本發(fā)明屬于納米材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在納米粒子表面通過即時組裝修飾功能分子的方法，以滿足即時裝配即時使用（即配即用）型靶向藥物載體的需求，尤其是滿足個性化精準(zhǔn)治療的需求。

背景技術(shù)：

納米材料的使用在我們的生活中已經(jīng)非常普遍，目前各種類型的納米粒子均可方便制備，如有機(jī)聚合物納米粒子，無機(jī)納米粒子，有機(jī)/無機(jī)雜化納米粒子等。通常情況下，在納米粒子表面接上一些修飾分子會使之帶有一些新的特定功能，比如藥物納米載體粒子表面接上靶向分子就會使其具有靶向相應(yīng)腫瘤細(xì)胞的能力，接上光聲分子就會使其具有光聲成像的能力等等。這些修飾進(jìn)一步拓展了納米粒子在生物醫(yī)學(xué)等方面的應(yīng)用潛力。

目前在納米粒子上修飾功能性分子的方法，通常是在納米粒子表面先修飾官能團(tuán)，再用可與之進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的功能性分子通過化學(xué)鍵接的方式修飾在納米粒子表面，若要得到純凈的修飾功能分子的納米粒子，通常還需要進(jìn)行一系列的分離純化操作以及進(jìn)行冷凍干燥操作等。這種方法能按照要求在納米粒子上修飾所需的功能分子，然而通常耗時較長，步驟繁瑣，所以很難滿足在現(xiàn)實(shí)工作中根據(jù)不同的要求即刻得到所需納米粒子并立即投入使用的需求。隨著技術(shù)水平的快速發(fā)展和人們對于個性化精準(zhǔn)治療的日益增長需求，這種方法已經(jīng)不能滿足納米粒子個性化裝配以及即時使用的要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對技術(shù)背景中所提及的問題，提供一種普適的、在納米粒子表面修飾功能分子的方法，使得修飾的步驟更加簡便，以滿足即時裝配即時使用（即配即用）型靶向藥物載體的需求，尤其是滿足個性化精準(zhǔn)治療的需求。

本發(fā)明提供的即配即用型納米靶向藥物載體的制備方法，利用鏈霉親和素（SA）對生物素（BT）有非常高的親和力，且反應(yīng)呈高度專一性的特點(diǎn)，將已經(jīng)制備好的BT修飾的功能分子固定在修飾了SA的納米粒子表面上。所使用的條件溫和，修飾過程方便簡潔，并且能夠達(dá)到即時裝配即時使用的特點(diǎn)。具體步驟如下：

第一步，在納米粒子的表面接枝上鏈霉親和素（SA），制備得到表面有SA的納米粒子；

第二步，制備功能分子修飾的生物素（BT）；

第三步，將SA表面修飾的納米粒子和一種或多種功能分子修飾的BT，通過親和素-生物素之間高強(qiáng)度的親和作用，得到表面功能分子修飾的納米粒子，無需任何后處理即可將其立即用于后續(xù)的應(yīng)用試驗(yàn)中。

其中，第一步的具體操作步驟為：

將0.1~2 份表面帶有羧基/羥基/氨基的納米粒子（這里的“/”為“或”的意思）、0.05~1 份1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）和0.05~1份N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）分散在10-200 份緩沖溶液中，活化0.5~12 小時后再加入0.1~2 份鏈霉親和素；攪拌反應(yīng)12~24小時；用離心的方式將沒有反應(yīng)的SA和小分子反應(yīng)物去除，并用PBS反復(fù)洗多次，得到SA接枝的納米粒子；

第二步的具體操作步驟為：

將0.05~1份功能分子放入緩沖溶液中，加入0.1~2 份生物素，并用0.05~1 份1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和0.05-1 份1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）活化，攪拌反應(yīng)12~24小時；用分子量為1000的透析袋透析2~3天；得到帶有不同功能分子的生物素衍生物（BT）；

第三步的具體操作步驟為：

將0.05~0.5 份第一步得到的表面有鏈霉親和素的納米粒子分散在緩沖溶液當(dāng)中，添加一定質(zhì)量比的一種或者多種第二步得到的功能分子修飾的生物素（BT），在10~25℃下混合，即獲得一種或多種表面修飾功能分子的納米粒子，并將其立即用于后續(xù)應(yīng)用試驗(yàn)中。

在此基礎(chǔ)上，還可以將得到的表面修飾功能分子的納米粒子再次分散在緩沖溶液當(dāng)中，添加入一定質(zhì)量比的另一種或者多種功能分子修飾的生物素（BT），在10~25℃即時混合，即可獲得另一種或多種表面修飾功能分子的納米粒子立時投入后續(xù)應(yīng)用試驗(yàn)中。

