yīng)的抗體濃度，分別記為[Ab](對應(yīng)于lug/ml PSMA)和[Ab] ’ (對 應(yīng)于0. 5ug/ml PSMA)，然后用公式Kd = 2[Ab]，-[Ab]計算單鏈抗體的親和力。(見圖2)(十六)可溶性抗體與細(xì)胞表面表達的天然PSMA結(jié)合活性的鑒定由于重組PSMA的構(gòu)象可能不同于表達于前列腺癌細(xì)胞表面PSMA的天然構(gòu)象，所 以具有與重組PSMA結(jié)合活性的scFv可能并不能結(jié)合表達于細(xì)胞表面的PSMA。因而為了 鑒定我們篩選到的單鏈抗體與天然表達于細(xì)胞表面PSMA的結(jié)合活性，我們用流式細(xì)胞技 術(shù)對該抗體與NEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染了 PSMA的NEK293細(xì)胞及前列腺癌細(xì)胞系LNCaP的結(jié)合活 生進行了比較。方法是將該抗體與上述三種細(xì)胞孵育1小時，對照組不加該抗體，然后用抗 V5-APC抗體染色，最后用流式細(xì)胞儀比較APC信號的強弱。(見圖3A-F)
0108]需要說明的是，本發(fā)明提供的附圖1是在凝膠成像儀下采集的圖片，圖3A-F是流 式細(xì)胞儀檢測后自動生成的圖片，為醫(yī)學(xué)研究最清晰的圖片。
0109]以上實施例中未作詳細(xì)敘述部分屬于本行業(yè)或相關(guān)行業(yè)的公知技術(shù)，采用的設(shè)備 是行業(yè)慣例設(shè)備。
0110]序列表
0111]USEQ ID :1ο
0112]序列
0113]LPVLTQSPSASASLGASVKLTC TLSSffHSSNAI
0114]AffHQLRPEKGLRYLMKVNSDGSHNffGDGIPDRF
0115]SGSSSGAERYLIISSLQSEDEADYYCQTWGTGIH
0116]VVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLQ
0117]SGGGVVRPGRSLRLSCAASGFTFS NYAMHffVR
0118]QAPGKGLEWVAVMSYDGNNKYYADSVKGRFTIS
0119]RDNSKNTLYLQMSSLRAGDTAVYYCARDLDIAA
0120]RFHYCAMDVffGQGTAVTVSS
0121]由753個核苷酸組成，其序列如下
0122]CTGCCTGTGCTGACTCAATCGCCCTCTGCCTCTGCCTCCCTGGGAGCCTCGGTCAAG
0123]CTCACCTGCACTCTGAGCAGTTGGCACAGTAGCAACGCCATCGCATGGCATCAACT
0124]GCGGCCAGAGAAGGGCCTTCGATATTTGATGAAAGTTAACAGTGATGGCAGCCACA
0125]ACTGGGGAGACGGGATCCCTGATCGCTTCTCAGGCTCCAGCTCTGGGGCTGAGCGT
0126]TACCTCATCATCTCCAGCCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGACC
0127]TGGGGCACTGGCATTCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGG
0128]CGGTGGCGGATCTGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGTGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGC
0129]TGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCGGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCA
GCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATGTCATATGATGGAAATAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAGCAGCCTGCGAGCTGGGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAGAGATCTGGATATAGCAGCTCGTTTCCACTACTGCGCTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACTGCGGTCACCGTCTCCTCA2, SEQ ID NO 20序列EVQLLQSGGGVVRPGRSLRLSCAASGFTFS NYAMHWVRQAPGKGLEWVAVMSYDGNNKYYADSVKGRFTISR DN SKNTLYLQMSSLRAGDTAVYYCARDLDlAARFHYCAMDVffGQGTAVTVSS由372個核苷酸組成，其序列如下GAGGTGCAGCTGCTGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCGGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATGTCATATGATGGAAATAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAGCAGCCTGCGAGCTGGGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAGAGATCTGGATATAGCAGCTCGTTTCCACTACTGCGCTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACTGCGGTCACCGTCTCCTCA本發(fā)明的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)特異性人源性單鏈抗體重鏈可變 區(qū)由GHV3-30，IGHD6-6和IGHJ6基因重排后形成的具有單一開放讀框的功能性可變區(qū)基 因。其中CDR3的核苷酸序列為GAT CTG GAT ATA GCA GCT CGT TTC，氨基酸序列為D L D I A A R F，由IGHD6-6和該抗體特有的序列組成。
