一種癌胚抗原含量檢測(cè)方法及裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種癌胚抗原的檢測(cè)方法與裝置：方法包括以下步驟：（1）將熒光物質(zhì)和連接劑均勻混合，再與癌胚抗原適配體溶液混合；（2）將混合液與氧化石墨烯溶液均勻混合，使得熒光淬滅，得到癌胚抗原適配體-熒光物/氧化石墨烯溶液；（3）將待測(cè)樣品與癌胚抗原適配體-熒光物/氧化石墨烯溶液混合均勻恢復(fù)熒光；（4）進(jìn)行毛細(xì)管電泳，距陽(yáng)極為毛細(xì)管總長(zhǎng)的1/2-2/3處進(jìn)行熒光檢測(cè)，測(cè)定癌胚抗原濃度。裝置包括毛細(xì)管電泳裝置和熒光檢驗(yàn)裝置，毛細(xì)管電泳裝置其毛細(xì)管總長(zhǎng)50-100cm，內(nèi)徑為50-100μm，距陽(yáng)極緩沖液池的距離為毛細(xì)管總長(zhǎng)的1/2-2/3處設(shè)有檢測(cè)窗口，熒光檢測(cè)裝置設(shè)置在毛細(xì)管檢測(cè)窗口處。本發(fā)明靈敏度高，檢出限低，檢測(cè)效率高，可應(yīng)用于癌癥早期篩查。
【專利說(shuō)明】一種癌胚抗原含量檢測(cè)方法及裝置
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)分析檢測(cè)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種癌胚抗原含量檢測(cè)方法及裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]癌胚抗原(CEA)是一種廣譜性的腫瘤標(biāo)記物，其對(duì)大腸癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、卵巢癌等多種腫瘤的診斷和篩查方面具有重要的參考意義，對(duì)術(shù)后的療效判斷、病情發(fā)展、檢測(cè)和預(yù)后估計(jì)是一個(gè)較好的標(biāo)記物。因此對(duì)其進(jìn)行高靈敏度高特異性的檢測(cè)對(duì)臨床醫(yī)學(xué)有
著非常重要的意義。
[0003]目前，檢測(cè)癌胚抗原含量的方法有免疫分析法，如色度免疫法、熒光免疫法、電化學(xué)免疫分析法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法、電化學(xué)發(fā)光免疫分析法等，還有基于癌胚抗原適配體和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)原理的傳感檢測(cè)技術(shù)。其中基于癌胚抗原適配體和FRET的檢測(cè)方法，由于適配體特異性識(shí)別靶分子的特點(diǎn)，可以特異性地分析檢測(cè)癌胚抗原。[0004]然而對(duì)因?yàn)槌Ｒ?guī)的FRET測(cè)量方法，由于被靶分子從猝滅劑上特異性競(jìng)爭(zhēng)下來(lái)的熒光供體，其熒光仍然可以被溶液中存在的猝滅劑不同程度的猝滅，低濃度的靶分子不能產(chǎn)生有效的熒光恢復(fù)，因此目前基于適配體和FRET的癌胚抗原檢測(cè)的檢測(cè)靈敏度較低，不足以滿足癌癥早期低濃度癌胚抗原的檢測(cè)要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進(jìn)需求，本發(fā)明提供了一種癌胚抗原檢測(cè)方法及裝置，其目的在于結(jié)合毛細(xì)管電泳分離的手段和適配體/氧化石墨烯傳感技術(shù)，檢測(cè)低含量的癌胚抗原，由此解決目前癌胚抗原檢測(cè)的技術(shù)靈敏度低，不能檢測(cè)早期癌癥的問(wèn)題。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種癌胚抗原的檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0007](I)制備癌胚抗原適配體-熒光物:將濃度為10_7M-10_5M熒光物質(zhì)和連接劑溶液均勻混合，再將該混合液與癌胚抗原適配體的緩沖溶液混合均勻，使得熒光物質(zhì)、連接劑、癌胚抗原適配體的摩爾比在1:200~1000:5~20，熒光物質(zhì)的最終濃度在10-8Μ至I(T5M,連接劑的最終濃度在0.025mg/ml至0.05mg/ml,癌胚抗原適配體的最終濃度在5X 10_8M至2X10_4M;熒光物和適配體之間發(fā)生縮合反應(yīng)，除去過(guò)量的癌胚抗原適配體，得到含癌胚抗原適配體-熒光物的緩沖液；
[0008](2)制備癌胚抗原適配體-熒光物/氧化石墨烯溶液:將步驟(1)中制備的含癌胚抗原適配體-熒光物的緩沖液與氧化石墨烯溶液均勻混合，反應(yīng)I至8小時(shí)，氧化石墨烯使得癌胚抗原適配體-熒光物熒光淬滅，得到癌胚抗原適配體-熒光物/氧化石墨烯溶液；
