關(guān)節(jié)軟骨成像組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供能夠?qū)㈥P(guān)節(jié)軟骨的正常部位和非正常的變性部位明確區(qū)別并可視化的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物。關(guān)節(jié)軟骨成像組合物含有陽性帶電分子，陽性帶電分子用標(biāo)記分子進(jìn)行了標(biāo)記。
【專利說明】
關(guān)節(jié)軟骨成像組合物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及通過特異性吸附于關(guān)節(jié)軟骨的損傷部位，使關(guān)節(jié)軟骨的損傷部位可視化的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物。
【背景技術(shù)】
[0002]變形性關(guān)節(jié)癥(0A!osteoarthritis)是被認(rèn)為是關(guān)節(jié)軟骨的變性為主要原因而產(chǎn)生的關(guān)節(jié)疾病，多見于膝或胯、大腿骨等。作為其發(fā)病原因，除了年齡增加和超負(fù)荷以外，也因運(yùn)動損傷和肥胖而引起。其中，變形性膝關(guān)節(jié)癥的患者數(shù)在日本國內(nèi)推測為2530萬人(2009年、東京大學(xué)醫(yī)學(xué)部附屬病院22世紀(jì)醫(yī)療中心ROAD項(xiàng)目)，在美國推測為日本的一倍以上。另外，在人口密集地、被認(rèn)為勞動條件和環(huán)境條件等比日本嚴(yán)峻的中國和印度、非洲諸國等，OA的患者數(shù)今后會不斷增加?，F(xiàn)在，在日本國內(nèi)，一年7萬5000人(2011年、矢野經(jīng)濟(jì)研究所)接受了作為最終治療法的、全人工膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)。人工關(guān)節(jié)置換其自身為高度侵入性的治療，同時(shí)，人工關(guān)節(jié)有機(jī)械壽命，需要根據(jù)情況反復(fù)更換。
[0003]為了防止變形性膝關(guān)節(jié)癥的惡化，避免最終的人工關(guān)節(jié)置換手術(shù)，重要的是早期接受恰當(dāng)?shù)闹委?。因此，軟骨變性的早期發(fā)現(xiàn)成為必要，但是，在以往的X射線(倫琴射線)攝像和MRI檢查中，很難發(fā)現(xiàn)初期階段的軟骨變性。另外，通過使用作為內(nèi)窺鏡的一種的關(guān)節(jié)鏡來觀察軟骨，也能檢查有無軟骨變性，但是，該方法是擔(dān)當(dāng)醫(yī)生通過在關(guān)節(jié)鏡下用鉗子等器具感受軟骨表層部位的觸覺來判斷的。因此，對于早期發(fā)現(xiàn)而言，依賴于醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)和技能的部分較大，而且，存在正常軟骨與變性軟骨的邊界不能明確識別的問題。
[0004]若有不僅僅依賴醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)和技能、能夠早期發(fā)現(xiàn)軟骨變性的非侵入性或低侵入性的檢查方法，就容易把握有無軟骨變性和軟骨變性的發(fā)展情況，確立治療方針。作為非侵入性或低侵入性的檢查方法，有利用將肌體組織可視化的in vivo成像技術(shù)的方法。關(guān)于invivo成像技術(shù)，有正電子放射斷層造影法(PET)或核磁共振成像(MRI)、超聲波成像(Ultrasonography:US)或光聲成像(Photoacoustic Imaging:PAI)等各種技術(shù)。除此之外，使熒光物質(zhì)集中于肌體內(nèi)的相關(guān)部位、高靈敏度地捕獲的熒光分子斷層成像(Fluorescence Molecular Tomography:FMT)等焚光成像技術(shù)，由于能非侵入地使相關(guān)部位進(jìn)行特異性的可視化，從而被關(guān)注。
[0005]為了將上述invivo熒光成像技術(shù)適用于關(guān)節(jié)軟骨，提出了幾種與關(guān)節(jié)軟骨組織特異性結(jié)合并集聚的成像探針的技術(shù)。在專利文獻(xiàn)I中，作為與軟骨基質(zhì)特異性結(jié)合的軟骨標(biāo)記物，記載有使熒光物質(zhì)等信號發(fā)生機(jī)構(gòu)與6?20個(gè)精氨酸殘基的聚精氨酸肽或6?20個(gè)賴氨酸殘基的聚賴氨酸肽結(jié)合而得到的軟骨標(biāo)記物。另外，在專利文獻(xiàn)2中，記載有由賴氨酸低聚物衍生物構(gòu)成的軟骨組織標(biāo)記物，該賴氨酸低聚物衍生物是通過使能產(chǎn)生或吸收電磁波的基團(tuán)結(jié)合于賴氨酸低聚物上而得到的，所述賴氨酸低聚物是賴氨酸的ε_氨基和羧基利用肽鍵連接而成的。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0007]專利文獻(xiàn)
[0008]專利文獻(xiàn)I:日本特開2009-023993號公報(bào)
[0009]專利文獻(xiàn)2:國際公開第2013/137302號

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]發(fā)明要解決的課題
[0011]但是，在專利文獻(xiàn)I以及專利文獻(xiàn)2中，雖然記載了這些軟骨標(biāo)記物相對于正常關(guān)節(jié)軟骨特異性結(jié)合，但是，沒記載相對于非正常的、例如變形性關(guān)節(jié)癥那樣的變性了的軟骨顯示何種性質(zhì)。即，現(xiàn)狀是存在下述問題:不存在將關(guān)節(jié)軟骨的正常部位和非正常部位明確區(qū)別并可視化的診斷用的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物。
