關節(jié)腔用類細胞外基質(zhì)多糖類納米注射液及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物材料領域，具體涉及一種關節(jié)腔用類細胞外基質(zhì)多糖類納米注射液及其制備方法，其包括以下重量份組分：1?4wt％的透明質(zhì)酸鈉、2?5wt％的膠原蛋白、0.5?1.5wt％的人骨形成蛋白、0.2?3wt％的硫酸軟骨素、0.1?1wt％的硫酸肝素、1?4wt％的硫酸氨基葡萄糖、0.1?5wt％的幾丁糖、0.2?0.8wt％的等滲調(diào)節(jié)劑、pH調(diào)節(jié)劑和去離子水，pH調(diào)節(jié)劑的加入量為使注射液的pH為6.0?7.0。本發(fā)明制備的注射液，可以有效的保護關節(jié)軟骨，并具有緩釋抗炎作用。
【專利說明】
關節(jié)腔用類細胞外基質(zhì)多糖類納米注射液及其制備方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于生物材料領域，具體涉及一種關節(jié)腔用類細胞外基質(zhì)多糖類納米注射 液及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 關節(jié)軟骨屬于透明軟骨，無神經(jīng)支配，也無血管分布，由關節(jié)軟骨引起的損傷其自 我修復能力有限。關節(jié)軟骨損傷后對應力的吸收和緩沖作用降低，損傷會進行性加重，同時 損傷的關節(jié)軟骨有發(fā)展為嚴重骨關節(jié)炎的風險。目前，關節(jié)軟骨缺損的修復方法主要有:關 節(jié)沖洗和清理術、微骨折骨髓刺激術、骨軟骨移植術和自體軟骨細胞移植術等。以上技術在 臨床應用中各有優(yōu)缺點，其臨床療效也存在諸多不足。
[0003] 近年來，隨著人們對細胞生物學研究的不斷發(fā)展，越來越多的研究證實細胞外基 質(zhì)對機體功能重建的重要性。細胞外基質(zhì)(611：抑〇61111131'11^1：1^1(3 401)是由動物細胞合 成并分泌到胞外、分布在細胞表面或細胞之間的大分子，主要是一些多糖和蛋白或蛋白聚 糖。這些物質(zhì)構成復雜的網(wǎng)架結構，支持并連接組織結構、調(diào)節(jié)組織的發(fā)生和細胞的生理活 動。細胞外基質(zhì)是動物組織的一部分，不屬于任何細胞。它決定結締組織的特性，為細胞的 生存及活動提供適宜的場所，并通過信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)影響細胞的形狀、代謝、功能、迀移、增殖 和分化。胞外基質(zhì)不僅靜態(tài)的發(fā)揮支持、連接、保水、保護等物理作用，而且動態(tài)的對細胞產(chǎn) 生全方位影響。例如，為細胞提供支持和固定、提供組織間的分離方法、調(diào)節(jié)細胞間的溝通。 此外細胞外間質(zhì)還吸收了多種細胞生長因子和蛋白酶。當生理條件變化時，激活蛋白酶而 釋放這些細胞因子，而無需從頭合成這些因子，從而迅速激活細胞功能。
