本發(fā)明涉及保健品及藥品技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種基于鱘魚軟骨活性成分的關(guān)節(jié)修復(fù)組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
鱘魚（sturgeon）是指鱘形目的魚類，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前，全世界鱘魚種類有27種，我國(guó)有8種。近幾十年來(lái)，由于環(huán)境污染及過(guò)度捕撈等人為因素的原因，致使有些鱘魚種類瀕臨滅絕。為了挽救這些瀕危物種，世界各國(guó)在鱘魚繁殖、放流、養(yǎng)殖等方面做了大量的工作。迄今為止，我國(guó)從國(guó)外引進(jìn)了俄羅斯鱘、歐洲鰉、小體鱘、匙吻鱘等十幾個(gè)品種作為研究或者是人工養(yǎng)殖。我國(guó)鱘魚養(yǎng)殖的主要品有產(chǎn)于黑龍江的史氏鱘、達(dá)氏鱘，產(chǎn)于長(zhǎng)江的中華鱘和從國(guó)外引進(jìn)的俄羅斯鱘、西伯利亞鱘、小體鱘、小鱘等，其中史氏鱘和達(dá)氏鱘及其雜交種具有生長(zhǎng)迅速、能耐低溫、遺傳可塑性強(qiáng)、肉感好等特點(diǎn)而倍受人們的喜愛(ài)。
鱘魚具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值，是古今中外人們喜愛(ài)的水產(chǎn)品。鱘魚除背部骨板外，通體均為軟骨，軟骨在鱘魚各組織中占有較大的比重，該部位具有明顯的抗癌和補(bǔ)鈣作用，素有“鯊魚翅、鱘魚骨，食之明目壯陽(yáng)，延年益壽”之說(shuō)。現(xiàn)有研究表明：鱘魚軟骨中富含蛋白、多糖、多肽等活性因子，可用于多種疾病的治療。
膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病，又稱增生性膝關(guān)節(jié)炎、老年性膝關(guān)節(jié)炎。它是一種慢性關(guān)節(jié)疾病，它的主要改變是膝關(guān)節(jié)軟骨面的退行性變和繼發(fā)性的骨質(zhì)增生。主要表現(xiàn)是關(guān)節(jié)疼痛和活動(dòng)不靈活，x線表現(xiàn)關(guān)節(jié)間隙變窄，軟骨下骨質(zhì)致密，骨小梁斷裂，有硬化和囊性變。關(guān)節(jié)邊緣有唇樣增生。后期骨端變形，關(guān)節(jié)面凹凸不平。關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨剝落，骨質(zhì)碎裂進(jìn)入關(guān)節(jié)，形成關(guān)節(jié)內(nèi)游離體。最近的調(diào)研數(shù)據(jù)顯示，全球風(fēng)濕病患者約有4億人，是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最為龐大的一個(gè)疾病族群。在中國(guó)，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者占人口總數(shù)的18％，發(fā)病率高達(dá)20％。換句話說(shuō)，在中國(guó)，有2億多人不同程度地患有風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，其中有8000萬(wàn)重癥患者。其中，50歲以上人群約50％患有風(fēng)濕病，60歲以上人群的骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病率達(dá)78.5%，70歲以上人群有90%出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)軟骨退化、關(guān)節(jié)疼痛和關(guān)節(jié)炎，我國(guó)潮濕地區(qū)的發(fā)病率更高達(dá)40％。現(xiàn)在市面上有很多治療關(guān)節(jié)炎的藥物，這些藥物會(huì)有副作用，且不能根治，只能緩解。因此，需要一款無(wú)副作用且效果明顯的關(guān)節(jié)修復(fù)組合物。