[0012]另外，如上所述，一直在尋求不那么需要醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)和技能、能早期發(fā)現(xiàn)軟骨變性的檢查方法。
[0013]本發(fā)明鑒于上述的點(diǎn)而提出，其目的在于提供能夠?qū)㈥P(guān)節(jié)軟骨的正常部位和非正常部位明確區(qū)別并可視化的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物。
[0014]另外，本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供能夠容易進(jìn)行軟骨變性的早期發(fā)現(xiàn)和變性程度的精密的識別、有助于早期的治療方針的決定的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物。
[0015]用于解決課題的手段
[0016]為解決上述課題，本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物含有陽性帶電分子，該陽性帶電分子用標(biāo)記分子進(jìn)行了標(biāo)記。正常軟骨中，表面平坦的細(xì)胞構(gòu)成多層重疊而成的表層，但是，變性了的軟骨成為細(xì)胞層剝離從而纖維質(zhì)多的不規(guī)則的組織結(jié)構(gòu)的軟骨基質(zhì)露出的狀態(tài)、或者從表層向深部缺損的狀態(tài)。本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物含有用標(biāo)記分子進(jìn)行了標(biāo)記的陽性帶電分子，該陽性帶電分子重點(diǎn)滲透及吸附于露出的軟骨基質(zhì)上。這樣，本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物重點(diǎn)吸附于軟骨發(fā)生了變性的部分，因此，能將關(guān)節(jié)軟骨的正常部位和非正常的變性部位區(qū)別并可視化。
[0017]另外，本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物的陽性帶電分子優(yōu)選為陽性帶電的蛋白質(zhì)或肽化合物。作為構(gòu)成關(guān)節(jié)軟骨成像組合物的陽性帶電分子，選擇肌體內(nèi)也廣泛存在、安全性高、操作也容易、標(biāo)記分子的標(biāo)記也能夠簡單地進(jìn)行的物質(zhì)。
[0018]本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物的蛋白質(zhì)或肽化合物優(yōu)選為白蛋白、白蛋白分解物或白蛋白的修飾化合物。由此，可選擇合適的物質(zhì)作為構(gòu)成陽性帶電分子的蛋白質(zhì)或肽化合物。
[0019]而且，本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物的陽性帶電分子優(yōu)選為陽性帶電的糖鏈化合物。作為構(gòu)成關(guān)節(jié)軟骨成像組合物的陽性帶電分子，選擇肌體內(nèi)也廣泛存在、安全性高、操作也容易、標(biāo)記分子的標(biāo)記也能夠簡單進(jìn)行的物質(zhì)。
[0020]本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物的糖鏈化合物優(yōu)選為葡聚糖、環(huán)糊精或它們的衍生物。由此，可選擇合適的物質(zhì)作為構(gòu)成陽性帶電分子的糖鏈化合物。
[0021]而且，本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物的標(biāo)記分子優(yōu)選選自由熒光物質(zhì)、放射性同位素、X射線吸收物質(zhì)、抗體分子及具有可被特異性抗體識別的識別部位的分子組成的組中的至少一種物質(zhì)。上述陽性帶電分子等用標(biāo)記分子進(jìn)行了標(biāo)記，因此，能夠利用熒光物質(zhì)、放射性同位素、X射線吸收物質(zhì)、抗體分子或具有可被特異性抗體識別的識別部位的分子等標(biāo)記分子，將吸附于軟骨變性的部分的陽性帶電分子等的位置可視化。
[0022]另外，上述標(biāo)記分子中，熒光物質(zhì)優(yōu)選為吲哚菁綠。由此，可選擇安全性高、能夠有效進(jìn)行可視化和檢測的標(biāo)記分子。
[0023]另外，本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物的標(biāo)記分子還優(yōu)選為選自由磁性粒子、金屬粒子、金屬納米粒子以及含其他納米材料的物質(zhì)組成的組中的至少一種物質(zhì)。因此，關(guān)于吸附于軟骨變性的部分的陽性帶電分子等的位置，還能利用X射線CT、MR1、拉曼分光法、等離子體共振法等進(jìn)行檢測。
[0024]發(fā)明效果
[0025]根據(jù)本發(fā)明，能夠提供具有以下良好效果的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物。
[0026](I)能夠?qū)㈥P(guān)節(jié)軟骨的正常部位和非正常的變性部位明確區(qū)別并可視化。
[0027](2)能夠容易進(jìn)行軟骨變性的早期發(fā)現(xiàn)和變性程度的精密識別。
[0028](3)在利用關(guān)節(jié)鏡進(jìn)行的診斷或手術(shù)時(shí)，通過使用關(guān)節(jié)軟骨成像組合物，在肌體內(nèi)，能夠使關(guān)節(jié)軟骨的變性部位可視化，從而進(jìn)行診斷或治療。