[0004] 硫酸類肝素廣泛存在于細胞膜、胞外基質(zhì)和某些細胞器中，它們能夠與各種細胞 因子相結合，調(diào)節(jié)她們在胞外基質(zhì)中的產(chǎn)生和維持過程，控制它們的分布和壽命，如與趨化 因子IL-8相互作用將促進其活性;硫酸肝素蛋白多糖對典型的成纖維細胞生長因子信號是 一種有效的輔因子是目前公認的結論。肝素在1985年被發(fā)現(xiàn)其可以增強成纖維細胞生長因 子1的生物學活性。并在1991年首次證明它可直接提升成纖維細胞生長因子受體結合力和 活性。此外，硫酸類肝素還可以和胞外基質(zhì)中的多種蛋白質(zhì)相結合，控制它們的分布、轉(zhuǎn)移 和信息傳遞，誘導修復細胞外基質(zhì)通道。
[0005] 目前，諸多學者致力于與傳統(tǒng)人工合成或天然的生物材料支架相區(qū)別的天然細胞 外基質(zhì)(ECM)支架的研究。ECM支架內(nèi)含有多種結構性和功能性蛋白，還含有多種粘附因子 和生長因子。此外，ECM支架具有良好的天然生物降解性能，并且其自身代謝降解產(chǎn)物均無 生物毒性。其中，軟骨細胞來源的ECM支架在體內(nèi)和體外研究中均有優(yōu)良的軟骨再生潛能。 但利用自體軟骨細胞修復缺損存在來源有限及需二次手術等不足;而使用異體軟骨細胞雖 可解決來源及二次手術問題，卻存在免疫排斥反應和疾病傳播風險，限制了軟骨細胞來源 ECM支架的臨床應用。利用自體骨髓間充質(zhì)干細胞來源的ECM支架則避免了這些潛在的風 險，其細胞來源充足，不需要經(jīng)歷復雜的脫細胞過程，并且展示了較佳的體外軟骨再生和體 內(nèi)軟骨修復能力。
[0006] 然而，ECM支架細胞粘附能力有限，而且多適用于規(guī)則形狀的軟骨缺損修復。同時 臨床上所面臨的軟骨缺損大多為不規(guī)則形狀，故上述預先塑型的ECM支架在應用中也存在 一定的局限性。近年來，許多研究者著力于研究一種可塑型的水凝膠支架材料用以修復軟 骨缺損。水凝膠支架高度含水，具有良好的通透性，其能將細胞包裹起來，為細胞的粘附、增 殖和特異性分化提供一個三維的環(huán)境。目前，許多材料已被用于水凝膠支架的制備，其中瓊 脂糖水凝膠應用廣泛，并展現(xiàn)出較佳的軟骨再生潛能。雖然瓊脂糖水凝膠的使用模擬了天 然細胞外基質(zhì)的水環(huán)境，但其未能提供細胞外基質(zhì)所含有的功能性、結構性蛋白及營養(yǎng)成 分，故其難以有效的促進細胞黏附、增殖和分化。
[0007] 硫酸軟骨素 （chondroitin sulfate，CS)是一類硫酸化的糖胺聚糖 (glyeosaminoglycan，GAG)，其分子結構主要由D.葡糖醛酸與2-乙酰氨基-2-脫氧-硫酸-D-半乳糖組成。根據(jù)硫酸基在N-乙?；?D-氨基半乳糖上的不同位置可分為硫酸軟骨素 A(CS-A)、硫酸軟骨素 C(CS-C)等。商品CS是從豬、牛和雞等軟骨提取的，相對分子質(zhì)量在10 X IO3 ~50 X IO3之間。在歐洲、美國、日本等CS主要作為保健食品或藥品，用于防治冠心病、心絞 痛、心肌梗死、關節(jié)炎、角膜炎、耳聾耳鳴、神經(jīng)痛等疾病。長期服用毒副作用較低。CS作為結 締組織的重要組成部分，具有多種藥理作用與生理功能。分子生物學的研究進展向人們揭 示CS在細胞間信息傳遞，維持細胞表型，與其他基質(zhì)問相互作用及保持組織整體功能方面 發(fā)揮著極其重要的生物功能。2003年在歐洲風濕病防治聯(lián)合會發(fā)表的對于膝OA的治療建議 中認為CS是一種治療膝OA的有效藥物。美國藥典26版收載了CS原料及CS與氨基葡糖的復合 片劑，在美國CS和氨基葡糖已添加至食品中。國外上市的以CS或CS和氨基葡糖為主要成分 的制劑很多，如Osteo Joint Care、Nutra joint等，通常作為膳食補充劑用于預防關節(jié)炎， 保護關節(jié)。CS與氨基葡糖長期服用，副反應發(fā)生率很低，安全性好。