0151]3, SEQ ID NO 3
0152]序列
0153]LPVLTQSPSASASLGASVKLTC TLSSffHSSNAI
0154]AffHQLRPEKGLRYLMKVNSDGSHNffGDGIPDRF
0155]SGSSSGAERYLIISSLQSEDEADYYCQTWGTGIH
0156]VVFGGGTKLTVL
0157]由339個核苷酸組成，其序列如下
0158]CTGCCTGTGCTGACTCAATCGCCCTCTGCCTCTGCCTCCCTGGGAGCCTCGGTCAAG
0159]CTCACCTGCACTCTGAGCAGTTGGCACAGTAGCAACGCCATCGCATGGCATCAACT
0160]GCGGCCAGAGAAGGGCCTTCGATATTTGATGAAAGTTAACAGTGATGGCAGCCACA
0161]ACTGGGGAGACGGGATCCCTGATCGCTTCTCAGGCTCCAGCTCTGGGGCTGAGCGT
0162]TACCTCATCATCTCCAGCCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGACC
0163]TGGGGCACTGGCATTCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGG
0164]C
0165]本發(fā)明的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)特異性人源性單鏈抗體輕鏈可變區(qū)由IGLV4-69和IGLJ3基因片段重排后形成的具有單一開放讀框的功能性可變區(qū)基因。其 中CDR3的核苷酸序列為CAG ACC TGG GGC ACT GGC ATT，氨基酸序列為Q TW G T G I。
權(quán)利要求
一種抗人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)的人源性單鏈抗體，起特征在于該單鏈抗體的氨基酸序列為SEQ ID；1該抗體的氨基酸序列如下L P V L T Q S P S A S A S L G A S V K L T C T L S S W H S S N A IA W H Q L R P E K G L R Y L M K V N S D G S H N W G D G I P D R FS G S S S G A E R Y L I I S S L Q S E D E A D Y Y C Q T W G T G I HV V F G G G T K L T V L G G G G S G G G G S G G G G S E V Q L L QS G G G V V R P G R S L R L S C A A S G F T F S N Y A M H W V RQ A P G K G L E W V A V M S Y D G N N K Y Y A D S V K G R F T I SR D N S K N T L Y L Q M S S L R A G D T A V Y Y C A R D L D I A AR F H Y C A M D V W G Q G T A V T V S S
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)的人源性單鏈抗體， 其特征在于該抗體的重鏈可變區(qū)按技術(shù)序列為SEQ ID NO :2，序列如下EVQLLQSGGGVVRPGRSLRLSCAASGFTFSNYAMHWVRQAPGKGLEWVAVMSYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAGDTAVYYCARDLDIAARFHYCAMDVWGQGTAVTVSS
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)的人源性單鏈抗體， 其特征在于該抗體的輕鏈可變區(qū)按技術(shù)序列為SEQ ID NO :3，序列如下LPVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSWHSSNA IAWHQLRPEKGLRYLMKVNSDGSHNWGDGIPDR FSGSSSGAERYLIISSLQSEDEADYYCQTWGTG I HVVFGGGTKLTVL
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)的人源性單鏈抗體， 其特征在于所述人源性單鏈抗體由X753個核苷酸組成，其序列如下 CTGCCTGTGCTGACTCAATCGCCCTCTGCCTCTGCCTCCCTGGGAGCCTCGGTCAAG CTCACCTGCACTCTGAGCAGTTGGCACAGTAGCAACGCCATCGCATGGCATCAACT GCGGCCAGAGAAGGGCCTTCGATATTTGATGAAAGTTAACAGTGATGGCAGCCACA ACTGGGGAGACGGGATCCCTGATCGCTTCTCAGGCTCCAGCTCTGGGGCTGAGCGT TACCTCATCATCTCCAGCCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGACC TGGGGCACTGGCATTCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGG CGGTGGCGGATCTGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGTGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGC TGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCGGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCA GCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGC AAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATGTCATATGATGGAAATAATAAATACTACGC AGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGT ATCTGCAAATGAGCAGCCTGCGAGCTGGGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAGA GATCTGGATATAGCAGCTCGTTTCCACTACTGCGCTATGGACGTCTGGGGCCAAGG GACTGCGGTCACCGTCTCCTCA
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)的人源性單鏈抗體， 其特征在于所述人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)特異性人源性單鏈抗體重鏈可變 區(qū)由372個核苷酸組成，其序列如下GAGGTGCAGCTGCTGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCGGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATGTCATATGATGGAAATAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAGCAGCCTGCGAGCTGGGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAGAGATCTGGATATAGCAGCTCGTTTCCACTACTGCGCTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACTGCGGTCACCGTCTCCTCA
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)的人源性單鏈抗體， 其特征在于所述人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)特異性人源性單鏈抗體重鏈可變 區(qū)由GHV3-30，IGHD6-6和IGHJ6基因重排后形成的具有單一開放讀框的功能性可變區(qū)基 因；其中CDR3的核苷酸序列為GAT CTG GAT ATA GCA GCT CGTTTC，氨基酸序列為DLDI A A R F，由IGHD6-6和該抗體特有的序列組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)的人源性單鏈抗體， 其特征在于所述人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)特異性人源性單鏈抗體輕鏈可變 區(qū)由339個核苷酸組成，其序列如下CTGCCTGTGCTGACTCAATCGCCCTCTGCCTCTGCCTCCCTGGGAGCCTCGGTCAAGCTCACCTGCACTCTGAGCAGTTGGCACAGTAGCAACGCCATCGCATGGCATCAACTGCGGCCAGAGAAGGGCCTTCGATATTTGATGAAAGTTAACAGTGATGGCAGCCACAACTGGGGAGACGGGATCCCTGATCGCTTCTCAGGCTCCAGCTCTGGGGCTGAGCGTTACCTCATCATCTCCAGCCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGACCTGGGGCACTGGCATTCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGC
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)的人源性單鏈抗體， 其特征在于所述人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)特異性人源性單鏈抗體輕鏈可變 區(qū)由IGLV4-69和IGLJ3基因片段重排后形成的具有單一開放讀框的功能性可變區(qū)基因；其 中CDR3的核苷酸序列為CAG ACC TGG GGC ACT GGC ATT，氨基酸序列為Q T W G T G I。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)的人源性單鏈抗體 在前列腺癌診斷和治療藥物開發(fā)中的應(yīng)用。全文摘要
本發(fā)明的抗人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區(qū)單鏈抗體是采用噬菌體展示技術(shù)，以前列腺癌患者的外周血單個核細(xì)胞為原料構(gòu)建的大庫容量的單鏈抗體庫通過先松弛后嚴(yán)謹(jǐn)?shù)暮Y選富集得到的。該抗體可在大腸桿菌中可溶性表達，與前列腺特異性膜抗原胞外區(qū)的親和力達到Kd＝0.2nM。該抗體不僅可以結(jié)合重組的PSMA胞外區(qū)，而且可以結(jié)合表面表達PSMA的NEK293細(xì)胞及前列腺癌細(xì)胞系LNCaP。這為利用該抗體進行前列腺癌影像診斷和導(dǎo)向治療奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C07K16/28GK101891818SQ20091002093
公開日2010年11月24日 申請日期2009年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月16日
發(fā)明者溫偉紅, 秦衛(wèi)軍, 董青川, 趙愛志 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)