本發(fā)明的目標(biāo)是得到即時裝配即時使用（即配即用）型靶向藥物載體，以滿足個性化精準(zhǔn)治療的需求。

本發(fā)明中，混合功能分子和納米粒子一般只需1~5分鐘。

本發(fā)明中，第一步中所使用的鏈霉親和素來自阿維丁鏈霉菌或是來自雞蛋白的親和素。

本發(fā)明中，第二步中所使用的生物素可以是D-生物素，生物素酰肼等，其功能分子的反應(yīng)官能團(tuán)基團(tuán)可以為氨基、羧基或羥基。生物素和功能分子的選擇遵循以下原則：若生物素的反應(yīng)官能團(tuán)為羧基時，則功能分子反應(yīng)基團(tuán)必須為羥基或者氨基；若生物素的反應(yīng)官能團(tuán)為羥基或者氨基時，則功能分子反應(yīng)基團(tuán)必須為羧基。

本發(fā)明中，第一步中所使用的納米粒子可以是表面帶有上述所要求基團(tuán)的磁性納米晶簇、磁流體、二氧化硅納米粒子、二氧化鈦納米粒子、聚合物納米粒子或重金屬納米粒子等。此處只是列舉部分納米粒子，還包括未列出的其他適合本發(fā)明的納米粒子。

本發(fā)明中，第二步中，所使用的功能分子可以是異硫氰酸酯熒光素（FITC）、葉酸、羅丹明、RGD。此處只是例舉一些常見的功能性分子，還包括未列出的其他適合本發(fā)明的所有帶可反應(yīng)官能團(tuán)的功能分子。

本發(fā)明中，第三步中，功能分子修飾的BT和SA的納米粒子的質(zhì)量比可以為1:1000~1:1。優(yōu)選1:600~1:50。

本發(fā)明中，第三步中，混合后的納米粒子不經(jīng)過任何后處理即刻應(yīng)用到后續(xù)的應(yīng)用中，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)可以是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，也可以是其他檢測或者標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。

本發(fā)明中，所使用的緩沖溶液可以是磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉緩沖體系、硼酸/硼酸鈉緩沖體系、檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖體系、醋酸/醋酸鈉緩沖體系（這里的“/”為“和”的意思），且pH值可以調(diào)節(jié)在6~8。

本發(fā)明中，所有的原料易得，合成步驟簡單，條件溫和，在納米粒子的修飾結(jié)束后無需進(jìn)行任何后處理可直接用于下一步的試驗(yàn)，很好的滿足了現(xiàn)代科技對于即時組裝效率的訴求，提供了極大的便利性，為拓寬納米粒子的使用范圍打下的堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1、實(shí)施例1的磁性納米晶簇上修飾葉酸的熒光光譜圖。

圖2、實(shí)施例2的磁性納米晶簇上修飾FITC的熒光光譜圖。

圖3、實(shí)施例3的磁性納米晶簇上修飾羅丹明的熒光光譜圖。

圖4、實(shí)施例4的磁性納米晶簇上同時修飾羅丹明、葉酸和FITC的熒光光譜圖。

圖5、實(shí)施例6的載藥磁性納米晶簇上修飾靶向分子在腫瘤SK-OV-3細(xì)胞中的流式圖。其中，a為12小時后，葉酸、RGD修飾的載藥磁性納米晶簇和葉酸，RGD同時修飾的載藥磁性納米晶簇被SK-OV-3細(xì)胞攝取的情況并與后處理過的載藥納米粒子最對比，b為24小時后的。

圖6、實(shí)施例7的載藥磁性納米晶簇上修飾靶向分子對于腫瘤SK-OV-3細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)圖并與后處理過的載藥納米粒子作對比。其中，（a）DOX濃度為1μm/ml以及48小時后對于細(xì)胞的毒性試驗(yàn)圖，（b）DOX濃度為5 μm/ml以及48小時后對于細(xì)胞的毒性試驗(yàn)圖，（c）DOX濃度為10 μm/ml以及48小時后對于細(xì)胞的毒性試驗(yàn)圖，（d）DOX濃度為1μm/ml以及72小時后對于細(xì)胞的毒性試驗(yàn)圖，（e）DOX濃度為5 μm/ml以及72小時后對于細(xì)胞的毒性試驗(yàn)圖，(f)DOX濃度為10 μm/ml以及72小時后對于細(xì)胞的毒性試驗(yàn)圖。

