本發(fā)明涉及一株高產(chǎn)氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法與應(yīng)用，特別涉及一株利用glms核糖開關(guān)構(gòu)建高產(chǎn)氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌的方法及應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

氨基葡萄糖(GlcN)是一種天然存在于結(jié)締組織和胃腸道粘膜中的氨基單糖，內(nèi)源性GlcN在動(dòng)物和人體細(xì)胞內(nèi)由葡萄糖轉(zhuǎn)化生成，可以合成黏多糖、糖蛋白和蛋白聚糖，特別是合成關(guān)節(jié)軟骨以及滑液分子的中間物，臨床試驗(yàn)表明，外源性氨糖對(duì)于人體和動(dòng)物體內(nèi)的骨關(guān)節(jié)炎具有很好的療效，此外還具有抗腫瘤活性等生理功能。目前商品化的GlcN幾乎全部是來自蝦、蟹等甲殼原料的高溫水解，生產(chǎn)過程需要高溫和強(qiáng)酸處理，排放的廢液嚴(yán)重污染環(huán)境，因此尋找一株安全生產(chǎn)GlcN的微生物，利用生物法合成GlcN具有重要意義。利用微生物發(fā)酵直接合成GlcN的優(yōu)勢(shì)主要有：1)生產(chǎn)原料來源簡(jiǎn)單，獲取不受地域限制；2)轉(zhuǎn)化條件溫和，不需高溫、高壓過程，能耗低；3)生產(chǎn)過程中無需加入強(qiáng)酸、強(qiáng)堿，不產(chǎn)生高鹽廢水，對(duì)環(huán)境污染?。?)產(chǎn)品無魚腥味及微量致敏性物質(zhì)，不會(huì)對(duì)體質(zhì)過敏者造成過敏反應(yīng)，更適合于在醫(yī)藥和保健領(lǐng)域的應(yīng)用。

中國(guó)專利文獻(xiàn)CN104195094A(申請(qǐng)?zhí)?01410376584.2)公開了一種生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢桿菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。該基因工程菌通過在枯草芽孢桿菌中表達(dá)編碼6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因、6-磷酸氨基葡萄糖乙?；富颍纬赏暾膹钠咸烟堑絅-乙酰氨基葡萄糖的代謝通路；敲除或失活枯草芽孢桿菌中N-乙酰氨基葡萄糖分解代謝途徑中的6-磷酸氨基葡萄糖脫氨酶基因nagB和gamA、6-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶基因nagA、氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因gamP和N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因nagP構(gòu)建而成，它解決了現(xiàn)有技術(shù)中所生產(chǎn)的N-乙酰氨基葡萄糖安全性差、產(chǎn)量低、成本高的問題。但其無法解決在發(fā)酵過程種實(shí)時(shí)檢測(cè)氨基葡萄糖變化的問題。

glms核糖開關(guān)是至今發(fā)現(xiàn)的唯一能夠調(diào)控糖代謝的核糖開關(guān)，只存在于革蘭氏陽性菌中，位于編碼glmS的mRNA的5'UTR內(nèi)，它需要小分子物質(zhì)GlcN-6P才能激活，這在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的核酶中是非常少見的，目前對(duì)glms核糖開關(guān)的相關(guān)研究較少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)先游戲技術(shù)的不足，提供一株高產(chǎn)氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法與應(yīng)用。該方法利用glms核糖開關(guān)基因并以此構(gòu)建了一株高產(chǎn)氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌株，該菌株可應(yīng)用于GlcN的合成。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

一株高產(chǎn)氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于，將來自釀酒酵母的GFA1基因、glms核糖開關(guān)基因和EGFP增強(qiáng)型熒光蛋白編碼基因轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌中，構(gòu)建獲得高產(chǎn)氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌；

所述glms核糖開關(guān)基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，EGFP增強(qiáng)型熒光蛋白編碼基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，GFA1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述構(gòu)建方法，具體步驟如下：

(1)提取大腸桿菌中的質(zhì)粒pEGFP-N1，以質(zhì)粒pEGFP-N1為模板，使用引物EGFP-F和EGFP-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得EGFP增強(qiáng)型熒光蛋白編碼基因；所述引物核苷酸序列如下：

