一種關(guān)節(jié)軟骨玻璃化冷凍保護(hù)液及軟骨保存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種關(guān)節(jié)軟骨玻璃化冷凍保護(hù)液及軟骨保存方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，隨著我國人們生活水平的提高以及體育運(yùn)動(dòng)的全面普及，關(guān)節(jié)軟骨損傷患者顯著增多。異體骨軟骨移植修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損取得了一系列令人鼓舞的進(jìn)展。軟骨移植是目前治療軟骨病變的十分有前景的修復(fù)方法之一。因?yàn)楫愺w軟骨移植材料獲得相對(duì)較易且可預(yù)制成任意形狀和大小，便于將正常功能的關(guān)節(jié)軟骨制成各種形狀植于骨缺損處，恢復(fù)軟骨的外形，而且先期實(shí)驗(yàn)證明，證明低溫保存后的軟骨的免疫原性大大降低，從而提高軟骨移植的成活率，達(dá)到修復(fù)軟骨損傷的目的，所以比自體移植應(yīng)用前景更佳。而且軟骨移植物經(jīng)過一段時(shí)間保存后可擇期完成關(guān)節(jié)重建手術(shù)，并且有充裕的時(shí)間進(jìn)行多項(xiàng)檢測，防止供者可能帶來的病毒或細(xì)菌感染，且可降低免疫原性。
[0003]實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)低溫冷凍保存的同種異體骨軟骨移植治療膝關(guān)節(jié)軟骨缺損獲得了滿意的效果，但是生物材料(細(xì)胞、組織、器官)脫離供體后實(shí)現(xiàn)長時(shí)間的保存很難。伴隨著低溫保存技術(shù)的不斷發(fā)展，學(xué)者們發(fā)現(xiàn):在深低溫環(huán)境中的離體生物材料會(huì)逐漸減緩其新陳代謝，甚至停止新陳代謝，因此能夠使其得以長期保存。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種關(guān)節(jié)軟骨移植物玻璃化冷凍冷凍保護(hù)液及其保存方法，旨在解決現(xiàn)有的長期持續(xù)保持關(guān)節(jié)軟骨移植物的活性和軟骨細(xì)胞成存活率低、體外保存時(shí)間短的問題。
[0005]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種關(guān)節(jié)軟骨移植物玻璃化保護(hù)液及軟骨保存方法，該保護(hù)液每100ml包括:99.9%二甲基亞砜150?250ml、乙酰胺110?200g、1，2-丙二醇70?120ml、聚乙二醇(8000) 10?80g、海藻糖20?100g、余為去離子水。
[0006]進(jìn)一步，該軟骨玻璃化保護(hù)液的pH值為7.30?7.50 ;處理后軟骨塊封裝后在液氮中保存。
[0007]本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨玻璃化冷凍保護(hù)液，每100ml含99.9%二甲基亞砜160ml、乙酰胺125g、l，2-丙二醇80ml、聚乙二醇(8000) 30g、海藻糖40g、余為去離子水。
[0008]本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨玻璃化冷凍保護(hù)液，每100ml含99.9%二甲基亞砜205ml、乙酰胺155g、l，2-丙二醇100ml、聚乙二醇(8000) 60g、海藻糖60g、余為去離子水。
[0009]本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨玻璃化冷凍保護(hù)液，每100ml液含99.9%二甲基亞砜225ml、乙酰胺190g、l，2-丙二醇115ml、聚乙二醇(8000) 70g、海藻糖90g、余為去離子水。
[0010]本發(fā)明的另一目的在于提供一種關(guān)節(jié)軟骨玻璃化冷凍保存方法，方法包括如下步驟:
[0011]步驟一，取99.9%二甲基亞砜、乙酰胺、1，2-丙二醇、聚乙二醇(8000)、海藻糖和去離子水；
[0012]步驟二，將步驟一的原料配制成溶液，攪拌均勻，調(diào)節(jié)PH值至7.30?7.50 ;
[0013]步驟三，把新鮮同種異體骨軟骨移植物經(jīng)磷酸鹽緩沖液清洗3-5次；