[0009](3)制備毛細(xì)管電泳樣品:將待測(cè)樣品與步驟(2)中制備的癌胚抗原適配體-熒光物/氧化石墨烯溶液混合均勻，反應(yīng)2至8小時(shí)從而恢復(fù)熒光，得到毛細(xì)管電泳樣品；
[0010](4)檢測(cè)恢復(fù)熒光強(qiáng)度:將毛細(xì)管電泳樣品進(jìn)行毛細(xì)管電泳，距陽(yáng)極緩沖液池的距離為毛細(xì)管總長(zhǎng)的1/2-2/3處進(jìn)行熒光檢測(cè)，獲得恢復(fù)熒光強(qiáng)度，根據(jù)恢復(fù)熒光強(qiáng)度，按照熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定癌胚抗原濃度。
[0011]優(yōu)選地，所述癌胚抗原的檢測(cè)方法，其步驟(I)中熒光物質(zhì)、連接劑與癌胚抗原適配體的摩爾比為1:200:5。
[0012]優(yōu)選地，所述癌胚抗原的檢測(cè)方法，其步驟(I)所述熒光物質(zhì)為有機(jī)熒光染料或無(wú)機(jī)熒光納米顆粒，常用為硒化鎘、碲化鎘、硫化鎘、硫化鋅、硒化鋅、碲化鋅、硫化汞、硒化汞、碲化汞、砷化鎵、砷化銦、碳化硅、硒化鉛、硒化鎂、硫化鋅包被硒化鎘核殼型(CdSe/ZnS )、硫化鋅包碲化鎘核殼型(CdTe/ZnS)、碳點(diǎn)、納米金簇、納米銀簇、熒光石墨烯或復(fù)合熒光二氧化硅納米粒子，優(yōu)選為半導(dǎo)體量子點(diǎn)。
[0013]優(yōu)選地，所述癌胚抗原的檢測(cè)方法，其步驟(I)所述連接劑為1-乙基-3- (3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽與N-羥基硫代琥珀酰亞胺的混合物，其中按照摩爾比，N-羥基硫代琥珀酰亞胺不超過(guò)50%。
[0014]優(yōu)選地，所述癌胚抗原的檢測(cè)方法，其所述步驟(2)其氧化石墨烯溶液濃度為40-60 μ g/mL。
[0015]優(yōu)選地，所述癌胚抗原的檢測(cè)方法，其步驟(4)毛細(xì)管電泳使用的毛細(xì)管為內(nèi)徑在50-100 μ m之間的彈性聚酰亞胺涂層熔融石英管。
[0016]優(yōu)選地，所述癌胚抗原的檢測(cè)方法，其步驟(4)毛細(xì)管電泳其電場(chǎng)強(qiáng)度在150-400V/cm間，電泳溫度恒定在20-30 °C間，陽(yáng)極、陰極及電泳緩沖液為ρΗ8.4-9.2的Na2B4O7-H3BO3溶液，虹吸進(jìn)樣高度15cm、時(shí)間15_35s。
[0017]優(yōu)選地，所述癌胚抗原的檢測(cè)方法，其步驟(4)距陽(yáng)極緩沖液池的距離為毛細(xì)管總長(zhǎng)的7/12處進(jìn)行熒光檢測(cè)。
[0018]按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種癌胚抗原檢測(cè)裝置，其特征在于，包括毛細(xì)管電泳裝置和突光檢驗(yàn)裝置，所述毛細(xì)管電泳裝置，其毛細(xì)管總長(zhǎng)50-100cm,內(nèi)徑為50-100 μ m，進(jìn)樣口高于毛細(xì)管15cm，所述毛細(xì)管上距陽(yáng)極緩沖液池的距離為毛細(xì)管總長(zhǎng)的1/2-2/3處設(shè)有檢測(cè)窗口，熒光檢測(cè)裝置設(shè)置在毛細(xì)管檢測(cè)窗口處。
[0019]優(yōu)選地，所述癌胚抗原檢測(cè)裝置，其毛細(xì)管為彈性聚酰亞胺涂層熔融石英管。
[0020]總體而言，通過(guò)本發(fā)明所構(gòu)思的以上技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，能夠取得下列有益效果:
[0021](I)由于采用毛細(xì)管電泳技術(shù)，可使氧化石墨烯淬滅劑與適配體熒光物質(zhì)逐漸分離，從而減小淬滅劑對(duì)恢復(fù)熒光的影響，能更準(zhǔn)確真實(shí)的獲得恢復(fù)熒光強(qiáng)度，得到更準(zhǔn)確的癌胚抗原檢測(cè)結(jié)果。
[0022](2)毛細(xì)管電泳技術(shù)，還能分離癌胚抗原和樣品中其他血清蛋白，因此本檢測(cè)方法噪聲小，信噪比高。
[0023](3)本發(fā)明提供的檢測(cè)方法，通過(guò)合理選擇熒光檢測(cè)窗口的位置，兼顧了分離效果和分離時(shí)間，檢測(cè)結(jié)果可靠，檢測(cè)效率高。
[0024](4)本發(fā)明提供的檢測(cè)方法，結(jié)合了毛細(xì)管電泳和癌胚抗原適配體/氧化石墨烯傳感技術(shù)，特異性高，檢出限低，檢出限為5pg/ml，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，檢測(cè)性能提高了 100至1000倍。因此本發(fā)明可應(yīng)用于癌癥早期篩查。