[0008] 硫酸氨基葡萄糖可以阻止胞漿中-I JBA的降解，從而抑制NF-JB的激活；它還通過 抑制NF-JB的亞基p50和p65進入細胞核，減少促炎癥細胞因子和其他參與骨關節(jié)炎的因子， 如C0X-2的合成，具有抗炎的作用。有研究發(fā)現(xiàn)N-乙酰氨基葡萄糖并沒有抑制NF-JB的作用， 可見硫酸基團對于氨基葡萄糖的治療作用非常重要。除了抗炎作用以外，硫酸氨基葡萄糖 還通過其他機制來緩解骨關節(jié)結構的破壞。骨關節(jié)炎的基質(zhì)蛋白降解嚴重，這是由于金屬 蛋白酶激活，蛋白多糖降解增加所致。硫酸氨基葡萄糖可以調(diào)節(jié)膠原酶的活性，還可以通過 減少降解，促進合成而恢復葡萄糖胺聚糖的代謝失衡。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明主要提供了一種關節(jié)腔用類細胞外基質(zhì)多糖類注射液及其制備方法，可以 有效的保護關節(jié)軟骨，并具有緩釋抗炎作用。其技術方案如下:一種關節(jié)腔用類細胞外基質(zhì) 多糖類納米注射液，其包括以下組分：I -4wt %的透明質(zhì)酸鈉、2-5wt %的膠原蛋白、0.5-1.5wt%的人骨形成蛋白、0.2-3wt%的硫酸軟骨素、0.1-Iwt %的硫酸肝素、l-4wt%的硫酸 氨基葡萄糖、0.1_5wt %的幾丁糖、0.2-0.8wt %的等滲調(diào)節(jié)劑、pH調(diào)節(jié)劑和去離子水，pH調(diào) 節(jié)劑的加入量為使注射液的pH為6.0-7.0。
[0010] 優(yōu)選的，所述關節(jié)腔用類細胞外基質(zhì)多糖類納米注射液其包括以下組分:3.5wt% 的透明質(zhì)酸鈉、3wt %的膠原蛋白、Iwt %的人骨形成蛋白、Iwt %的硫酸軟骨素、0.5wt %的 硫酸肝素、2wt %的硫酸氨基葡萄糖、0.5wt %的幾丁糖、0.5wt %的等滲調(diào)節(jié)劑、pH調(diào)節(jié)劑和 去離子水，pH調(diào)節(jié)劑的加入量為使注射液的pH為6.0-7.0。
[0011]優(yōu)選的，所述注射液的PH采用磷酸鹽緩沖液和/或硼酸緩沖液調(diào)節(jié)，當采用磷酸鹽 緩沖液和硼酸緩沖液調(diào)節(jié)時，磷酸鹽緩沖液與硼酸緩沖液以任意比例混溶。
[0012]優(yōu)選的，所述等滲調(diào)節(jié)劑為氯化鈉。
[0013]優(yōu)選的，所述膠原蛋白為π型膠原蛋白。
[0014] -種關節(jié)腔用類細胞外基質(zhì)多糖類納米注射液的制備方法，其包括以下步驟：
[0015] (1)取配方量的透明質(zhì)酸鈉溶于去離子水中制成透明質(zhì)酸鈉水溶液，將膠原蛋白 溶于去離子水中制成膠原蛋白水溶液，將幾丁糖溶于去離子水中制成幾丁糖水溶液；
[0016] (2)將透明質(zhì)酸鈉水溶液、膠原蛋白水溶液、幾丁糖水溶液混合，加入配方量人骨 形成蛋白、硫酸軟骨素、硫酸肝素和硫酸氨基葡萄糖，攪拌均勻；
[0017] (3)加入配方量的等滲調(diào)節(jié)劑和pH調(diào)節(jié)劑，得混合液；
[0018] (4)將得到的混合液進行冷凍干燥，干燥完成后進行納米制粒；