[0029](4)通過在關(guān)節(jié)腔中注入關(guān)節(jié)軟骨成像組合物等，能夠利用in vivo成像技術(shù)，非侵入或低侵入地診斷軟骨的變性狀態(tài)。
[0030](5)由于由安全性高的物質(zhì)構(gòu)成，因此，也容易操作。另外，關(guān)于分解產(chǎn)物，安全性也同樣地高。
[0031](6)檢查或手術(shù)結(jié)束后，通過代謝、水解或利用組織液進(jìn)行稀釋，從而有效地被排除。
【附圖說明】
[0032]圖1是表示實(shí)施例1中的陽性帶電的牛血清白蛋白的等電點(diǎn)電泳的結(jié)果的照片。
[0033]圖2是表示由實(shí)施例2中的陽性帶電白蛋白或白蛋白與吲哚菁綠的結(jié)合帶來的熒光發(fā)光的結(jié)果的照片。
[0034]圖3是表示實(shí)施例3中的利用本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物進(jìn)行的損傷軟骨模型的成像結(jié)果的照片。
[0035]圖4是表示利用實(shí)施例4中的本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物進(jìn)行的對于軟骨損傷模型及無傷模型的成像結(jié)果的照片。
[0036]圖5是表示利用實(shí)施例5中的本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物進(jìn)行的對于人損傷軟骨的成像結(jié)果的照片。
【具體實(shí)施方式】
[0037]本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物中含有經(jīng)標(biāo)記的陽性帶電分子。在本發(fā)明中，所謂“陽性帶電分子”是指，具有陽性帶電(正電荷)、能夠選擇性地吸附于變性的軟骨上的分子。
[0038]軟骨被分類為結(jié)締組織，由作為豐富的細(xì)胞外基質(zhì)的軟骨基質(zhì)和散布在其中的軟骨細(xì)胞構(gòu)成。構(gòu)成關(guān)節(jié)的軟骨被稱作透明軟骨，該透明軟骨的軟骨基質(zhì)的主成分主要是膠原和蛋白多糖。該蛋白多糖含有硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素以及硫酸乙酰肝素等具有陰性電荷的側(cè)鏈，整體具有陰性電荷。正常軟骨中，表面平坦的細(xì)胞構(gòu)成多層重疊而成的表層，但是，變性了的軟骨成為細(xì)胞層剝離從而纖維質(zhì)多的不規(guī)則的組織結(jié)構(gòu)的軟骨基質(zhì)露出的狀態(tài)、或者從表層向深部缺損的狀態(tài)。推測本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物中所含的陽性帶電分子特異性地吸附于因軟骨組織的表層剝離而露出的軟骨基質(zhì)中的蛋白多糖上。
[0039]作為本發(fā)明中的陽性帶電分子，若為能夠選擇性地吸附于變性的軟骨上的分子，就沒有特別的限定，但是，從安全性和操作的容易性的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選陽性帶電的蛋白質(zhì)或肽化合物、或陽性帶電的糖鏈化合物。此外，在本說明書中，就“蛋白質(zhì)”而言，廣泛地包含糖蛋白或脂蛋白、核苷酸結(jié)合蛋白等。
[0040]作為通過陽性帶電化而被用作本發(fā)明中的陽性帶電分子的蛋白質(zhì)或肽化合物，優(yōu)選血漿蛋白質(zhì)或各種白蛋白，特別優(yōu)選血清白蛋白。另外，就血漿蛋白質(zhì)和各種白蛋白而言，也包含它們的分解物或修飾化合物。該陽性帶電化的白蛋白(陽離子化白蛋白)具有特異性地吸附于軟骨基質(zhì)、但是難以侵入軟骨組織的細(xì)胞內(nèi)的性質(zhì)。因而，該陽離子化白蛋白難以從正常軟骨組織的表層被攝入細(xì)胞內(nèi)部，存在于正常的軟骨組織的表層內(nèi)的軟骨基質(zhì)幾乎未被吸附。因此，陽離子化白蛋白被重點(diǎn)吸附于關(guān)節(jié)軟骨組織中非正常的變性部位。另夕卜，作為白蛋白或其分解物、修飾化合物的陽性帶電化的狀態(tài)，從向軟骨損傷部位進(jìn)行重點(diǎn)吸附的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選被陽性帶電化至等電點(diǎn)Pl為8以上，特別優(yōu)選為被陽性帶電化至等電點(diǎn)Pl為10以上。這樣，通過選擇具有難以侵入到軟骨組織的細(xì)胞中的性質(zhì)的白蛋白，將關(guān)節(jié)軟骨成像組合物適用于肌體時(shí)的安全性得以進(jìn)一步提高。另外，通過選擇分子量大的白蛋白分子，能夠增加標(biāo)記分子的標(biāo)記數(shù)，因此，例如，使用熒光物質(zhì)作為標(biāo)記分子時(shí)，能夠進(jìn)行提高亮度等的調(diào)節(jié)，利用標(biāo)記分子進(jìn)行的檢測、即可視化變得容易。