[0025](4)本發(fā)明提供的檢測(cè)裝置，需要的檢測(cè)樣品量小，制造簡(jiǎn)單，檢測(cè)靈敏。同時(shí)本裝 置高度模塊化，維護(hù)簡(jiǎn)單。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1是本發(fā)明提供的癌胚抗原檢測(cè)方法流程圖；
[0027]圖2是本發(fā)明提供的癌胚抗原檢測(cè)裝置結(jié)構(gòu)示意圖。
[0028]在所有附圖中，相同的附圖標(biāo)記用來(lái)表示相同的元件或結(jié)構(gòu)，其中:1為高壓電源，2為鉬電極,3為陽(yáng)極電解液池,4為陰極電解液池,5為毛細(xì)管,6為進(jìn)樣口，7為熒光顯微鏡，8為光電轉(zhuǎn)換器。
【具體實(shí)施方式】
[0029]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個(gè)實(shí)施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。
[0030]本發(fā)明提供的癌胚抗原檢測(cè)方法，如圖1所示，包括以下步驟:
[0031](I)制備癌胚抗原適配體-熒光物:將濃度為10_7M-10_5M熒光物質(zhì)和連接劑混合，將該混合液與癌胚抗原適配體的緩沖溶液混合均勻，使得熒光物質(zhì)、連接劑和癌胚抗原適配體的摩爾比為1:200?1000:5?20，優(yōu)選為1:200: 5，熒光物質(zhì)的最終濃度在KT8M至10_5M,連接劑的最終濃度在0.025mg/ml至0.05mg/ml,癌胚抗原適配體的最終濃度在5X 10_8M至2X 10_4M。熒光物和癌胚抗原適配體發(fā)生縮合反應(yīng)，反應(yīng)2到4小時(shí)后，將混合液離心超濾，除去過(guò)量的癌胚抗原適配體，得到含癌胚抗原適配體-熒光物的緩沖液。
[0032]所述癌胚抗原適配體是一段能與癌胚抗原特異性結(jié)合的單鏈DNA片段，獲取方法參“DNA Aptamers Selected as Molecular Probes for CancereousCells，，(Word Applied Sciences Journal8, Special Issue of Biotechnology&GeneticEngineering: 16-21，2010)。所述熒光物質(zhì)為有機(jī)熒光染料或無(wú)機(jī)熒光納米顆粒，常用為硒化鎘、締化鎘、硫化鎘、硫化鋅、硒化鋅、締化鋅、硫化萊、硒化萊、締化萊、砷化鎵、砷化銦、碳化硅、硒化鉛、硒化鎂、硫化鋅包被硒化鎘核殼型(CdSyznS )、硫化鋅包碲化鎘核殼型(CdTyZnS)、碳點(diǎn)、納米金簇、納米銀簇、熒光石墨烯、復(fù)合熒光二氧化硅納米粒子等，優(yōu)選為半導(dǎo)體量子點(diǎn)。所述連接劑為1-乙基-3- (3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽與N-羥基硫代琥珀酰亞胺的混合物，其中按照摩爾比，N-羥基硫代琥珀酰亞胺不超過(guò)50%。所述緩沖溶液優(yōu)選為0.2M的磷酸鹽緩沖溶液，其pH值在7.4至8.4之間。
[0033](2)制備癌胚抗原適配體-熒光物/氧化石墨烯溶液:將步驟(I)中制備的含癌胚抗原適配體-熒光物的緩沖液與濃度為40-60 μ g/mL的氧化石墨烯溶液，均勻混合，反應(yīng)I至8小時(shí)，優(yōu)選為4小時(shí)，使得癌胚抗原適配體-熒光物熒光淬滅，剛好猝滅適配體-熒光物的熒光所需氧化石墨烯的量為最佳濃度，得到癌胚抗原適配體-熒光物/氧化石墨烯溶液。
[0034](3)制備毛細(xì)管電泳樣品:將采集的生物樣品經(jīng)0.22 μ m濾膜過(guò)濾后，稀釋I至50倍，使得樣品中癌胚抗原濃度落在檢出范圍之內(nèi)制得待檢測(cè)樣品，將待檢測(cè)樣品與步驟(2)中制備的癌胚抗原適配體-熒光物/氧化石墨烯溶液混合均勻，反應(yīng)2至8小時(shí)，優(yōu)選為4小時(shí)，得到毛細(xì)管電泳樣品。
[0035](4)檢測(cè)恢復(fù)熒光強(qiáng)度:將毛細(xì)管電泳樣品進(jìn)行毛細(xì)管電泳，距陽(yáng)極緩沖液池的距離為毛細(xì)管總長(zhǎng)的1/2-2/3處，優(yōu)選為7/12處，進(jìn)行熒光檢測(cè)，獲得恢復(fù)熒光強(qiáng)度，癌胚抗原適配體-熒光物的最大激發(fā)波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)選作檢測(cè)用的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，根據(jù)恢復(fù)熒光強(qiáng)度，按照熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定癌胚抗原濃度。