EGFP-F:CTTCTTTTTAATGGTGAGCAAGGGCGAGGA；

EGFP-R:TCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCA；

(2)提取枯草芽孢桿菌168的基因組DNA，以基因組DNA為模板，使用引物glms-F和glms-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得glms核糖開關(guān)基因；所述引物核苷酸序列如下：

glms-F:TCCCAATTCGAAGTCTATTATCAGAGAGTG；

glms-R:GGATCCATTTTTCTTCCTCCTAAGATTGTAA；

(3)提取釀酒酵母s288c菌體基因組DNA，以基因組DNA為模板，使用引物Gfa1-F和Gfa1-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得GFA1基因；所述引物核苷酸序列如下：

Gfa1-F:GGATCCATGTGTGGTATCTTTGGTT；

Gfa1-R:AATAGACTTCGTTATTCGACGGTAA；

(4)將步驟(1)制得的EGFP增強(qiáng)型熒光蛋白編碼基因與步驟(2)制得的glms核糖開關(guān)基因經(jīng)重疊PCR，制得glms-EGFP片段；

(5)將步驟(3)制得的GFA1基因與步驟(4)制得的glms-EGFP片段經(jīng)重疊PCR，制得GFA1-glms-EGFP片段；

(6)將步驟(6)制得的GFA1-glms-EGFP片段連接到表達(dá)載體PHT01上，制得重組表達(dá)載體；然后轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB800N感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性重組菌，制得高產(chǎn)氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中的PCR擴(kuò)增體系如下，總體系為50μl：

2×HiFi-PCR master 25μl，濃度10μmol/L的引物EGFP-F 2μl，濃度10μmol/L的引物EGFP-R 2μl，模板2μl，ddH₂O補(bǔ)足50μl；

所述的PCR擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；-20℃保存。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中的PCR擴(kuò)增體系如下，總體系為50μl：

2×HiFi-PCR master 25μl，濃度10μmol/L的引物glms-F 2μl，濃度10μmol/L的引物glms-R2μl，模板2μl，ddH₂O補(bǔ)足50μl；

所述的PCR擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；-20℃保存。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中的PCR擴(kuò)增體系如下，總體系為50μl：

2×HiFi-PCR master 25μl，濃度10μmol/L的引物Gfa1-F 2μl，濃度10μmol/L的引物Gfa1-R2μl，模板2μl，ddH₂O補(bǔ)足50μl；

所述的PCR擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸4min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；-20℃保存。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中，所述重疊PCR的初次擴(kuò)增體系如下，總體系為25μl：

glms核糖開關(guān)基因4μl；EGFP增強(qiáng)型熒光蛋白編碼基因4μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O 4.5μl；

所述重疊PCR的初次擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1.5min，5個(gè)循環(huán)；72℃延伸2min；

所述重疊PCR的補(bǔ)充擴(kuò)增體系如下，總體系為25μl：

濃度10μmol/L的上游引物glms-F 2μl；濃度10μmol/L的下游引物EGFP-R 2μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O 8.5μl；

所述重疊PCR的補(bǔ)充擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸5min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；-20℃保存。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(5)中，所述重疊PCR的初次擴(kuò)增體系如下，總體系為25μl：

GFA1基因4μl；glms-EGFP片段4μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O 4.5μl；

所述的重疊PCR的初次擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，5個(gè)循環(huán)；72℃延伸2min；

所述的重疊PCR的補(bǔ)充擴(kuò)增體系為25μl：

濃度10μmol/L的上游引物GFA1-F 2μl；濃度10μmol/L的下游引物EGFP-R 2μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O 8.5μl；

所述的重疊PCR的補(bǔ)充擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸7min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；-20℃保存。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(6)中，連接步驟如下：

將GFA1-glms-EGFP片段經(jīng)BamH I和Xba I雙酶切后，與同樣經(jīng)BamH I和Xba I雙酶切后的表達(dá)載體PHT01通過T4連接酶在16℃條件下連接12h，連接體系如下：