[0041]另外，作為通過與上述白蛋白同樣地陽性帶電化而被用作本發(fā)明中的陽性帶電分子的糖鏈化合物，優(yōu)選直鏈狀或環(huán)狀的糖鏈化合物，作為直鏈狀的糖鏈化合物，特別優(yōu)選葡聚糖或葡聚糖衍生物，作為環(huán)狀的糖鏈化合物，特別優(yōu)選環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物。這些陽性帶電的葡聚糖、環(huán)糊精或它們的衍生物與上述白蛋白同樣地具有特異性地吸附于軟骨基質(zhì)、但是難以侵入到軟骨組織的細(xì)胞內(nèi)的性質(zhì)。而且，這些陽離子化的葡聚糖或環(huán)糊精難以從正常軟骨組織的表層被攝入細(xì)胞內(nèi)部，存在于正常的軟骨組織的表層內(nèi)的軟骨基質(zhì)幾乎未被吸附。因此，陽離子化的葡聚糖或環(huán)糊精被吸附于關(guān)節(jié)軟骨組織中非正常的變性部位。此時(shí)，作為葡聚糖或環(huán)糊精，從難以侵入到軟骨組織的細(xì)胞內(nèi)的觀點(diǎn)考慮，分子量優(yōu)選為3，000以上，進(jìn)一步優(yōu)選為10，000以上。這樣，通過選擇具有難以侵入到軟骨組織的細(xì)胞中的性質(zhì)的葡聚糖或環(huán)糊精，將關(guān)節(jié)軟骨成像組合物適用于肌體時(shí)的安全性得以進(jìn)一步提高。另外，通過選擇分子量大的葡聚糖或環(huán)糊精，能夠增加標(biāo)記分子的標(biāo)記數(shù)，因此，例如使用熒光物質(zhì)作為標(biāo)記分子時(shí)，能夠進(jìn)行提高亮度等的調(diào)節(jié)，利用標(biāo)記分子進(jìn)行的檢測、即可視化變得容易。另外，關(guān)于環(huán)糊精，容易將標(biāo)記分子包接于該分子的內(nèi)部空洞，因此，能夠容易地得到本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物。
[0042]此外，在本發(fā)明中，所謂“關(guān)節(jié)軟骨成像”是指，使用裸眼或裝置等，利用圖像或數(shù)值或向量等手段將關(guān)節(jié)軟骨的狀態(tài)可視化(可見化)。對于可視化，也包括取關(guān)節(jié)軟骨組織的一部分進(jìn)行檢測的情況、在肌體內(nèi)(in situ)檢測的情況中的任一種，關(guān)于在肌體內(nèi)的可視化，除了通常的手術(shù)中的可視化以外，還包括使用了關(guān)節(jié)鏡的低侵入性的檢查或手術(shù)、或使用注射器等將本發(fā)明的組合物注入關(guān)節(jié)腔內(nèi)這樣的低侵入性的檢查中的可視化。
[0043]在本發(fā)明中，所謂標(biāo)記分子是指，通過直接或間接地結(jié)合于陽性帶電分子、或包接于陽性帶電分子中，從而在陽性帶電分子上作記號，能夠利用裸眼或裝置等檢測陽性帶電分子的存在的分子。作為標(biāo)記分子，沒有特別的限定，但是，可以適當(dāng)使用熒光物質(zhì)、放射性同位素、發(fā)光物質(zhì)、酶、X射線吸收物質(zhì)、抗體分子、具有可被特異性抗體識別的識別部位的分子(抗體識別分子)、磁性粒子、金屬粒子、經(jīng)玻璃涂敷的金屬納米粒子等。
[0044]作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，從容易可視化或檢測的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選使用熒光物質(zhì)作為標(biāo)記分子。作為熒光色素，作為一個(gè)例子，優(yōu)選使用吲哚菁綠、Alexa Fluor(注冊商標(biāo))488、Alexa Fluor546、Alexa Fluor555、Alexa Fluor568、Alexa Fluor594、AlexaFluor647、B0DIPY(注冊商標(biāo))FL、Texas Red(注冊商標(biāo))、0regon Green(注冊商標(biāo))488、羅丹明B、羅丹明綠、四甲基羅丹明、熒光素、異硫氰酸熒光素、藻紅蛋白、藻青蛋白、Cy3、Cy5、Cy7等。其中，從安全性高、容易可視化或檢測的觀點(diǎn)考慮，特別優(yōu)選使用吲哚菁綠。吲哚菁綠在一定條件下，通過照射近紅外光，發(fā)出波長比照射的近紅外光長的近紅外區(qū)域的熒光。發(fā)出的光直接用肉眼幾乎不能觀察，為了觀察，需要用于紅外光檢測的裝置，但由于可設(shè)為暗視野，因此，在關(guān)節(jié)鏡下的觀察中，容易產(chǎn)生對比度，容易檢測。這些熒光分子除了利用親和素-生物素法進(jìn)行的結(jié)合以外，能夠利用包接、其它公知的方法標(biāo)記陽性帶電分子。
[0045]另外，使用抗體識別分子作為標(biāo)記分子時(shí)，除了親和素-生物素法以外，利用各種熒光抗體反應(yīng)，能進(jìn)行熒光觀察。另外，將熒光素用作標(biāo)記分子時(shí)，還能夠進(jìn)行利用了熒光素、熒光素酶反應(yīng)的發(fā)光觀察。而且，作為標(biāo)記分子，還能使用X射線吸收物質(zhì)或磁性納米粒子、金屬納米粒子等。通過將它們用作標(biāo)記分子，還能夠利用X射線CT、MR1、拉曼分光法、等離子體共振法等進(jìn)行觀察。此外，除了利用上述標(biāo)記分子進(jìn)行的檢測以外，在軟骨組織下豐富存在的血紅蛋白的紅外光吸收或膠原纖維的自發(fā)光現(xiàn)象的檢測、對相對于由MR彈性成像(MR elastography:MRE)的振動帶來的剪切應(yīng)力的組織的粘彈性進(jìn)行非侵入性評價(jià)成為可會K。
[0046]而且，本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物中可以含有上述分子以外的其它成分。作為這樣的添加物，例如可舉出等滲劑、緩沖劑、保存劑、抗氧劑等。作為等滲劑，優(yōu)選使用氯化鈉、甘油、D—甘露醇、D—山梨糖醇、葡萄糖等。作為緩沖劑，可舉出磷酸鹽、醋酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽等緩沖液等。
[0047]而且，在本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物中，除上述添加物以外，還能含有進(jìn)一步防止陽性帶電分子侵入軟骨組織內(nèi)的物質(zhì)。作為這樣的物質(zhì)，例如可舉出膠原或未陽性帶電化的白蛋白或它們的衍生物或分解物等。