[0036]所述毛細(xì)管電泳使用內(nèi)徑為50-100 μ m的熔融石英管,分離有效長(zhǎng)度在35_60cm間，電場(chǎng)強(qiáng)度在150-400V/cm間，電泳溫度恒定在20_30°C間，陽(yáng)極、陰極及電泳緩沖液為pH在8.4至9.2之間的Na2B4O7-H3BO3溶液，虹吸進(jìn)樣高度15cm、時(shí)間15_35s。
[0037]所述熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線，體現(xiàn)了癌胚抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度0.257~12.9ng/mL)按照本方法檢測(cè)到的熒光恢復(fù)強(qiáng)度和癌胚抗原濃度的對(duì)數(shù)之間的線性關(guān)系，通過(guò)測(cè)定樣品按照本方法檢測(cè)得到的熒光強(qiáng)度和癌胚抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)定待測(cè)樣品中癌胚抗原濃度。
[0038]所述標(biāo)準(zhǔn)曲線按照如下方法制作:
[0039](al)配制癌胚抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度呈現(xiàn)N個(gè)梯度，N ^ 10 ；
[0040](a2)按照與按胚抗原檢測(cè)方法相同的步驟用癌胚抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液，代替待檢測(cè)樣品與所述癌胚抗原適配體-熒光物/氧化石墨烯溶液混反應(yīng)，制得N份標(biāo)準(zhǔn)品毛細(xì)管電泳樣品O
[0041](a3)將步驟(a2)中制得的N份標(biāo)準(zhǔn)品毛細(xì)管電泳樣品，按照與按胚抗原檢測(cè)方法相同的參數(shù)進(jìn)行毛細(xì)管電泳和熒光檢測(cè)，得到N份標(biāo)準(zhǔn)品毛細(xì)管電泳樣品的熒光強(qiáng)度，SP恢復(fù)突光強(qiáng)度；
[0042](a4)以癌胚抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液相應(yīng)的毛細(xì)管電泳樣品的熒光強(qiáng)度及癌胚抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液的對(duì)數(shù)為縱橫坐標(biāo)，根據(jù)所述N分標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果，采用線性回歸算法獲取以癌胚抗原溶液的恢復(fù)熒光強(qiáng)度與癌胚抗原溶液濃度的對(duì)數(shù)的響應(yīng)函數(shù)。
[0043]對(duì)于本發(fā)明提供的癌胚抗原方法，檢測(cè)背景噪聲，具體步驟為:以不含癌胚抗原的標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為噪聲檢測(cè)溶液，按照所述癌胚抗原檢測(cè)方法，檢測(cè)噪聲檢測(cè)溶液的恢復(fù)熒光強(qiáng)度，從而測(cè)得背景噪聲。按照檢出限為3倍于背景噪聲的原則，計(jì)算得到本發(fā)明提供的癌胚抗原將測(cè)方法，檢出限為5pg/ml，遠(yuǎn)低于目前的癌胚抗原檢測(cè)方法，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)靈敏度顯著提高。
[0044]本發(fā)明提供的癌胚抗原檢測(cè)裝置，如圖2所示，包括毛細(xì)管電泳裝置和熒光檢驗(yàn)裝置，所述毛細(xì)管電泳裝置包括高壓電源1，包含鉬電極2的陽(yáng)極緩沖液池3，包含鉬電極2的陰極緩沖液池4，毛細(xì)管5 ;其毛細(xì)管總長(zhǎng)50-100cm，內(nèi)徑為50-100 μ m，所述毛細(xì)管一端為進(jìn)樣口 6置于陽(yáng)極緩沖池3內(nèi)，其另一端置于陰極緩沖液池4內(nèi)，所述毛細(xì)管上距陽(yáng)極緩沖液池的距離為毛細(xì)管總長(zhǎng)的1/2-2/3處設(shè)有檢測(cè)窗口，優(yōu)選為7/12處；陽(yáng)極緩沖液池3內(nèi)盛有沒(méi)過(guò)鉬電極2的電解液，通過(guò)鉬電極2與高壓電源I的正極相連，陰極緩沖液池4內(nèi)盛有沒(méi)過(guò)鉬電極2的電解液，通過(guò)鉬電極2與高壓電源I的負(fù)極相連；所述熒光檢驗(yàn)裝置，包括突光顯微鏡7和光電 轉(zhuǎn)換器8 ;所述突光顯微鏡設(shè)置在所述毛細(xì)管檢測(cè)窗口處,與光電轉(zhuǎn)換器8連接，光電轉(zhuǎn)換器8將熒光顯微鏡收集到的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。優(yōu)選地，熒光檢測(cè)裝置為倒置熒光顯微鏡檢測(cè)平臺(tái)，毛細(xì)管檢測(cè)窗口位于顯微鏡物鏡的上方，高壓汞燈作為激發(fā)光源。[0045]工作時(shí)，電泳采用虹吸法進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)，將樣機(jī)緩沖池3內(nèi)的緩沖溶液換成待檢測(cè)樣品溶液，進(jìn)樣高度15cm,進(jìn)樣時(shí)間15-35s,進(jìn)樣的同時(shí),記錄光電轉(zhuǎn)換器輸出的電信號(hào)。