GFA1-glms-EGFP片段3μL，PHT01質(zhì)粒1μL，T4連接酶1μL，T4buffer 1μL，加ddH₂O至10μL。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(6)中，轉(zhuǎn)化條件為：2mm電轉(zhuǎn)杯、2500v脈沖條件下電擊轉(zhuǎn)化，時(shí)間常數(shù)＝5.0ms。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(6)中，篩選陽性重組菌的步驟如下：

將轉(zhuǎn)化后的枯草芽孢桿菌WB800N涂布在含25μg/ml氯霉素的LB平板上，在37℃培養(yǎng)14～18h，篩選具有氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化子并轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，利用引物GFA1-F和EGFP-R對(duì)菌體中的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增進(jìn)行驗(yàn)證。

上述構(gòu)建方法制備的高產(chǎn)氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌。

上述高產(chǎn)氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌在制備氨基葡萄糖中的應(yīng)用，步驟如下：

將高產(chǎn)氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌種子液按2％的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在35～38℃、150～300rpm的條件下培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.8～0.9，然后加入IPTG至濃度為0.5mM，24～26℃誘導(dǎo)培養(yǎng)6h；然后經(jīng)菌體破碎，純化，制得氨基葡萄糖。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述高產(chǎn)氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌種子的制備步驟如下：

將高產(chǎn)氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌接種于種子培養(yǎng)基中，在35～38℃的條件下培養(yǎng)5～8h。

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述種子培養(yǎng)基組分如下：

蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl 10g/L。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下：

葡萄糖50g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl 10g/L。

有益效果

1、本發(fā)明首次將glms核糖開關(guān)和EGFP基因連接在PHT01中，構(gòu)建成GLMS-EGFP傳感器，響應(yīng)枯草芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)6-磷酸氨基葡萄糖量的變化而表現(xiàn)出熒光強(qiáng)度的變化，通過流式細(xì)胞儀，可以實(shí)時(shí)掌握氨基葡萄糖的合成情況；

2、本發(fā)明構(gòu)建的高產(chǎn)氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌可以使氨基葡萄糖實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，并且可以通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)菌體熒光強(qiáng)度，來指示氨基葡萄糖的胞內(nèi)產(chǎn)生量；可通過觀察熒光強(qiáng)度確定最佳發(fā)酵條件，誘導(dǎo)時(shí)間等。有利于高產(chǎn)氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌的使用，為進(jìn)一步提高氨基葡萄糖產(chǎn)量奠定了基礎(chǔ)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是PHT01-GFA1-glms-EGFP構(gòu)建示意圖；

圖2是流式細(xì)胞儀觀測(cè)的WB800N菌體熒光情況結(jié)果圖；

圖3是最優(yōu)誘導(dǎo)條件下流式細(xì)胞儀觀測(cè)的工程菌菌體的熒光情況結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。

生物材料來源：

質(zhì)粒PHT01購自杭州寶賽生物有限公司

大腸桿菌pEGFP-N1購自杭州寶賽生物有限公司

枯草芽孢桿菌168購自杭州寶賽生物有限公司

枯草芽孢桿菌WB800N購自杭州寶賽生物有限公司

實(shí)施例1

一株高產(chǎn)氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法，步驟如下：

(1)提取大腸桿菌中的質(zhì)粒pEGFP-N1，以質(zhì)粒pEGFP-N1為模板，使用引物EGFP-F和EGFP-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得EGFP增強(qiáng)型熒光蛋白編碼基因；EGFP增強(qiáng)型熒光蛋白編碼基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述引物核苷酸序列如下：

EGFP-F:CTTCTTTTTAATGGTGAGCAAGGGCGAGGA；

EGFP-R:TCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCA；

所述的PCR擴(kuò)增體系如下，總體系為50μl：

2×HiFi-PCR master 25μl，濃度10μmol/L的引物EGFP-F 2μl，濃度10μmol/L的引物EGFP-R 2μl，模板2μl，ddH₂O補(bǔ)足50μl；