[0048]此外，本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物通過結(jié)合使用具有損傷軟骨修復(fù)作用的治療用藥劑、或成為利用細(xì)胞片等進(jìn)行的再生醫(yī)療、細(xì)胞治療的基礎(chǔ)的I型膠原等支架分子來代替上述標(biāo)記分子，能夠用作選擇性結(jié)合于軟骨損傷部位的藥物傳遞系統(tǒng)。另外，還能利用于支架移植后的術(shù)后管理。
[0049]下面對本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物的使用方法進(jìn)行說明。本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物，從容易適用的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選液體制劑。將本發(fā)明的組合物適用于肌體內(nèi)時(shí)，可以進(jìn)行在關(guān)節(jié)鏡下的向關(guān)節(jié)軟骨表層的噴霧、滴加或涂布、或者向關(guān)節(jié)腔內(nèi)的注射。在關(guān)節(jié)鏡下的適用時(shí)，優(yōu)選利用乳酸林格液或生理鹽水等清洗軟骨表面，除去關(guān)節(jié)腔內(nèi)的粘液(滑液)后，進(jìn)行本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物的噴霧或涂布等。另外，進(jìn)行關(guān)節(jié)軟骨成像組合物的噴霧等后，放置一定時(shí)間使關(guān)節(jié)軟骨成像組合物滲透。關(guān)于該一定時(shí)間，具體而言，從向?qū)ο蠼M織的滲透性的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選為3分鐘?30分鐘左右，更優(yōu)選為5分鐘?20分鐘左右，進(jìn)一步優(yōu)選為10分鐘?15分鐘左右。之后，利用乳酸林格液等洗滌關(guān)節(jié)軟骨，除去非特異性的吸附和剩余的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物。之后，利用標(biāo)記分子進(jìn)行熒光等的檢測。
[0050]作為利用標(biāo)記分子進(jìn)行的檢測方法，沒有特別的限定，但是，優(yōu)選插入關(guān)節(jié)鏡以及具有調(diào)整成適用于標(biāo)記分子的激發(fā)光的濾波器的光纖，進(jìn)行標(biāo)記分子的測定。作為一個(gè)例子，對靶分子使用作為熒光指示劑的吲哚菁綠時(shí)，利用介入有最佳濾波器的CCD相機(jī)的圖像，能夠簡易觀察吲哚菁綠的綠色熒光(峰值波長為800?850nm)。而且，對于檢測結(jié)果的成像，能夠使用適當(dāng)?shù)能浖瑢晒鈴?qiáng)度等變換成觀察者希望的色調(diào)或數(shù)值等進(jìn)行顯示。另夕卜，如上所述，關(guān)于關(guān)節(jié)軟骨成像組合物進(jìn)行可視化后的軟骨變性部分，通過識別或檢測能夠視覺辨認(rèn)的圖像上的濃淡和色調(diào)的轉(zhuǎn)變等，還能夠檢測變性的軟骨組織表面的粗細(xì)、即軟骨的變性水平。使用了關(guān)節(jié)鏡的診斷或手術(shù)所花的時(shí)間通常為I?3小時(shí)，為短時(shí)間，因此，關(guān)節(jié)軟骨成像組合物的作用時(shí)間也同樣地為I?3小時(shí)左右即可，診斷或手術(shù)結(jié)束后，通過利用乳酸林格液或生理鹽水等清洗多次，大都被排出，關(guān)于殘留的部分，也能通過水解等被分解、排出。
[0051]根據(jù)本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物，對于正常的軟骨組織，其表層細(xì)胞形成的殼樣的結(jié)構(gòu)排除陽性帶電分子，也難以發(fā)生向軟骨細(xì)胞內(nèi)的侵入，因此，正常的軟骨組織不被可視化。另一方面，對于變性后無表層細(xì)胞層的軟骨組織，指向性地吸附于露出的軟骨基質(zhì)，因此，變性的軟骨組織被強(qiáng)調(diào)。在通常的檢測方法中，軟骨變性的早期、即僅失去表層細(xì)胞層的“軟骨變性等級I”被認(rèn)為檢測和識別非常困難。根據(jù)本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物，關(guān)于這樣的“軟骨變性等級I”，能夠進(jìn)行識別、檢測，能夠進(jìn)行患者的早期治療。
[0052]另外，根據(jù)本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物，能夠使用關(guān)節(jié)鏡把握關(guān)節(jié)內(nèi)的組織(軟骨、十字韌帶以及半月板)的損傷狀態(tài)，進(jìn)行治療，因此，能夠進(jìn)行低侵入性的診斷以及治療。到目前為止，利用關(guān)節(jié)鏡在可見光下顯示于監(jiān)視器上的關(guān)節(jié)軟骨具有白色高亮度，難以判斷軟骨表層的變性或損傷，但是，通過使用本發(fā)明的組合物，能夠標(biāo)記軟骨表面的變性或缺損部分，在暗視野下使標(biāo)記分子的紅外熒光發(fā)光等，能夠發(fā)現(xiàn)在可見光下難以看見的軟骨的損傷狀態(tài)。
[0053]以下，示出本發(fā)明的實(shí)施例，但是本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施例。
[0054]實(shí)施例
[0055][實(shí)施例1]
[0056]1.陽性帶電化白蛋白的調(diào)制