現(xiàn)有技術(shù)如授權(quán)公告號(hào)為cn102626225b的中國(guó)發(fā)明專利，公開了一種具有增加骨密度和保護(hù)關(guān)節(jié)功能的保健食品及其制備方法，提供了一種由氨基葡萄糖、鈣劑和魚油組成的具有增加骨密度和保護(hù)關(guān)節(jié)雙重功效的保健食品設(shè)計(jì)方案。該保健食品能較好的促進(jìn)骨質(zhì)的吸收，增加骨密度，促進(jìn)骨折愈合，延緩骨質(zhì)疏松，但其對(duì)骨關(guān)節(jié)的修復(fù)能力較差，對(duì)軟組織的重建和恢復(fù)的作用效果較差。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種能有效消除關(guān)節(jié)腫痛，延緩骨質(zhì)疏松，促進(jìn)關(guān)節(jié)滑液的生成，加速軟組織的重建和恢復(fù)的基于鱘魚軟骨活性成分的關(guān)節(jié)修復(fù)組合物及其制備方法。
本發(fā)明針對(duì)背景技術(shù)中提到的問(wèn)題，采取的技術(shù)方案為：一種基于鱘魚軟骨活性成分的關(guān)節(jié)修復(fù)組合物成份及其重量份為：鱘魚軟骨ii型膠原蛋白80~95份，鱘魚軟骨硫酸軟骨素1~10份，氨基葡萄糖5~15份，酪蛋白鈣0.1~1份。
作為優(yōu)選，氨基葡萄糖為硫酸氨基葡萄糖或鹽酸氨基葡萄糖或n-乙酰氨基葡萄糖。
一種基于鱘魚軟骨活性成分的關(guān)節(jié)修復(fù)組合物的制備方法為：
1）脫脂：鱘魚軟骨組織搗碎機(jī)中破碎，按料液比1:10～25（w/v）加入naoh溶液（0.08~0.14mol/l），于2~5℃下攪拌18～36h（naoh溶液每4～8h更換一次），15000～20000rpm離心20～30min，收集沉淀物并洗至中性，按料液比1:10～25（w/v）加入正丁醇溶液（15%）浸泡36～54h除去殘留的脂肪；
2）脫鈣：按料液比1:10～20（w/v）向固體物中加入edta-2na溶液（0.42~0.49mol/l，ph為7.0~8.0）浸泡18～30h（edta-2na溶液每3～6h更換一次），脫鈣；最后軟骨固體物用蒸餾水洗至中性、干燥；
3）提?。涸诓襟E2最后得到的軟骨中按料液比1:10～25（w/v）置于乙酸溶液（0.46~0.54mol/l）中，攪拌提取18～36h，經(jīng)15000～20000rpm離心15～30min，收集沉淀物；按料液比1:10～25(w/v)向沉淀物中加入乙酸溶液（0.46~0.54mol/l），按照軟骨重量的2.5～3.0%加入豬胃蛋白酶（≥3800u/g），于2~5℃下攪拌提取48～72h，15000～20000rpm離心20～30min，取上清液；
4）透析：將步驟3最后得到的上清液裝入透析袋，并放入tris-hcl磷酸緩沖液（0.046~0.053mol/l，ph為7.2~7.8）中，并在緩沖液中添加nacl至溶液最終濃度為2.6～3.0mol/l，透析24～36h至析出絮狀物沉淀，15000～20000rpm離心15～30min得沉淀物。將得到的沉淀用乙酸溶液（0.46~0.54mol/l）復(fù)溶后蒸餾水透析36～54h，透析液冷凍干燥得鱘魚軟骨ii型膠原蛋白；