[0014]步驟四，將步驟三骨軟骨移植物將骨軟骨塊在4°C下經(jīng)梯度玻璃化溶液:1/3濃度玻璃化保護(hù)液、2/3濃度玻璃化保護(hù)液、3/3玻璃化保護(hù)液等逐級(jí)依次浸泡10分鐘，用冷藏管封裝，做好標(biāo)記，然后直接以最快速度投入液氮中保存。
[0015]本發(fā)明的另一目的在于提供一種骨軟骨移植物玻璃化冷凍保護(hù)液及軟骨保存方法在軟骨組織庫的應(yīng)用。
[0016]本發(fā)明的另一目的在于提供一種軟骨玻璃化保護(hù)液及軟骨保存方法在臨床同種異體骨軟骨移植術(shù)治療關(guān)節(jié)軟骨損傷中應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明提供的玻璃化冷凍保護(hù)液及軟骨保存方法，使軟骨細(xì)胞存活率在冷凍保存第8周時(shí)仍保持在一個(gè)較高水平(由傳統(tǒng)組的60%提高到68% )，能夠能有效提高骨軟骨移植物保存效果、延長體外骨軟骨移植物的保存時(shí)間，從而為建立軟骨組織庫，擴(kuò)大同種異體骨軟骨移植修復(fù)軟骨缺損臨床技術(shù)推廣應(yīng)用，為骨軟骨缺損患者的快速康復(fù)帶來福音。
【附圖說明】
[0018]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的關(guān)節(jié)軟骨移植物玻璃化冷凍保護(hù)液的制備及軟骨保存方法流程圖；
[0019]圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的新型軟骨移植物玻璃化冷凍保護(hù)液與對(duì)照組保護(hù)液保存豬關(guān)節(jié)骨軟骨組織在保存第8周時(shí)軟骨細(xì)胞成存活率示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0021]下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。
[0022]本發(fā)明實(shí)施例的軟骨玻璃化保護(hù)液包括??每100ml骨軟骨移植物保護(hù)液包括:99.9%二甲基亞砜150?250ml、乙酰胺110?200g、l, 2-丙二醇70?120ml、聚乙二醇(8000) 10?80g、海藻糖20?100g、余為去離子水；將原料配制成溶液，攪拌均勻，調(diào)節(jié)PH值至7.30?7.50 ;把新鮮同種異體骨軟骨移植物經(jīng)磷酸鹽緩沖液清洗3-5次；將骨軟骨塊在4°C下經(jīng)梯度玻璃化溶液:1/3濃度玻璃化保護(hù)液、2/3濃度玻璃化保護(hù)液、3/3玻璃化保護(hù)液逐級(jí)依次浸泡10分鐘，用冷藏管封裝，做好標(biāo)記，然后直接以最快速度投入液氮中保存。本發(fā)明的另一目的在于提供一種軟骨玻璃化保護(hù)液在骨軟骨組織庫的應(yīng)用。
[0023]如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的關(guān)節(jié)軟骨玻璃化冷凍保護(hù)液及軟骨保存方法包括以下步驟:
[0024]SlOl:取99.9%二甲基亞砜、乙酰胺、1，2-丙二醇、聚乙二醇(8000)、海藻糖、余為去離子水，配制成溶液，攪拌均勻，滴定法調(diào)節(jié)PH值至7.30?7.50 ;
[0025]S102:把新鮮同種異體骨軟骨移植物經(jīng)磷酸鹽緩沖液清洗3-5次；
[0026]S103:將步驟二骨軟骨移植物將骨軟骨塊在4°C下經(jīng)梯度玻璃化溶液:1/3濃度玻璃化保護(hù)液、2/3濃度玻璃化保護(hù)液、3/3玻璃化保護(hù)液等逐級(jí)依次浸泡10分鐘，用冷藏管封裝，做好標(biāo)記，然后直接以最快速度投入液氮中保存；
[0027]S104:使用時(shí)將軟骨塊取出進(jìn)行復(fù)溫:冷凍骨軟骨塊取出后，立即行37°C水浴復(fù)溫10秒，然后依次投入37°C 10%、5%蔗糖溶液中各停留5分鐘，最后磷酸鹽緩沖液液沖洗3遍。
[0028]本發(fā)明的具體實(shí)施例:如圖2所示:
[0029]實(shí)施例1:每100ml玻璃化保護(hù)液包括:99.9%二甲基亞砜160ml、乙酰胺125g、1，2-丙二醇80ml、聚乙二醇(8000) 30g、海藻糖40g、余為去離子水，將原料配制成溶液，攪拌均勻，調(diào)節(jié)PH值