[0019] (5)將制得的納米微球與配方量的去離子水充分混合，混合后的懸濁液即為關節(jié) 腔用類細胞外基質(zhì)多糖類納米注射液。
[0020] 優(yōu)選的，步驟(5)中納米微球的粒徑為10-1000nm。
[0021] 采用上述關節(jié)腔用類細胞外基質(zhì)多糖類納米注射液及其制備方法，本發(fā)明具有以 下優(yōu)點：
[0022] 本案中的透明質(zhì)酸鈉、膠原蛋白、人骨形成蛋白、硫酸軟骨素、硫酸肝素、硫酸氨基 葡萄糖、幾丁糖相互之間具有協(xié)同作用，人骨形成蛋白具有廣泛的生理功能及較強的骨誘 導能力，制備的注射液適用于關節(jié)腔使用，穩(wěn)定性好、安全度高。
【具體實施方式】 [0023] 一、具體實施例 [0024] 實施例1 [0025] 1.注射液配方
[0026] 一種關節(jié)腔用類細胞外基質(zhì)多糖類納米注射液，其包括以下組分:3.5wt %的透明 質(zhì)酸鈉、3wt %的膠原蛋白、Iwt %的人骨形成蛋白-7、Iwt %的硫酸軟骨素、0.5wt %的硫酸 肝素、2wt %的硫酸氨基葡萄糖、0.5 wt %的幾丁糖、0.5wt %的等滲調(diào)節(jié)劑、pH調(diào)節(jié)劑和去離 子水，pH調(diào)節(jié)劑的加入量為使注射液的pH為6.0。
[0027]其中，注射液的pH采用磷酸鹽緩沖液和硼酸緩沖液以任意比例混溶來調(diào)節(jié)。
[0028] 注射液中納米微球的粒徑為I OOOnm。
[0029] 2.注射液的制備方法
[0030] (1)取配方量的透明質(zhì)酸鈉溶于去離子水中制成透明質(zhì)酸鈉水溶液，將膠原蛋白 溶于去離子水中制成膠原蛋白水溶液，將幾丁糖溶于去離子水中制成幾丁糖水溶液；
[0031] (2)將透明質(zhì)酸鈉水溶液、膠原蛋白水溶液、幾丁糖水溶液混合，加入配方量人骨 形成蛋白、硫酸軟骨素、硫酸肝素和硫酸氨基葡萄糖，攪拌均勻；
[0032] (3)加入配方量的等滲調(diào)節(jié)劑和pH調(diào)節(jié)劑，得混合液；
[0033] (4)將得到的混合液進行冷凍干燥，干燥完成后進行納米制粒；
[0034] (5)將制得的納米微球與配方量的去離子水充分混合，混合后的懸濁液即為關節(jié) 腔用類細胞外基質(zhì)多糖類納米注射液。
[0035] 實施例2 [0036] 1.注射液配方
[0037] 一種關節(jié)腔用類細胞外基質(zhì)多糖類納米注射液，其包括以下組分：lwt%的透明質(zhì) 酸鈉、2wt%的Π 型膠原蛋白、0· 5wt%的人骨形成蛋白-7、0.2wt%的硫酸軟骨素、0· lwt% 的硫酸肝素 、Iwt %的硫酸氨基葡萄糖、5wt %的幾丁糖、0.8wt %的氯化鈉、pH調(diào)節(jié)劑和去離 子水，pH調(diào)節(jié)劑的加入量為使注射液的pH為7.0。
[0038]其中，注射液的pH采用磷酸鹽緩沖液來調(diào)節(jié)。
[0039] 注射液中納米微球的粒徑為500nm。
[0040] 2.注射液的制備方法
[0041 ] (1)取配方量的透明質(zhì)酸鈉溶于去離子水中制成透明質(zhì)酸鈉水溶液，將膠原蛋白 溶于去離子水中制成膠原蛋白水溶液，將幾丁糖溶于去離子水中制成幾丁糖水溶液；
[0042] (2)將透明質(zhì)酸鈉水溶液、膠原蛋白水溶液、幾丁糖水溶液混合，加入配方量人骨 形成蛋白、硫酸軟骨素、硫酸肝素和硫酸氨基葡萄糖，攪拌均勻；