5）超聲波輔助酶解處理：在步驟3最后得到的沉淀物中加入tris-hcl緩沖液（0.046~0.053mol/l，ph為7.8~8.5），加入軟骨重量的0.3～1.0%的胰蛋白酶，在300～500w超聲波輔助作用下，45～55℃水解2～4h，將反應(yīng)后提取液置于90℃水浴10～15min，15000～20000rpm離心15～30min，上清液；
6）透析：將步驟5最后得到的上清液濃縮并裝入透析袋，用蒸餾水透析36～54h，透析液按體積加入1.0～1.5倍（v/v）90~98%的乙醇溶液，再逐漸加入naoh至其濃度為0.5～1.0mol/l，于2~5℃下靜置12～16h，離心得白色沉淀；白色沉淀轉(zhuǎn)移至透析袋，用蒸餾水透析8～12h，透析液干燥處理，得鱘魚軟骨硫酸軟骨素；
7）成品：按配方量混合鱘魚軟骨ii型膠原蛋白、鱘魚軟骨硫酸軟骨素、氨基葡萄糖和酪蛋白鈣，制成制劑，得到一種基于鱘魚軟骨活性成分的關(guān)節(jié)修復(fù)組合物。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：1）本發(fā)明能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的生成，能大量催生和補(bǔ)充關(guān)節(jié)滑液，潤(rùn)滑關(guān)節(jié)軟骨面，減少磨損，增加關(guān)節(jié)部位的靈活度；2）本發(fā)明能有效促進(jìn)膠原基質(zhì)的生成，刺激結(jié)締組織細(xì)胞再生，進(jìn)而加速軟組織的重建和恢復(fù)；3）本發(fā)明具有抑制微血管衍生的因子，還可增加抗體的產(chǎn)生，提高免疫能力，具有消炎和止痛的功效，可以減輕疼痛，改善運(yùn)動(dòng)能力；4）本發(fā)明可以抑制軟骨降解酶的活性，從而起到預(yù)防和治療關(guān)節(jié)退行性變的作用；5）本發(fā)明分子量小，人體對(duì)本發(fā)明的吸收利用率高，可有效增加骨密度，延緩骨質(zhì)疏松；6）本發(fā)明安全無(wú)毒，無(wú)副作用，并充分利用鱘魚軟骨資源，變廢為寶。
具體實(shí)施例
下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方案作進(jìn)一步說(shuō)明：
實(shí)施例1：
一種基于鱘魚軟骨活性成分的關(guān)節(jié)修復(fù)組合物成份及其重量份為：鱘魚軟骨ii型膠原蛋白80~95份，鱘魚軟骨硫酸軟骨素1~10份，氨基葡萄糖5~15份，酪蛋白鈣0.1~1份。
氨基葡萄糖為硫酸氨基葡萄糖或鹽酸氨基葡萄糖或n-乙酰氨基葡萄糖。
一種基于鱘魚軟骨活性成分的關(guān)節(jié)修復(fù)組合物的制備方法為：
1）脫脂：鱘魚軟骨組織搗碎機(jī)中破碎，按料液比1:10～25（w/v）加入naoh溶液（0.08~0.14mol/l），于2~5℃下攪拌18～36h（naoh溶液每4～8h更換一次），15000～20000rpm離心20～30min，收集沉淀物并洗至中性，按料液比1:10～25（w/v）加入正丁醇溶液（15%）浸泡36～54h除去殘留的脂肪；
2）脫鈣：按料液比1:10～20（w/v）向固體物中加入edta-2na溶液（0.42~0.49mol/l，ph為7.0~8.0）浸泡18～30h（edta-2na溶液每3～6h更換一次），脫鈣；最后軟骨固體物用蒸餾水洗至中性、干燥；
3）提?。涸诓襟E2最后得到的軟骨中按料液比1:10～25（w/v）置于乙酸溶液（0.46~0.54mol/l）中，攪拌提取18～36h，經(jīng)15000～20000rpm離心15～30min，收集沉淀物；按料液比1:10～25(w/v)向沉淀物中加入乙酸溶液（0.46~0.54mol/l），按照軟骨重量的2.5～3.0%加入豬胃蛋白酶（≥3800u/g），于2~5℃下攪拌提取48～72h，15000～20000rpm離心20～30min，取上清液；