[0046]以下為實(shí)施例:
[0047]實(shí)施例1
[0048]一種癌胚抗原檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0049](I)制備癌胚抗原適配體-熒光物:將濃度為10_5Μ、30μ L巰基乙酸鈉修飾的半導(dǎo)體硫化鋅包被硒化鎘核殼型(CdSe/ZnS)量子點(diǎn)和連接劑混合，所述連接劑為1_乙基-3- (3- 二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀酰亞胺摩爾比5:1混合物，將該混合液與50 μ L、120 μ M的癌胚抗原適配體緩沖溶液混合均勻，所述緩沖溶液為
0.2Μ的磷酸鹽緩沖溶液，pH值為8.4，使得熒光物質(zhì)、連接劑和癌胚抗原適配體的摩爾比為1:1000:20，使熒光物和適配體之間發(fā)生縮合反應(yīng)，反應(yīng)3小時(shí)后，將混合液離心超濾，除去過(guò)量的癌胚抗原適配體，得到含癌胚抗原適配體-熒光物,加入100 μ LpH值為8.4,0.2Μ的磷酸鹽緩沖溶液溶解。最終熒光物質(zhì)、連接劑和癌胚抗原適配體濃度分別為3.0X 10_6Μ、
3.0Χ10-3Μ、6.0Χ10-5Μ。
[0050](2)制備癌胚抗原適配體-熒光物/氧化石墨烯溶液:將步驟(1)中制備的含癌胚抗原適配體-熒光物的緩沖液與濃度為45 μ g/mL的氧化石墨烯溶液，均勻混合，反應(yīng)8小時(shí)，使得癌胚抗原適配體-突光物突光淬滅； [0051](3)制備毛細(xì)管電泳樣品:將采集的血液樣品經(jīng)0.22 μ m濾膜過(guò)濾后，稀釋50倍得到待測(cè)樣品，將待檢測(cè)樣品與步驟(2)中制備的癌胚抗原適配體-熒光物/氧化石墨烯溶液混合均勻，反應(yīng)4小時(shí)，得到毛細(xì)管電泳樣品；
[0052](4)檢測(cè)恢復(fù)熒光強(qiáng)度:將毛細(xì)管電泳樣品進(jìn)行毛細(xì)管電泳，距陽(yáng)極緩沖液池的距離為毛細(xì)管總長(zhǎng)的7/12處進(jìn)行熒光檢測(cè)，獲得恢復(fù)熒光強(qiáng)度，熒光激發(fā)波長(zhǎng)為460nm，發(fā)射波長(zhǎng)為半導(dǎo)體量子點(diǎn)的熒光最大發(fā)射波長(zhǎng)630nm，根據(jù)恢復(fù)熒光強(qiáng)度，按照熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定癌胚抗原濃度。
[0053]所述毛細(xì)管電泳使用內(nèi)徑為75 μ m的彈性聚酰亞胺涂層熔融石英管，分離有效長(zhǎng)度在35至60cm間，總長(zhǎng)60cm,電場(chǎng)強(qiáng)度為400V/cm,電泳溫度恒定在30°C,陽(yáng)極、陰極及電泳緩沖液為PH8.7的Na2B4O7-H3BO3溶液，虹吸進(jìn)樣高度15cm、時(shí)間35s。
[0054]所述標(biāo)準(zhǔn)曲線按照如下方法制作:
[0055](al)配制癌胚抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度呈現(xiàn)N個(gè)梯度，N=IO ；
[0056](a2)按照與按胚抗原檢測(cè)方法相同的步驟用癌胚抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液，代替待檢測(cè)樣品與所述癌胚抗原適配體-熒光物/氧化石墨烯溶液混反應(yīng)，制得N份標(biāo)準(zhǔn)品毛細(xì)管電泳樣品O
[0057](a3)將步驟(a2)中制得的N份標(biāo)準(zhǔn)品毛細(xì)管電泳樣品，按照與按胚抗原檢測(cè)方法相同的參數(shù)進(jìn)行毛細(xì)管電泳和熒光檢測(cè)，得到N份標(biāo)準(zhǔn)品毛細(xì)管電泳樣品的熒光強(qiáng)度，SP恢復(fù)突光強(qiáng)度；
[0058](a4)以癌胚抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液相應(yīng)的毛細(xì)管電泳樣品的熒光強(qiáng)度及癌胚抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液的對(duì)數(shù)為縱橫坐標(biāo)，根據(jù)所述N分標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果，采用線性回歸算法獲取以癌胚抗原溶液的恢復(fù)熒光強(qiáng)度與癌胚抗原溶液濃度的對(duì)數(shù)的響應(yīng)函數(shù)。