[0043] (3)加入配方量的等滲調(diào)節(jié)劑和pH調(diào)節(jié)劑，得混合液；
[0044] (4)將得到的混合液進行冷凍干燥，干燥完成后進行納米制粒；
[0045] (5)將制得的納米微球與配方量的去離子水充分混合，混合后的懸濁液即為關節(jié) 腔用類細胞外基質(zhì)多糖類納米注射液。
[0046] 實施例3
[0047] 1.注射液配方
[0048] 一種關節(jié)腔用類細胞外基質(zhì)多糖類納米注射液，其包括以下組分:4wt%的透明質(zhì) 酸鈉、5wt%的Π 型膠原蛋白、1.5wt%的人骨形成蛋白-7、2wt%的硫酸軟骨素、0.5wt%的 硫酸肝素、4wt %的硫酸氨基葡萄糖、3wt %的幾丁糖、0.2wt %的氯化鈉、pH調(diào)節(jié)劑和去離子 水，pH調(diào)節(jié)劑的加入量為使注射液的pH為6.5。
[0049] 其中，注射液的pH采用硼酸緩沖液來調(diào)節(jié)。
[0050] 注射液中納米微球的粒徑為10nm。
[00511 2.注射液的制備方法
[0052] (1)取配方量的透明質(zhì)酸鈉溶于去離子水中制成透明質(zhì)酸鈉水溶液，將膠原蛋白 溶于去離子水中制成膠原蛋白水溶液，將幾丁糖溶于去離子水中制成幾丁糖水溶液；
[0053] (2)將透明質(zhì)酸鈉水溶液、膠原蛋白水溶液、幾丁糖水溶液混合，加入配方量人骨 形成蛋白、硫酸軟骨素、硫酸肝素和硫酸氨基葡萄糖，攪拌均勻；
[0054] (3)加入配方量的等滲調(diào)節(jié)劑和pH調(diào)節(jié)劑，得混合液；
[0055] (4)將得到的混合液進行冷凍干燥，干燥完成后進行納米制粒；
[0056] (5)將制得的納米微球與配方量的去離子水充分混合，混合后的懸濁液即為關節(jié) 腔用類細胞外基質(zhì)多糖類納米注射液。
[0057] 實施例4
[0058] 1.注射液配方
[0059] 一種關節(jié)腔用類細胞外基質(zhì)多糖類納米注射液，其包括以下組分:2wt%的透明質(zhì) 酸鈉、3wt%的Π 型膠原蛋白、lwt%的人骨形成蛋白-7、3wt%的硫酸軟骨素、lwt%的硫酸 肝素、2wt %的硫酸氨基葡萄糖、O . Iwt %的幾丁糖、O . 3wt %的氯化鈉、pH調(diào)節(jié)劑和去離子 水，pH調(diào)節(jié)劑的加入量為使注射液的pH為6.0。
[0060]其中，注射液的PH采用磷酸鹽緩沖液和硼酸緩沖液以任意比例混溶來調(diào)節(jié)。
[0061 ] 注射液中納米微球的粒徑為lOOOnm。
[0062] 2.注射液的制備方法
[0063] (1)取配方量的透明質(zhì)酸鈉溶于去離子水中制成透明質(zhì)酸鈉水溶液，將膠原蛋白 溶于去離子水中制成膠原蛋白水溶液，將幾丁糖溶于去離子水中制成幾丁糖水溶液；
[0064] (2)將透明質(zhì)酸鈉水溶液、膠原蛋白水溶液、幾丁糖水溶液混合，加入配方量人骨 形成蛋白、硫酸軟骨素、硫酸肝素和硫酸氨基葡萄糖，攪拌均勻；
[0065] (3)加入配方量的等滲調(diào)節(jié)劑和pH調(diào)節(jié)劑，得混合液；
[0066] (4)將得到的混合液進行冷凍干燥，干燥完成后進行納米制粒；
[0067] (5)將制得的納米微球與配方量的去離子水充分混合，混合后的懸濁液即為關節(jié) 腔用類細胞外基質(zhì)多糖類納米注射液。
[0068] 對比例1