所述的PCR擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；-20℃保存。

(2)提取枯草芽孢桿菌168的基因組DNA，以基因組DNA為模板，使用引物glms-F和glms-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得glms核糖開關(guān)基因；所述glms核糖開關(guān)基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物核苷酸序列如下：

glms-F:TCCCAATTCGAAGTCTATTATCAGAGAGTG

glms-R:GGATCCATTTTTCTTCCTCCTAAGATTGTAA

所述的PCR擴(kuò)增體系為50μl：

2×HiFi-PCR master 25μl，引物glms-F(10μmol/L)2μl，引物glms-R(10μmol/L)2μl，模板2μl，用ddH₂O補(bǔ)足50μl；

所述的PCR擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，-20℃保存；

(3)提取釀酒酵母s288c菌體基因組DNA，以基因組DNA為模板，使用引物Gfa1-F和Gfa1-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得GFA1基因；GFA1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述引物核苷酸序列如下：

Gfa1-F:GGATCCATGTGTGGTATCTTTGGTT；

Gfa1-R:AATAGACTTCGTTATTCGACGGTAA；

所述的PCR擴(kuò)增體系如下，總體系為50μl：

2×HiFi-PCR master 25μl，濃度10μmol/L的引物Gfa1-F 2μl，濃度10μmol/L的引物Gfa1-R2μl，模板2μl，用ddH₂O補(bǔ)足50μl；

所述的PCR擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸4min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；-20℃保存。

(4)將步驟(1)制得的EGFP增強(qiáng)型熒光蛋白編碼基因與步驟(2)制得的glms核糖開關(guān)基因經(jīng)重疊PCR，制得glms-EGFP片段；

所述的重疊PCR的初次擴(kuò)增體系如下，總體系為25μl：

glms核糖開關(guān)基因4μl；EGFP增強(qiáng)型熒光蛋白編碼基因4μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O 4.5μl；

所述的重疊PCR的初次擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1.5min，5個(gè)循環(huán)；72℃延伸2min；

所述的重疊PCR的補(bǔ)充擴(kuò)增體系如下，總體系為25μl：

濃度10μmol/L的上游引物glms-F 2μl；濃度10μmol/L的下游引物EGFP-R 2μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O 8.5μl；

所述的重疊PCR的補(bǔ)充擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸5min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；-20℃保存。

(5)將步驟(3)制得的GFA1基因與步驟(4)制得的glms-EGFP片段經(jīng)重疊PCR，制得GFA1-glms-EGFP片段；

所述的重疊PCR的初次擴(kuò)增體系如下，總體系為25μl：

GFA1片段4μl；glms-EGFP片段4μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O 4.5μl；

所述的重疊PCR的初次擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，5個(gè)循環(huán)；72℃延伸2min；

所述的重疊PCR的補(bǔ)充擴(kuò)增體系如下，總體系為25μl：

上游引物GFA1-F 2μl；下游引物EGFP-R 2μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O 8.5μl；

所述的重疊PCR的補(bǔ)充擴(kuò)增程序如下：

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸7min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，-20℃保存；

(6)將步驟(6)制得的GFA1-glms-EGFP片段連接到表達(dá)載體PHT01上，制得重組表達(dá)載體；然后轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB800N感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性重組菌，制得高產(chǎn)氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌；

所述步驟(6)中，連接步驟如下：

將GFA1-glms-EGFP片段經(jīng)BamH I和Xba I雙酶切后，與同樣經(jīng)BamH I和Xba I雙酶切后的表達(dá)載體PHT01通過T4連接酶在16℃條件下連接12h，連接體系如下：

GFA1-glms-EGFP片段3μL，PHT01質(zhì)粒1μL，T4連接酶1μL，T4buffer 1μL，加ddH₂O至10μL。

所述步驟(6)中，轉(zhuǎn)化條件為：將感受態(tài)細(xì)胞以100μl每管分裝，采用2mm電轉(zhuǎn)杯，2500v脈沖條件下電擊轉(zhuǎn)化，時(shí)間常數(shù)＝5.0ms。