圖7、本發(fā)明方法流程圖示。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。

實(shí)施例1：通過SA和BT的強(qiáng)相互作用，在磁性納米晶簇表面修飾葉酸分子的方法

將0.1g表面帶有羧基的磁性納米晶簇（MSP），0.1g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）和0.1gN-羥基琥珀酰亞胺（NHS）分散在100 ml磷酸緩沖溶液中，活化兩個小時后再加入0.2 g鏈霉親和素。攪拌反應(yīng)24小時后，用磁分離的方式將沒有反應(yīng)的SA和小分子反應(yīng)物去除，并反復(fù)磁分離5次，之后用真空干燥的方法在40℃下干燥2天，即得到SA表面修飾的磁性納米晶簇。

將0.1g葉酸放入水中，加入0.05 g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）和0.05g N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），在25^oC下活化2h；然后加入0.2g生物素，在25℃攪拌反應(yīng)12h。最后得到葉酸修飾的生物素。

最后將0.1 g第一步得到的SA接枝的磁性納米晶簇分散在緩沖溶液中，添加10 mg的葉酸修飾的BT，在25℃下充分混合，無需任何處理，即得到表面修飾葉酸的磁性納米晶簇。

實(shí)施例2：通過SA和BT的強(qiáng)相互作用，在磁性納米晶簇表面修飾FITC分子的方法

將0.1g表面帶有羧基的磁性納米晶簇（MSP），0.1g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）和0.1gN-羥基琥珀酰亞胺（NHS）分散在100 ml磷酸緩沖溶液中，活化兩個小時后再加入0.2 g鏈霉親和素。攪拌反應(yīng)24小時后，用磁分離的方式將沒有反應(yīng)的SA和小分子反應(yīng)物去除，并反復(fù)磁分離5次，之后用真空干燥的方法在60 ℃下干燥1天，即得到SA表面修飾的磁性納米晶簇。

將0.1gFITC放入水中，然后加入0.2g生物素酰肼，在25℃攪拌反應(yīng)24 h，最后得到FITC修飾的生物素。

最后將0.1 g第一步得到的SA接枝的磁性納米晶簇分散在緩沖溶液當(dāng)中，添加10 mg的FITC修飾的BT，在10℃下充分混合，無需任何處理，即得到表面修飾FITC的磁性納米晶簇。

實(shí)施例3：通過SA和BT的強(qiáng)相互作用，在磁性納米晶簇表面修飾羅丹明分子的方法

將0.1g表面帶有羧基的磁性納米晶簇（MSP），0.1g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）和0.1gN-羥基琥珀酰亞胺（NHS）分散在100 ml磷酸緩沖溶液中，活化兩個小時后再加入0.2 g鏈霉親和素。攪拌反應(yīng)24小時后，用磁分離的方式將沒有反應(yīng)的SA和小分子反應(yīng)物去除，并反復(fù)磁分離5次，之后用真空干燥的方法在50℃下干燥1.5天，即得到SA表面修飾的磁性納米晶簇。

將0.1g羅丹明放入水中，加入0.05 g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）和0.05g N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），在35^oC下活化10h，然后加入0.2g生物素，在35℃攪拌反應(yīng)18 h，最后得到羅丹明修飾的生物素。

最后將0.1 g第一步得到的SA接枝的磁性納米晶簇分散在緩沖溶液當(dāng)中，添加10 mg的羅丹明修飾的BT，在15℃下充分混合，無需任何處理，即得到表面修飾葉酸的磁性納米晶簇。

實(shí)施例4：通過SA和BT的強(qiáng)相互作用，在磁性納米晶簇表面同時修飾羅丹明、FITC和葉酸分子的方法

將0.1g表面帶有羧基的磁性納米晶簇（MSP），0.1g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）和0.1gN-羥基琥珀酰亞胺（NHS）分散在100 ml磷酸緩沖溶液中，活化兩個小時后再加入0.2 g鏈霉親和素。攪拌反應(yīng)24小時后，用磁分離的方式將沒有反應(yīng)的SA和小分子反應(yīng)物去除，并反復(fù)磁分離5次，之后用真空干燥的方法在45℃下干燥2天，即得到SA表面修飾的磁性納米晶簇。

將0.1g羅丹明放入水中，加入0.05 g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）和0.05g N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），在50℃下活化20小時，然后加入0.2g生物素，在30℃攪拌反應(yīng)20 h，最后得到羅丹明修飾的生物素。葉酸修飾的BT的制備方法參見實(shí)施例1；FITC修飾的BT的制備方法參見實(shí)施例2。

最后將0.1g第一步得到的PEG接枝的磁性納米晶簇分散在緩沖溶液當(dāng)中，添加10 mg的羅丹明修飾的BT、10 mg的FITC修飾的BT和10 mg的葉酸修飾的BT，在30℃下充分混合，無需任何處理，即得到表面修飾羅丹明、FITC和葉酸的磁性納米晶簇。