[0057]使5g牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich合同會社產(chǎn)品)溶解于25mL純水。另一方面，將無水乙二胺67mL(Sigma-Aldrich合同會社產(chǎn)品)添加于純水500mL中，在冰水中緩緩加入6N的鹽酸約350mL，將pH調(diào)節(jié)到4.75。進(jìn)而，將I 一乙基一 3 —(3— 二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽1.8g(Sigma-Aldrich合同會社產(chǎn)品)添加于上述乙二胺溶液中，加入之前調(diào)制的牛血清白蛋白水溶液。用冰水將調(diào)制容器冷卻，保持溫度和pH的同時(shí)，攪拌2小時(shí)后，加入5mL4M的乙酸緩沖液，使反應(yīng)停止。將所得到的溶液在4°C下用純水透析72小時(shí)后，進(jìn)行凍干。通過凍干得到的晶體為白色，有光澤，呈薄膜狀的外觀。
[0058]對上述調(diào)制的凍干產(chǎn)物、和用作原料的牛血清白蛋白測定兩者的等電點(diǎn)，確認(rèn)是否得到了陽性帶電化白蛋白。將凍干產(chǎn)物以及牛血清白蛋白溶解于純水，應(yīng)用于Novex(注冊商標(biāo))IEF凝膠(Life Technologies Japan株式會社產(chǎn)品)，進(jìn)行等電點(diǎn)電泳。結(jié)果表示在圖1中。如圖1所示，通常的牛血清白蛋白的Pl約為4.9，但是，凍干產(chǎn)物的pi為11左右，較高，可知被高度陽離子化了。由此，確認(rèn)得到了陽性帶電化白蛋白。
[0059][實(shí)施例2]
[0060]2.陽性帶電化白蛋白與吲哚菁綠的最佳濃度的研究
[0061]作為熒光色素的吲哚菁綠(ICG)在僅包含ICG的水溶液的狀態(tài)下，無法看到熒光，但是，與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，發(fā)出近紅外光區(qū)域的熒光。使ICG與在實(shí)施例1中制備的陽性帶電化白蛋白結(jié)合，如下所述測定由ICG發(fā)出的熒光強(qiáng)度。此外，作為對照實(shí)驗(yàn)，還測定了由未被陽性帶電化的白蛋白與ICG的結(jié)合帶來的熒光強(qiáng)度。
[0062]使在實(shí)施例1中制備的陽性帶電化白蛋白溶解于純水，調(diào)制了1.250mg/mL、0.625mg/mL、0.313mg/mL、0.156mg/mL及0.078mg/mL的濃度的溶液。另夕卜，使卩引噪菁綠(Sigma-Aldr i ch合同會社產(chǎn)品)溶解于純水中，調(diào)制了 0.025mg/mL的溶液。將各濃度的陽性帶電化白蛋白溶液和ICG溶液分別各取50yL，添加于96孔的ELI SA板的各孔中而混合。利用紅外線觀察相機(jī)系統(tǒng)(pde-neo (310935 — 20、浜松?1101:011；[08株式會社產(chǎn)品)拍攝從溶液產(chǎn)生的紅外熒光(激發(fā)光為760nm、熒光為830nm)。作為對照實(shí)驗(yàn)，將陽性帶電化白蛋白替換為牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich合同會社產(chǎn)品)，利用與上述同樣的內(nèi)容進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖2所示。
[0063 ]如圖2的照片所示，未陽性帶電化的白蛋白在白蛋白濃度為0.313mg/mL (白蛋白濃度;0.156mg/mL、ICG濃度;0.0125mg/mL)以上的實(shí)驗(yàn)區(qū)中，能夠用肉眼識別熒光。另一方面，陽性帶電化白蛋白在陽性帶電化白蛋白濃度為0.156mg/mL(陽性帶電化白蛋白濃度；
0.078mg/mL、ICG濃度;0.0125mg/mL)以上的實(shí)驗(yàn)區(qū)，能夠用肉眼識別熒光。這樣得知，陽性帶電化白蛋白與通常的白蛋白相比，能在低濃度下進(jìn)行熒光識別。此外，關(guān)于ICG，在比上述實(shí)驗(yàn)濃度(0.0125mg/mL)高的濃度下進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)后，確認(rèn)了熒光的亮度也高。
[0064][實(shí)施例3]
[0065]3.利用關(guān)節(jié)軟骨成像組合物進(jìn)行的使用了牛正常關(guān)節(jié)軟骨的損傷軟骨模型的成像⑴
[0066]以約1.5cmX約2cm的大小切割出生后2?3周的上等肉用牛的前肢肩部的關(guān)節(jié)軟骨，除掉下骨。然后，如圖3的損傷軟骨模型圖所示，用剃刀以0.1?0.2_左右的深度將切割出的關(guān)節(jié)軟骨片的表面部分切除，在軟骨表面產(chǎn)生缺損部。設(shè)想在實(shí)際的臨床中的利用，利用注射筒對各關(guān)節(jié)軟骨片噴射約5mL的生理鹽水而進(jìn)行清洗。然后，將使陽性帶電化白蛋白和ICG溶解于純水而調(diào)制的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物(陽性帶電化白蛋白濃度:2.5mg/mL、ICG濃度:0.125mg/mL) 200yL滴加于疏水性塑料面，將關(guān)節(jié)軟骨片的表面向下置于疏水性塑料面，使其浸漬到關(guān)節(jié)軟骨成像組合物中。在約10?15分鐘后，利用生理鹽水沖洗多余的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物，使用紅外線相機(jī)(浜松Photonics株式會社產(chǎn)品)，記錄各關(guān)節(jié)軟骨切片的表面的圖像。