[0059]檢測(cè)結(jié)果如表1所示。[0060]實(shí)施例2
[0061]一種癌胚抗原檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0062](I)制備癌胚抗原適配體-熒光物:將濃度為10_7M、30yL牛血清蛋白修飾的熒光納米金簇和連接劑混合，所述連接劑為1-乙基-3- (3- 二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽的水溶液，將該混合液與50 μ L、6 X IO-7 μ M的癌胚抗原適配體緩沖溶液混合均勻，所述緩沖溶液為0.2Μ的磷酸鹽緩沖溶液，pH值為8.0,使得熒光物質(zhì)、連接劑和癌胚抗原適配體的摩爾比為1:500:10，使熒光物和適配體之間發(fā)生縮合反應(yīng)，反應(yīng)2小時(shí)后，將混合液離心超濾，除去過(guò)量的癌胚抗原適配體，得到含癌胚抗原適配體-熒光物加入100 UL pH值為
8.0,0.2M的磷酸鹽緩沖溶液溶解。最終熒光物質(zhì)、連接劑和癌胚抗原適配體濃度分別為
3.0X10_8M、1.5X10_5M、3.0X10_7M。
[0063](2)制備癌胚抗原適配體-熒光物/氧化石墨烯溶液:將步驟(I)中制備的含癌胚抗原適配體-熒光物的緩沖液與濃度為40 μ g/mL的氧化石墨烯溶液，均勻混合，反應(yīng)4小時(shí)，使得癌胚抗原適配體-突光物突光淬滅；
[0064](3)制備毛細(xì)管電泳樣品:將采集的血液樣品經(jīng)0.22 μ m濾膜過(guò)濾后，稀釋20倍得到待測(cè)樣品，將待檢測(cè)樣品與步驟(2)中制備的癌胚抗原適配體-熒光物/氧化石墨烯溶液混合均勻，反應(yīng)8小時(shí)，得到毛細(xì)管電泳樣品；
[0065](4)檢測(cè)恢復(fù)熒光強(qiáng)度:將毛細(xì)管電泳樣品進(jìn)行毛細(xì)管電泳，距陽(yáng)極緩沖液池的距離為毛細(xì)管總長(zhǎng)的2/3處進(jìn)行熒光檢測(cè)，獲得恢復(fù)熒光強(qiáng)度，熒光激發(fā)波長(zhǎng)為320nm，發(fā)射波長(zhǎng)為熒光納米金簇的最大發(fā)射波長(zhǎng)430nm，根據(jù)恢復(fù)熒光強(qiáng)度，按照熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定癌胚抗原濃度。
[0066]所述毛細(xì)管電泳使用內(nèi)徑為100 μ m的彈性熔融石英管，分離有效長(zhǎng)度為33cm，總長(zhǎng)50cm，電場(chǎng)強(qiáng)度為150V/cm，電泳溫度恒定在20°C，陽(yáng)極、陰極及電泳緩沖液為pH9.2的Na2B4O7-H3BO3溶液，虹吸進(jìn)樣高度15cm、時(shí)間20s。
[0067]所述標(biāo)準(zhǔn)曲線按照如下方法制作:
[0068](al)配制癌胚抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度呈現(xiàn)N個(gè)梯度，N=12 ；
[0069](a2)按照與按胚抗原檢測(cè)方法相同的步驟用癌胚抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液，代替待檢測(cè)樣品與所述癌胚抗原適配體-熒光物/氧化石墨烯溶液混反應(yīng)，制得N份標(biāo)準(zhǔn)品毛細(xì)管電泳樣品O
[0070](a3)將步驟(a2)中制得的N份標(biāo)準(zhǔn)品毛細(xì)管電泳樣品，按照與按胚抗原檢測(cè)方法相同的參數(shù)進(jìn)行毛細(xì)管電泳和熒光檢測(cè)，得到N份標(biāo)準(zhǔn)品毛細(xì)管電泳樣品的熒光強(qiáng)度，SP恢復(fù)突光強(qiáng)度；
[0071](a4)以癌胚抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液相應(yīng)的毛細(xì)管電泳樣品的熒光強(qiáng)度及癌胚抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液的對(duì)數(shù)為縱橫坐標(biāo)，根據(jù)所述N分標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果，采用線性回歸算法獲取以癌胚抗原溶液的恢復(fù)熒光強(qiáng)度與癌胚抗原溶液濃度的對(duì)數(shù)的響應(yīng)函數(shù)。
[0072]檢測(cè)結(jié)果如表I所示。
[0073]實(shí)施例3