[0069] 一種關節(jié)腔用類細胞外基質(zhì)多糖類納米注射液，其包括以下組分:3.5wt %的透明 質(zhì)酸鈉、3wt %的Π 型膠原蛋白、Iwt %的硫酸軟骨素、0.5wt %的硫酸肝素、2wt %的硫酸氨 基葡萄糖、0.5wt %的幾丁糖、0.5wt %的等滲調(diào)節(jié)劑、pH調(diào)節(jié)劑和去離子水，pH調(diào)節(jié)劑的加 入量為使注射液的pH為6.0。
[0070] 其中，注射液的pH采用磷酸鹽緩沖液和硼酸緩沖液以任意比例混溶來調(diào)節(jié)。
[0071] 注射液中納米微球的粒徑為lOOOnm。
[0072] 2.注射液的制備方法
[0073] (1)取配方量的透明質(zhì)酸鈉溶于去離子水中制成透明質(zhì)酸鈉水溶液，將膠原蛋白 溶于去離子水中制成膠原蛋白水溶液，將幾丁糖溶于去離子水中制成幾丁糖水溶液；
[0074] (2)將透明質(zhì)酸鈉水溶液、膠原蛋白水溶液、幾丁糖水溶液混合，加入配方量硫酸 軟骨素、硫酸肝素和硫酸氨基葡萄糖，攪拌均勻；
[0075] (3)加入配方量的等滲調(diào)節(jié)劑和pH調(diào)節(jié)劑，得混合液；
[0076] (4)將得到的混合液進行冷凍干燥，干燥完成后進行納米制粒；
[0077] (5)將制得的納米微球與配方量的去離子水充分混合，混合后的懸濁液即為關節(jié) 腔用類細胞外基質(zhì)多糖類納米注射液。
[0078] 對比例2
[0079] 1.注射液配方
[0080] 一種關節(jié)腔用類細胞外基質(zhì)多糖類納米注射液，其包括以下組分:3.5wt %的透明 質(zhì)酸鈉 、Iwt %的人骨形成蛋白-7、Iwt %的硫酸軟骨素、0.5wt %的硫酸肝素、2wt %的硫酸 氨基葡萄糖、0.5 w t %的幾丁糖、0.5 w t %的等滲調(diào)節(jié)劑、p H調(diào)節(jié)劑和去離子水，p H調(diào)節(jié)劑的 加入量為使注射液的pH為6.0。
[0081 ]其中，注射液的pH采用磷酸鹽緩沖液和硼酸緩沖液以任意比例混溶來調(diào)節(jié)。
[0082] 注射液中納米微球的粒徑為I OOOnm。
[0083] 2.注射液的制備方法
[0084] (1)取配方量的透明質(zhì)酸鈉溶于去離子水中制成透明質(zhì)酸鈉水溶液，將幾丁糖溶 于去離子水中制成幾丁糖水溶液；
[0085] (2)將透明質(zhì)酸鈉水溶液、幾丁糖水溶液混合，加入配方量人骨形成蛋白、硫酸軟 骨素、硫酸肝素和硫酸氨基葡萄糖，攪拌均勻；
[0086] (3)加入配方量的等滲調(diào)節(jié)劑和pH調(diào)節(jié)劑，得混合液；
[0087] (4)將得到的混合液進行冷凍干燥，干燥完成后進行納米制粒；
[0088] (5)將制得的納米微球與配方量的去離子水充分混合，混合后的懸濁液即為關節(jié) 腔用類細胞外基質(zhì)多糖類納米注射液。
[0089] 對比例3
[0090] 1.注射液配方
[0091] -種關節(jié)腔用類細胞外基質(zhì)多糖類注射液，其包括以下組分:3.5wt%的透明質(zhì)酸 鈉 、Iwt %的人骨形成蛋白-7、Iwt %的硫酸軟骨素、0.5wt %的硫酸肝素、2wt %的硫酸氨基 葡萄糖、〇. 5wt %的幾丁糖、0.5wt %的等滲調(diào)節(jié)劑、pH調(diào)節(jié)劑和去離子水，pH調(diào)節(jié)劑的加入 量為使注射液的pH為6.0。