[0067]利用紅外線相機(jī)觀察的圖像表示在圖3中。關(guān)于對照區(qū)的關(guān)節(jié)軟骨片(未切除表面)，不能確認(rèn)從軟骨表面的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物的滲透以及吸附。白線狀的發(fā)光為剩余的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物利用毛細(xì)管現(xiàn)象附著于關(guān)節(jié)軟骨片的外周側(cè)面而形成的。另一方面，關(guān)于實(shí)驗(yàn)區(qū)1(軟骨表面中，利用剃刀切除單側(cè)半面，使之缺損)，確認(rèn)了關(guān)節(jié)軟骨成像組合物從表面的缺損部分滲透、吸附而產(chǎn)生的發(fā)光。此外，白線狀的發(fā)光為剩余的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物利用毛細(xì)管現(xiàn)象附著于關(guān)節(jié)軟骨片的外周側(cè)面而形成的。進(jìn)而，關(guān)于實(shí)驗(yàn)區(qū)2(軟骨表面中，利用剃刀切除中央部分，使之缺損)，確認(rèn)了關(guān)節(jié)軟骨成像組合物從表面的中央部的缺損部分滲透、吸附而產(chǎn)生的發(fā)光。如此表明，本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物滲透至深部并吸附，切除面發(fā)出強(qiáng)的熒光。
[0068][實(shí)施例4]
[0069]4.利用關(guān)節(jié)軟骨成像組合物進(jìn)行的使用了牛正常關(guān)節(jié)軟骨的損傷軟骨模型的成像⑵
[0070]以約IcmX約1.5cm的大小無菌切割出生后2?3周的上等肉用牛的前肢肩部的關(guān)節(jié)軟骨，盡可能除掉下骨。切割出的軟骨浸漬于生理磷酸緩沖液中。然后，用手術(shù)用刀(N0.11)以約0.1?0.2_左右的深度切除所切割出的關(guān)節(jié)軟骨片的表面的大致半面(俯視、右側(cè)半面)，在軟骨表面作成缺損部。通過該處理，關(guān)節(jié)軟骨片的俯視左側(cè)半面成為無傷的對照區(qū)，俯視右側(cè)半面成為軟骨的表層損傷模型。另外，為了在測定以及觀察時(shí)進(jìn)行位置確認(rèn)，斜著削除損傷面的一端的角。熒光觀察前，利用注射筒對各關(guān)節(jié)軟骨片噴出約2?3mL的生理磷酸緩沖液而進(jìn)行清洗。利用KimWipes(注冊商標(biāo))除去剩余的緩沖液。然后，將后述的樣品液I?4各50yL分別滴入到疏水性淺底盤中，將各關(guān)節(jié)軟骨片的表面向下放置于滴在淺底盤上的樣品液上，使樣品液浸漬于關(guān)節(jié)軟骨片的表面。在約10分鐘后，利用2?3mL的生理磷酸緩沖液沖洗多余的樣品液，剩余的緩沖液利用KimWipes除去。將各關(guān)節(jié)軟骨片放置在黑色的紙片上，在近紅外光下以及可見光下進(jìn)行照片拍攝。
[0071]本實(shí)施例中使用的樣品液I?4均使各成分溶解于純水中進(jìn)行調(diào)制，形成樣品液1:僅純水、樣品液2:1CG濃度0.125mg/mL、樣品液3:白蛋白濃度2.5mg/mL以及ICG濃度0.125mg/mL以及樣品液4:陽性帶電化白蛋白濃度2.5mg/mL以及ICG濃度0.125mg/mL。另外，在近紅外光下的拍攝利用使16根近紅外發(fā)光二極管以圓形排列而成的光源(激發(fā)波長:770nm、各30mA)，使各關(guān)節(jié)軟骨片的樣品液激發(fā)，經(jīng)由ICG用832nm的濾波器(Semrock公司產(chǎn)品、BrightLine ICG — B)，利用高靈敏度CCD相機(jī)(浜松Photonics株式會社產(chǎn)品、ORCA —ER)，在全部相同條件(100ms、low light以及8 Xbinning mode)下進(jìn)行。在近紅外光下的拍攝后，進(jìn)行在可見光下的單色拍攝。
[0072]結(jié)果表示在圖4中。在可見光拍攝照片以及近紅外光拍攝照片的任一者中，左側(cè)半面表示無傷的對照，右側(cè)半面表示損傷模型。樣品液1(僅純水)時(shí)，在所有面均未確認(rèn)到發(fā)光。但是，樣品液2(僅ICG)時(shí)，僅無傷的對照部分的面見到熒光。認(rèn)為該熒光是ICG吸附于軟骨表面的蛋白質(zhì)而成的。另一方面，從在損傷模型的面上未觀察到熒光發(fā)光來看，認(rèn)為這是由于通過軟骨的表面損傷，與蛋白質(zhì)相比，糖胺聚糖等的糖鏈豐富地露出于軟骨表面，ICG未被吸附于這些糖鏈。另一方面，樣品液3(白蛋白+ICG)時(shí)，在所有的面上均觀察到非常弱的熒光發(fā)光，但是，其發(fā)光強(qiáng)度沒有差別。由此，認(rèn)為這是由于白蛋白幾乎不存在對于軟骨基質(zhì)或細(xì)胞層的吸附特異性、以及樣品液中所含的白蛋白與ICG結(jié)合，從而使得失去了 ICG向軟骨表面的對蛋白質(zhì)的吸附活性。而且，樣品液4(陽性帶電化白蛋白+ICG)時(shí)，在損傷面觀察到強(qiáng)熒光。推測這是由于陽性帶電化白蛋白從受到損傷的面滲透到內(nèi)部、吸附于含有較多陰性電荷的軟骨中層的緣故。認(rèn)為無傷的對照部分的面上，細(xì)胞層密集排列，陰性電荷也少，陽性帶電化白蛋白的吸附少。另外，認(rèn)為ICG被包含于陽性帶電化白蛋白中等，并在蛋白質(zhì)中飽和，不會重新吸附到軟骨表面的蛋白質(zhì)上。如此表明，由陽性帶電化白蛋白和ICG構(gòu)成的本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物滲透吸附于軟骨損傷部，比正常的軟骨表面部分發(fā)出更強(qiáng)的熒光，由此使損傷部分可視化。
[0073][實(shí)施例5]
[0074]5.利用關(guān)節(jié)軟骨成像組合物進(jìn)行的人損傷軟骨的成像