4）透析：將步驟3最后得到的上清液裝入透析袋，并放入tris-hcl磷酸緩沖液（0.046~0.053mol/l，ph為7.2~7.8）中，并在緩沖液中添加nacl至溶液最終濃度為2.6～3.0mol/l，透析24～36h至析出絮狀物沉淀，15000～20000rpm離心15～30min得沉淀物。將得到的沉淀用乙酸溶液（0.46~0.54mol/l）復(fù)溶后蒸餾水透析36～54h，透析液冷凍干燥得鱘魚軟骨ii型膠原蛋白；
5）超聲波輔助酶解處理：在步驟3最后得到的沉淀物中加入tris-hcl緩沖液（0.046~0.053mol/l，ph為7.8~8.5），加入軟骨重量的0.3～1.0%的胰蛋白酶，在300～500w超聲波輔助作用下，45～55℃水解2～4h，將反應(yīng)后提取液置于90℃水浴10～15min，15000～20000rpm離心15～30min，上清液；
6）透析：將步驟5最后得到的上清液濃縮并裝入透析袋，用蒸餾水透析36～54h，透析液按體積加入1.0～1.5倍（v/v）90~98%的乙醇溶液，再逐漸加入naoh至其濃度為0.5～1.0mol/l，于2~5℃下靜置12～16h，離心得白色沉淀；白色沉淀轉(zhuǎn)移至透析袋，用蒸餾水透析8～12h，透析液干燥處理，得鱘魚軟骨硫酸軟骨素；
7）成品：按配方量混合鱘魚軟骨ii型膠原蛋白、鱘魚軟骨硫酸軟骨素、氨基葡萄糖和酪蛋白鈣，制成制劑，得到一種基于鱘魚軟骨活性成分的關(guān)節(jié)修復(fù)組合物。
實(shí)施例2：
1）鱘魚軟骨ii型膠原蛋白的制備：
①鱘魚軟骨組織搗碎機(jī)中破碎，按料液比1:15（w/v）加入naoh溶液（0.1mol/l），于4℃下攪拌30h（naoh溶液每5h更換一次），18000rpm離心25min，收集沉淀物并洗至中性，按料液比1:20（w/v）加入正丁醇溶液（15%）浸泡48h除去殘留的脂肪，1:15（w/v）向固體物中加入edta-2na溶液（ph7.4，0.5mol/l）浸泡18h（edta-2na溶液每3h更換一次），脫鈣；最后軟骨固體物用蒸餾洗至中性、干燥。
②將上述預(yù)處理的鱘魚軟骨按料液比1:15（w/v）置于乙酸溶液（0.5mol/l）中，攪拌提取30h，經(jīng)18000rpm離心20min，收集沉淀物；按料液比1:15(w/v)向沉淀物中加入乙酸溶液（0.5mol/l），按照軟骨重量的2.5%加入豬胃蛋白酶（≥3800u/g），于4℃下攪拌提取64h，15rpm離心20min，上清液裝入透析袋放入tris-hcl磷酸緩沖液（0.05mol/l，ph7.5）中，添加nacl至溶液最終濃度為2.8mol/l，透析30h至析出絮狀物沉淀，20000rpm離心25min得沉淀物。將得到的沉淀用乙酸溶液（0.5mol/l）復(fù)溶后蒸餾水透析48h，透析液冷凍干燥得鱘魚軟骨ii型膠原蛋白。
2）鱘魚軟骨硫酸軟骨素的制備：
①超聲波輔助酶解處理：取鱘魚軟骨ii型膠原蛋白提取后的殘留物加入到tris-鹽酸緩沖液（0.05mol/l，ph7.8），加入軟骨重量的0.5%的胰蛋白酶，在400w超聲波輔助作用下，50℃水解4h，將反應(yīng)后提取液置于90℃水浴10min，20000rpm離心20min，得上清液；
②上清液濃縮至原1/3體積裝入透析袋，用蒸餾水透析48h，透析液按體積加入1.5倍（v/v）95%乙醇，再逐漸加入naoh至其濃度為0.8mol/l，于4℃下靜置16h，離心得白色沉淀；白色沉淀轉(zhuǎn)移至透析袋，用蒸餾水透析12h，透析液干燥處理，得鱘魚軟骨硫酸軟骨素。
3）一種基于鱘魚軟骨活性成分的關(guān)節(jié)修復(fù)組合物及其制備方法如下：
①取鱘魚軟骨ii型膠原蛋白850g，鱘魚軟骨硫酸軟骨素50g，氨基葡萄糖100g，酪蛋白鈣5g混合均勻，過(guò)100目篩；