[0092] 其中，注射液的pH采用磷酸鹽緩沖液和硼酸緩沖液以任意比例混溶來調(diào)節(jié)。
[0093] 2.制備方法
[0094] (1)將配方量透明質(zhì)酸鈉、Π 型膠原蛋白、人骨形成蛋白-7、幾丁糖、硫酸肝素、硫 酸軟骨素、硫酸氨基葡萄糖、溶于去離子水溶液中，形成混合溶液；
[0095] (2)將NaCl加入上述步驟(1)中的混合溶液中充分攪拌均勻；
[0096] (3)向步驟(2)中的溶液加入pH調(diào)節(jié)劑，調(diào)節(jié)pH值為6.0,最后將所得產(chǎn)物進行除菌 并分裝至注射器。
[0097] 二、動物實驗
[0098]本實驗主要研究小關節(jié)用納米注射液對創(chuàng)傷性關節(jié)炎家兔模型療效觀察，具體步 驟如下：
[0099] (1)選取8~15月齡2.0~3.Okg(罕）家兔50只，40只用于造模，10只為正常對照；
[0100] (2)將40只造模的兔子用戊巴比妥鈉麻醉后，選擇動物右膝關節(jié)消毒，按文獻的方 法進行半月板切除術，然后將皮膚縫合，當天開始進行青霉素肌注，共7天；
[0101] (3)將40只造模的兔子隨機分成A、B、C、D四組，每組10只，A組兔子用實施例1制備 的注射液給予每次2ml治療，3天注射一次，連續(xù)6周注射;B組兔子用對比例1注射液給予每 次2ml治療，3天注射一次，連續(xù)6周注射;C組用對比例2注射液給予每次2ml治療，3天注射一 次，連續(xù)6周注射;D組用對比例3注射液給予每次2ml治療，3天注射一次，連續(xù)6周注射；10只 正常對照組為E組，E組的兔子正常未受傷；
[0102] (4)術后12、14、16周后各取一次動物血液標本檢測血樣中TNF-α含量。將TNF-α標 準品加緩沖液ImL，調(diào)節(jié)濃度分別為0.3、0.9、2.7、8.1、24.3yg/L，各取IOOyL加入試管中，再 依次加入125I-TNF及抗TNF-a血清IOOyL至標準管中，充分混勻后40°C放置24h，再加入PR分 離劑500yL混勾，放置20min，4°C離心，3500r/min離心25min。吸棄上清，在自動γ計數(shù)器上 測定沉淀數(shù)，繪制標準曲線并計算樣品濃度，統(tǒng)計方差分析組間差異。檢測結果如表1所示：
[0103] 表1家兔不同時間點血漿、關節(jié)液中TNF-a含量結果
[0105] (5)結果:對比例1為不含有人骨形成蛋白-7的注射液，對比例2為不含有Π 型膠原 蛋白的注射液，對比例3為非納米注射液。五組家兔關節(jié)情況為祕且< (：組<0組 < 六組<Ε組。 造模后12周，A組、B組、C組、D組血漿及關節(jié)沖洗液TNF-α含量均明顯高于E組(ρ <0.01)。且 12、14、16、18周各個時間點的TNF-a含量，D組、C組、B組顯著高于A組、E組，A組各時間點的 TNF-a含量均最低(p<〇.〇5)，見表1。由此可知，A組效果最為顯著。
[0106] 對本領域的技術人員來說，可根據(jù)以上描述的技術方案以及構思，做出其它各種 相應的改變以及形變，而所有的這些改變以及形變都應該屬于本發(fā)明權利要求的保護范圍 之內(nèi)。
【主權項】