[0074]一種癌胚抗原檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0075](I)制備癌胚抗原適配體-熒光物:將濃度為10_6Μ、30 μ L熒光納米銀簇和連接劑混合，所述連接劑為1-乙基-3- (3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀酰亞胺1:1的混合物，將該混合液與50 μ L、3 μ M的癌胚抗原適配體緩沖溶液混合均勻，所述緩沖溶液為0.2Μ的磷酸鹽緩沖溶液，pH值為7.4，使得熒光物質(zhì)、連接劑和癌胚抗原適配體的摩爾比為1:200:5，使熒光物和適配體之間發(fā)生縮合反應(yīng)，反應(yīng)4小時(shí)后，將混合液離心超濾，除去過(guò)量的癌胚抗原適配體，得到含癌胚抗原適配體-熒光物加入100 μ L pH值為7.4,0.2M的磷酸鹽緩沖溶液溶解。最終熒光物質(zhì)、連接劑和癌胚抗原適配體濃度分別為3.0Χ10-7Μ、6.0Χ10-5Μ、1.5 X 10-6M0
[0076](2)制備癌胚抗原適配體-熒光物/氧化石墨烯溶液:將步驟(1)中制備的含癌胚抗原適配體-熒光物的緩沖液與濃度為60 μ g/mL的氧化石墨烯溶液，均勻混合，反應(yīng)I小時(shí)，使得癌胚抗原適配體-突光物突光淬滅；
[0077](3)制備毛細(xì)管電泳樣品:將采集的血液樣品經(jīng)0.22 μ m濾膜過(guò)濾后，稀釋10倍得到待測(cè)樣品，將待檢測(cè)樣品與步驟(2)中制備的癌胚抗原適配體-熒光物/氧化石墨烯溶液混合均勻，反應(yīng)2小時(shí)，得到毛細(xì)管電泳樣品；
[0078](4)檢測(cè)恢復(fù)熒光強(qiáng)度:將毛細(xì)管電泳樣品進(jìn)行毛細(xì)管電泳，距陽(yáng)極緩沖液池的距離為毛細(xì)管總長(zhǎng)的1/2處進(jìn)行熒光檢測(cè)，獲得恢復(fù)熒光強(qiáng)度，熒光激發(fā)波長(zhǎng)為435nm，發(fā)射波長(zhǎng)為納米銀的熒光最大發(fā)射波長(zhǎng)500nm，根據(jù)恢復(fù)熒光強(qiáng)度，按照熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定癌胚抗原濃度。
[0079]所述毛細(xì)管電泳使用內(nèi)徑為50 μ m的彈性聚酰亞胺涂層熔融石英管，分離有效長(zhǎng)度為50cm，總長(zhǎng)100cm，電場(chǎng)強(qiáng)度為200V/cm，電泳溫度恒定在25°C，陽(yáng)極、陰極及電泳緩沖液為ρΗ8.4的Na2B4O7-H3BO3溶液，虹吸進(jìn)樣高度15cm、時(shí)間15s。
[0080]所述標(biāo)準(zhǔn)曲線按照如下方法制作:
[0081](al)配制癌胚抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度呈現(xiàn)N個(gè)梯度，N=15 ；
[0082](a2)按照與按胚抗原檢測(cè)方法相同的步驟用癌胚抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液，代替待檢測(cè)樣品與所述癌胚抗原適配體-熒光物/氧化石墨烯溶液混反應(yīng)，制得N份標(biāo)準(zhǔn)品毛細(xì)管電泳樣品O
[0083](a3)將步驟(a2)中制得的N份標(biāo)準(zhǔn)品毛細(xì)管電泳樣品，按照與按胚抗原檢測(cè)方法相同的參數(shù)進(jìn)行毛細(xì)管電泳和熒光檢測(cè)，得到N份標(biāo)準(zhǔn)品毛細(xì)管電泳樣品的熒光強(qiáng)度，SP恢復(fù)突光強(qiáng)度；
[0084](a4)以癌胚抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液相應(yīng)的毛細(xì)管電泳樣品的熒光強(qiáng)度及癌胚抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液的對(duì)數(shù)為縱橫坐標(biāo)，根據(jù)所述N分標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果，采用線性回歸算法獲取以癌胚抗原溶液的恢復(fù)熒光強(qiáng)度與癌胚抗原溶液濃度的對(duì)數(shù)的響應(yīng)函數(shù)。
[0085]檢測(cè)結(jié)果如表1所示。
[0086]表1人血清樣品中癌胚抗原含量的檢測(cè)結(jié)果
[0087]
【權(quán)利要求】