所述步驟(6)中，篩選陽性重組菌的步驟如下：

將轉(zhuǎn)化后的枯草芽孢桿菌WB800N涂布在含25μg/ml氯霉素的LB平板上，在37℃培養(yǎng)14～18h，篩選具有氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化子并轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，利用引物GFA1-F和EGFP-R對(duì)菌體中的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；瓊脂糖凝膠電泳證明重組質(zhì)粒PHT01轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌WB800N中。

實(shí)施例2

高產(chǎn)氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)氨基葡萄糖中的應(yīng)用，步驟如下：

1)從含氯霉素25μg/mL的LB平板挑取高產(chǎn)氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌單菌落轉(zhuǎn)接于3mL LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200rpm條件下過夜培養(yǎng)，制得種子液；

LB平板每升組分如下：

胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，瓊脂粉15g，水定容至1L，pH值7.0。

LB液體培養(yǎng)基每升組分如下：

胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，水定容至1L，pH值7.0。

2)將種子液接種于含氯霉素25μg/mL的100mL LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、200rpm培養(yǎng)，分別按表1中的條件誘導(dǎo)表達(dá)。

表1枯草芽孢桿菌氨基葡萄糖合酶表達(dá)條件優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)表

3)將誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后的發(fā)酵液離心收集菌體，用PBS緩沖液重懸菌體，洗滌菌體三次，最后用適量PBS緩沖液懸浮菌體，用流式細(xì)胞儀觀察菌體熒光強(qiáng)度，設(shè)置激發(fā)光波長(zhǎng)為480nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為610nm，速度為300個(gè)粒子/sec，通過比較檢測(cè)不同批次發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌體熒光強(qiáng)度和氨基葡萄糖的含量，可以用熒光強(qiáng)度表示氨基葡萄糖的產(chǎn)生量?？赏ㄟ^觀察熒光強(qiáng)度確定最佳發(fā)酵條件結(jié)果如表2中所示。

通過對(duì)影響氨基葡萄糖產(chǎn)量的誘導(dǎo)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化的結(jié)果表明，以胞內(nèi)氨基葡萄糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)的最佳誘導(dǎo)條件為：誘導(dǎo)溫度25℃、培養(yǎng)時(shí)間6h、IPTG濃度0.5mM、誘導(dǎo)時(shí)間6h。熒光強(qiáng)度為65％，氨基葡萄糖產(chǎn)量為0.745g/L，如表2所示。

表2枯草芽孢桿菌氨基葡萄糖合酶表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果

對(duì)比例1

中國(guó)專利文獻(xiàn)CN104195094A(申請(qǐng)?zhí)?01410376584.2)公開了一種生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢桿菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。該基因工程菌通過在枯草芽孢桿菌中表達(dá)編碼6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因、6-磷酸氨基葡萄糖乙?；富颍纬赏暾膹钠咸烟堑絅-乙酰氨基葡萄糖的代謝通路；敲除或失活枯草芽孢桿菌中N-乙酰氨基葡萄糖分解代謝途徑中的6-磷酸氨基葡萄糖脫氨酶基因nagB和gamA、6-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶基因nagA、氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因gamP和N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因nagP構(gòu)建而成。

本申請(qǐng)與對(duì)比例1的不同之處在于對(duì)比例1中發(fā)酵液氨基葡萄糖的含量是通過高效液相色譜法測(cè)定，此方法獲得的數(shù)據(jù)相對(duì)滯后，不能及時(shí)監(jiān)測(cè)到細(xì)胞內(nèi)氨基葡萄糖的變化。本申請(qǐng)利用核糖開關(guān)構(gòu)建的生物傳感器可以通過綠色熒光蛋白的亮度反映氨基葡萄糖的產(chǎn)生量，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)GlcN-6P濃度較高時(shí)將反饋抑制glmS的表達(dá)，就會(huì)檢測(cè)到GFP熒光降低；而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的GlcN-6P濃度降低時(shí)，glmS的抑制解除，GFP熒光又會(huì)升高，達(dá)到實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)GlcN-6P濃度變化的目的，為更加及時(shí)進(jìn)行過程代謝的調(diào)控提高GlcN的生物合成提供幫助。