1. 一種關節(jié)腔用類細胞外基質(zhì)多糖類納米注射液，其包括以下組分：l-4wt%的透明質(zhì) 酸鈉、2-5wt %的膠原蛋白、0 · 5-1 · 5wt %的人骨形成蛋白、0 · 2-3wt %的硫酸軟骨素、0 · 1-lwt %的硫酸肝素、l-4wt %的硫酸氨基葡萄糖、0 · l-5wt %的幾丁糖、0 · 2-0 · 8wt%的等滲調(diào) 節(jié)劑、pH調(diào)節(jié)劑和去離子水，pH調(diào)節(jié)劑的加入量為使注射液的pH為6.0-7.0。2. 根據(jù)權利要求1所述的關節(jié)腔用類細胞外基質(zhì)多糖類納米注射液，其包括以下組分： 3.5wt%的透明質(zhì)酸鈉、3wt%的膠原蛋白、lwt%的人骨形成蛋白、lwt%的硫酸軟骨素、 0.5wt %的硫酸肝素、2wt %的硫酸氨基葡萄糖、0.5wt %的幾丁糖、0.5wt %的等滲調(diào)節(jié)劑、 pH調(diào)節(jié)劑和去離子水，pH調(diào)節(jié)劑的加入量為使注射液的pH為6.0-7.0。3. 根據(jù)權利要求1所述的關節(jié)腔用類細胞外基質(zhì)多糖類納米注射液，其特征在于:所述 注射液的pH采用磷酸鹽緩沖液和/或硼酸緩沖液調(diào)節(jié)，當采用磷酸鹽緩沖液和硼酸緩沖液 調(diào)節(jié)時，磷酸鹽緩沖液與硼酸緩沖液以任意比例混溶。4. 根據(jù)權利要求1所述的關節(jié)腔用類細胞外基質(zhì)多糖類納米注射液，其特征在于:所述 等滲調(diào)節(jié)劑為氯化鈉。5. 根據(jù)權利要求1所述的關節(jié)腔用類細胞外基質(zhì)多糖類納米注射液，其特征在于:所述 膠原蛋白為Π 型膠原蛋白。6. 根據(jù)權利要求1所述的關節(jié)腔用類細胞外基質(zhì)多糖類納米注射液，其特征在于:所述 人骨形成蛋白為人骨形成蛋白-7。7. -種如權利要求1-6任一項所述的關節(jié)腔用類細胞外基質(zhì)多糖類納米注射液的制備 方法，其特征在于:包括以下步驟： (1) 取配方量的透明質(zhì)酸鈉溶于去離子水中制成透明質(zhì)酸鈉水溶液，將膠原蛋白溶于 去離子水中制成膠原蛋白水溶液，將幾丁糖溶于去離子水中制成幾丁糖水溶液； (2) 將透明質(zhì)酸鈉水溶液、膠原蛋白水溶液、幾丁糖水溶液混合，加入配方量人骨形成 蛋白、硫酸軟骨素、硫酸肝素和硫酸氨基葡萄糖，攪拌均勻； (3) 加入配方量的等滲調(diào)節(jié)劑和pH調(diào)節(jié)劑，得混合液； (4) 將得到的混合液進行冷凍干燥，干燥完成后進行納米制粒； (5) 將制得的納米微球與配方量的去離子水充分混合，混合后的懸濁液即為關節(jié)腔用 類細胞外基質(zhì)多糖類納米注射液。8. 根據(jù)權利要求7所述的關節(jié)腔用類細胞外基質(zhì)多糖類納米注射液的制備方法，其特 征在于:步驟(5)中納米微球的粒徑為10-1000nm。
【文檔編號】A61K38/18GK106075408SQ201610590916
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月26日 公開號201610590916.6, CN 106075408 A, CN 106075408A, CN 201610590916, CN-A-106075408, CN106075408 A, CN106075408A, CN201610590916, CN201610590916.6
【發(fā)明人】張軍東, 陳晚華, 吳劍英, 常臻
【申請人】上海建華精細生物制品有限公司