[0075]試用了使用了本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物的人的關(guān)節(jié)軟骨的損傷部分的成像。作為實(shí)驗(yàn)材料，使用了為了人工膝關(guān)節(jié)手術(shù)而被切除、被醫(yī)療廢棄的人的關(guān)節(jié)的變性軟骨。以約IcmX約1.5cm的大小無菌地切割出關(guān)節(jié)軟骨片。切割出的軟骨浸漬于生理磷酸緩沖液中。熒光觀察前，利用注射筒對關(guān)節(jié)軟骨片噴出約2?3mL的生理磷酸緩沖液而進(jìn)行清洗，在可見光下進(jìn)行彩色照片拍攝。剩余的緩沖液用KimWipes(注冊商標(biāo))除去。然后，將使陽性帶電化白蛋白和ICG溶解于純水而調(diào)制的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物(陽性帶電化白蛋白濃度:
2.511^/1^、106濃度:0.125mg/mL)10yL置于疏水性淺底盤中，將關(guān)節(jié)軟骨片的表面朝下放置于淺底盤上，使關(guān)節(jié)軟骨成像組合物浸漬于關(guān)節(jié)軟骨片的表面。在約10分鐘后，利用2?3mL的生理磷酸緩沖液沖洗多余的成像組合物，剩余的緩沖液利用KimWipes除去。將關(guān)節(jié)軟骨片置于黑色的紙片上，在近紅外光下進(jìn)行表面以及側(cè)面的照片拍攝。關(guān)于近紅外光下的拍攝，利用使16根近紅外發(fā)光二極管以圓形排列而成的光源(激發(fā)波長:770nm、各30mA)，使各關(guān)節(jié)軟骨片的樣品液激發(fā)，經(jīng)由ICG用832nm的濾波器(Semrock公司產(chǎn)品、BrightLineICG —B)，利用高靈敏度CCD相機(jī)(浜松Photonics株式會社產(chǎn)品、0RCA—ER)，在全部相同條件(100ms、low light以及8Xbinning modenAuto-contrast mode)下進(jìn)行。
[0076]結(jié)果表示在圖5中。在本實(shí)施例中使用的人變性軟骨由于重度的變形性關(guān)節(jié)癥的病變，從關(guān)節(jié)軟骨片的大致整體顯示出強(qiáng)熒光。由此可知，陽性帶電化白蛋白與ICG的組合物中，陽性帶電化白蛋白抑fimCG向肌體蛋白質(zhì)的非特異性吸附，并且優(yōu)先吸附于軟骨中層中存在較多的陰性電荷上，發(fā)出熒光。此外，如圖5所示可知，關(guān)于在可見光下觀察時(shí)確認(rèn)的軟骨片表面的淡紅色部分，熒光強(qiáng)度變得比周圍低。認(rèn)為該淡紅色部分為關(guān)節(jié)軟骨的邊緣附近的組織，因此，是包含形成于軟骨表面的滑膜組織樣的血管的組織，推測該滑膜使本發(fā)明的成像組合物的滲透延遲。
[0077]產(chǎn)業(yè)上的可利用性
[0078]本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物能夠早期檢測成為變形性膝關(guān)節(jié)癥的觸發(fā)器的軟骨的變性，能夠明確區(qū)別正常軟骨和變性軟骨的邊界。本發(fā)明的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物在利用關(guān)節(jié)鏡進(jìn)行的診斷或手術(shù)等時(shí)，在肌體內(nèi)，不僅能夠使關(guān)節(jié)軟骨的變性部位可視化，而且通過注入到關(guān)節(jié)腔中等，能夠利用in vivo成像技術(shù)，非侵入性或低侵入性觀察軟骨的變性狀態(tài)。而且，在摘出關(guān)節(jié)軟骨組織或再生關(guān)節(jié)軟骨組織中，對軟骨損傷度的評價(jià)以及改善度的評價(jià)、以及關(guān)于關(guān)節(jié)軟骨疾病的創(chuàng)新藥物研究和病理研究也有用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種關(guān)節(jié)軟骨成像組合物，其特征在于，含有陽性帶電分子，所述陽性帶電分子用標(biāo)記分子進(jìn)行了標(biāo)記。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物，其特征在于，所述陽性帶電分子為陽性帶電化的蛋白質(zhì)或肽化合物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)或肽化合物為白蛋白、白蛋白分解物或白蛋白的修飾化合物。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物，其特征在于，所述陽性帶電分子為陽性帶電化的糖鏈化合物。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物，其特征在于，所述糖鏈化合物為葡聚糖、環(huán)糊精或它們的衍生物。6.根據(jù)權(quán)利要求1?5中任意一項(xiàng)所述的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物，其特征在于，所述標(biāo)記分子為選自由熒光物質(zhì)、放射性同位素、X射線吸收物質(zhì)、抗體分子以及具有可被特異性抗體識別的識別部位的分子組成的組中的至少一種物質(zhì)。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物，其特征在于，所述熒光物質(zhì)為吲哚菁綠。8.根據(jù)權(quán)利要求1?5中任意一項(xiàng)所述的關(guān)節(jié)軟骨成像組合物，其特征在于，所述標(biāo)記分子為選自由磁性粒子、金屬粒子、金屬納米粒子以及含其他納米材料的物質(zhì)組成的組中的至少一種物質(zhì)。
【文檔編號】A61K49/00GK105873618SQ201480068338
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2014年12月8日
【發(fā)明人】水野秀, 水野秀一, 川口伸明, 土屋明弘, 馬目佳信
【申請人】邁究理資產(chǎn)管理有限公司, 藤原康則