②將混合物粉末上膠囊填充機(jī)進(jìn)行充填。制成0.3g/粒的膠囊。
③經(jīng)包裝、成品檢驗(yàn)，得到產(chǎn)品。
實(shí)施例3：
1）鱘魚軟骨ii型膠原蛋白的制備：
①鱘魚軟骨組織搗碎機(jī)中破碎，按料液比1:20（w/v）加入naoh溶液（0.1mol/l），于3℃下攪拌30h（naoh溶液每5h更換一次），18000rpm離心25min，收集沉淀物并洗至中性，按料液比1:20（w/v）加入正丁醇溶液（15%）浸泡48h除去殘留的脂肪，1:15（w/v）向固體物中加入edta-2na溶液（ph7.4，0.5mol/l）浸泡18h（edta-2na溶液每3h更換一次），脫鈣；最后軟骨固體物用蒸餾洗至中性、干燥。
②將上述預(yù)處理的鱘魚軟骨按料液比1:20（w/v）置于乙酸溶液（0.5mol/l）中，攪拌提取30h，經(jīng)18000rpm離心20min，收集沉淀物；按料液比1:15(w/v)向沉淀物中加入乙酸溶液（0.5mol/l），按照軟骨重量的2.5%加入豬胃蛋白酶（≥3800u/g），于4℃下攪拌提取64h，15rpm離心20min，上清液裝入透析袋放入tris-hcl磷酸緩沖液（0.05mol/l，ph7.5）中，添加nacl至溶液最終濃度為2.8mol/l，透析30h至析出絮狀物沉淀，20000rpm離心25min得沉淀物。將得到的沉淀用乙酸溶液（0.5mol/l）復(fù)溶后蒸餾水透析48h，透析液冷凍干燥得鱘魚軟骨ii型膠原蛋白。
2）鱘魚軟骨硫酸軟骨素的制備：
①超聲波輔助酶解處理：取鱘魚軟骨ii型膠原蛋白提取后的殘留物加入到tris-鹽酸緩沖液（0.05mol/l，ph7.8），加入軟骨重量的0.7%的胰蛋白酶，在400w超聲波輔助作用下，50℃水解4h，將反應(yīng)后提取液置于90℃水浴13min，20000rpm離心20min，得上清液；
②上清液濃縮至原1/3體積裝入透析袋，用蒸餾水透析48h，透析液按體積加入1.5倍（v/v）95%乙醇，再逐漸加入naoh至其濃度為0.8mol/l，于3℃下靜置16h，離心得白色沉淀；白色沉淀轉(zhuǎn)移至透析袋，用蒸餾水透析12h，透析液干燥處理，得鱘魚軟骨硫酸軟骨素。
3）一種基于鱘魚軟骨活性成分的關(guān)節(jié)修復(fù)組合物及其制備方法如下：
①取鱘魚軟骨ii型膠原蛋白850g、鱘魚軟骨硫酸軟骨素50g、氨基葡萄糖100g、酪蛋白鈣5g、白樺脂酸0.02g和人寡肽-10.01g混合均勻，過(guò)100目篩。上述配方能增加軟骨細(xì)胞的活力，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的生成，修補(bǔ)因長(zhǎng)期磨損而變得畸形的軟骨；同時(shí)能大量催生和補(bǔ)充關(guān)節(jié)滑液，減少關(guān)節(jié)之間的摩擦，對(duì)關(guān)節(jié)起到保護(hù)作用；白樺脂酸和人寡肽-1不僅能促進(jìn)軟骨細(xì)胞中膠原蛋白和粘多糖的合成，從而增加軟骨細(xì)胞的活力，而且還能促進(jìn)骨膠原蛋白的生成，增加骨密度；
②將混合物粉末上膠囊填充機(jī)進(jìn)行充填。制成0.3g/粒的膠囊。
③經(jīng)包裝、成品檢驗(yàn)，得到產(chǎn)品。
本發(fā)明的操作步驟中的常規(guī)操作為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在此不進(jìn)行贅述。
以上所述的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補(bǔ)充或類似方式替代等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。