1.一種癌胚抗原的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: (O制備癌胚抗原適配體-熒光物:將濃度為IO-7M-1O-5M熒光物質(zhì)和連接劑溶液均勻混合，再將該混合液與癌胚抗原適配體的緩沖溶液混合均勻，使得熒光物質(zhì)、連接劑、癌胚抗原適配體的摩爾比在1:200~1000:5~20，熒光物質(zhì)的最終濃度在10-8Μ至10_5M，連接劑的最終濃度在0.025mg/ml至0.05mg/ml,癌胚抗原適配體的最終濃度在5X 10-8Μ至2X 10_4M ;熒光物和癌胚抗原適配體發(fā)生縮合反應(yīng)，除去過(guò)量的癌胚抗原適配體，得到含癌胚抗原適配體-熒光物的緩沖液； (2)制備癌胚抗原適配體-熒光物/氧化石墨烯溶液:將步驟(1)中制備的含癌胚抗原適配體-熒光物的緩沖液與氧化石墨烯溶液均勻混合，反應(yīng)I至8小時(shí)，氧化石墨烯使得癌胚抗原適配體-熒光物熒光淬滅，得到癌胚抗原適配體-熒光物/氧化石墨烯溶液； (3)制備毛細(xì)管電泳樣品:將待測(cè)樣品與步驟(2)中制備的癌胚抗原適配體-熒光物/氧化石墨烯溶液混合均勻，反應(yīng)2至8小時(shí)從而恢復(fù)熒光，得到毛細(xì)管電泳樣品； (4)檢測(cè)恢復(fù)熒光強(qiáng)度:將毛細(xì)管電泳樣品進(jìn)行毛細(xì)管電泳，距陽(yáng)極緩沖液池的距離為毛細(xì)管總長(zhǎng)的1/2-2/3處進(jìn)行熒光檢測(cè)，獲得恢復(fù)熒光強(qiáng)度，根據(jù)恢復(fù)熒光強(qiáng)度，按照熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定癌胚抗原濃度。
2.如權(quán)利要求1所述的癌胚抗原的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(1)其熒光物質(zhì)、連接劑與癌胚抗原適配體的摩爾比為1:200:5。
3.如權(quán)利要求1所述的癌胚抗原的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(1)所述熒光物質(zhì)為有機(jī)熒光染料或無(wú)機(jī)熒光納米顆粒，常用為硒化鎘、碲化鎘、硫化鎘、硫化鋅、硒化鋅、碲化鋅、硫化萊、硒化萊、締化萊、砷化鎵、砷化銦、碳化娃、硒化鉛、硒化鎂、硫化鋅包被硒化鎘核殼型(CdSe/ZnS)、硫化鋅包碲化鎘核殼型(CdTe/ZnS)、碳點(diǎn)、納米金簇、納米銀簇、熒光石墨烯或復(fù)合熒光二氧化硅納米粒子，優(yōu)選為半導(dǎo)體量子點(diǎn)。
4.如權(quán)利要求1所述的癌胚抗原的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(1)所述連接劑為1-乙基-3- (3- 二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽與N-羥基硫代琥珀酰亞胺的混合物，其中按照摩爾比，N-羥基硫代琥珀酰亞胺不超過(guò)50%。
5.如權(quán)利要求1所述的癌胚抗原的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(2)其氧化石墨烯溶液濃度為40-60 μ g/mL。
6.如權(quán)利要求1所述的癌胚抗原的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(4)毛細(xì)管電泳使用的毛細(xì)管為內(nèi)徑在50-100 μπι之間的熔融石英管。
7.如權(quán)利要求1所述的癌胚抗原的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(4)毛細(xì)管電泳其電場(chǎng)強(qiáng)度在150-400V/cm間，電泳溫度恒定在20_30°C間，陽(yáng)極、陰極及電泳緩沖液為pH8.4-9.2的 Na2B4O7-H3BO3 溶液。
8.如權(quán)利要求7所述的癌胚抗原的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(4)距陽(yáng)極緩沖液池的距離為毛細(xì)管總長(zhǎng)的7/12處進(jìn)行熒光檢測(cè)。
9.一種癌胚抗原檢測(cè)裝置，其特征在于，包括毛細(xì)管電泳裝置和熒光檢驗(yàn)裝置，所述毛細(xì)管電泳裝置，其毛細(xì)管(5)總長(zhǎng)50-100cm，內(nèi)徑為50-100 μ m,所述毛細(xì)管上距陽(yáng)極緩沖液池(3)的距離為毛細(xì)管總長(zhǎng)的1/2-2/3處設(shè)有檢測(cè)窗口，熒光檢測(cè)裝置設(shè)置在毛細(xì)管檢測(cè)窗口處。
10.如權(quán)利要求9所述的癌胚抗原檢測(cè)裝置，其特征在于，所述毛細(xì)管為彈性聚酰亞胺涂層熔融石英管。
【文檔編號(hào)】G01N33/533GK103901197SQ201410142446
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年4月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月10日
【發(fā)明者】趙元弟, 周子明, 方碧云 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)