實(shí)施例5：通過SA和BT的強(qiáng)相互作用，在磁性納米晶簇表面修飾靶向分子RGD的方法

將0.1g表面帶有羧基的磁性納米晶簇（MSP），0.1g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）和0.1gN-羥基琥珀酰亞胺（NHS）分散在100 ml磷酸緩沖溶液中，活化兩個小時后再加入0.2 g鏈霉親和素。攪拌反應(yīng)24小時后，用磁分離的方式將沒有反應(yīng)的SA和小分子反應(yīng)物去除，并反復(fù)磁分離5次，之后用真空干燥的方法在55℃下干燥1天，即得到SA表面修飾的磁性納米晶簇。

將0.1gRGD放入水中，加入0.05 g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）和0.05g N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），在40℃下活化10h，然后加入0.2g生物素，在40℃攪拌反應(yīng)10 h，最后得到靶向分子RGD修飾的生物素。

最后將0.1 g第一步得到的SA接枝的磁性納米晶簇分散在緩沖溶液當(dāng)中，添加10 mg的RGD修飾的BT，在20℃下充分混合，無需任何處理，即得到表面修飾RGD的磁性納米晶簇。

實(shí)施例6：通過SA和BT的強(qiáng)相互作用，在負(fù)載DOX藥物的磁性納米晶簇表面修飾靶向分子并即時使用在流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的方法

將0.1g表面帶有羧基的磁性納米晶簇（MSP），0.1g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）和0.1gN-羥基琥珀酰亞胺（NHS）分散在100 ml磷酸緩沖溶液中，活化兩個小時后再加入0.2 g鏈霉親和素。攪拌反應(yīng)24小時后，用磁分離的方式將沒有反應(yīng)的SA和小分子反應(yīng)物去除，并反復(fù)磁分離5次，之后在磁性納米晶簇上負(fù)載18%的DOX，用真空干燥的方法在45℃下干燥1.5天，即得到SA表面修飾的負(fù)載DOX藥物的磁性納米晶簇。

葉酸修飾的BT的制備方法參見實(shí)施例1，RGD修飾的BT的制備方法參見實(shí)施例5。將0.1 g第一步得到的SA接枝的磁性納米晶簇分散在緩沖溶液當(dāng)中，添加10 mg的RGD修飾的BT，在10℃下充分混合，無需任何處理，即得到表面修飾RGD的載藥磁性納米晶簇。添加10 mg的葉酸修飾的BT，在10℃下充分混合，無需任何處理，即得到表面修飾葉酸的載藥磁性納米晶簇。同時添加10 mg的葉酸修飾的BT和10 mg的葉酸修飾的BT，在10℃下充分混合，無需任何處理，即得到表面同時修飾葉酸和RGD的載藥磁性納米晶簇。

修飾后，立即將DOX 濃度為2μg/ml并修飾了靶向分子的載藥磁性納米晶簇混入培養(yǎng)基中與SK-OV-3腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)，12小時和24小時后測試其進(jìn)入細(xì)胞的數(shù)量。數(shù)據(jù)表明即時使用樣品和經(jīng)過純化等后處理的樣品進(jìn)入細(xì)胞的效果基本一致。

實(shí)施例7：通過SA和BT的強(qiáng)相互作用，在負(fù)載DOX藥物的磁性納米晶簇表面修飾靶向分子并即時使用于靶向殺傷癌細(xì)胞的方法

將0.1g表面帶有羧基的磁性納米晶簇（MSP），0.1g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）和0.1gN-羥基琥珀酰亞胺（NHS）分散在100 ml磷酸緩沖溶液中，活化兩個小時后再加入0.2 g鏈霉親和素。攪拌反應(yīng)24小時后，用磁分離的方式將沒有反應(yīng)的SA和小分子反應(yīng)物去除，并反復(fù)磁分離5次，之后在磁性納米晶簇上負(fù)載18%的DOX，用真空干燥的方法在60℃下干燥1天，即得到SA表面修飾的負(fù)載DOX藥物的磁性納米晶簇。

葉酸修飾的BT的制備方法參見實(shí)施例1，RGD修飾的BT的制備方法參見實(shí)施例5。將0.1 g第一步得到的SA接枝的磁性納米晶簇分散在緩沖溶液當(dāng)中，添加10 mg的RGD修飾的BT，在25℃下充分混合，無需任何處理，即得到表面修飾RGD的載藥磁性納米晶簇。添加10 mg的葉酸修飾的BT，在25℃下充分混合，無需任何處理，即得到表面修飾葉酸的載藥磁性納米晶簇。同時添加10 mg的葉酸修飾的BT和10 mg的葉酸修飾的BT，在25℃下充分混合，無需任何處理，即得到表面同時修飾葉酸和RGD的載藥磁性納米晶簇。

修飾后，立即將DOX 濃度為1，5，10μg/ml修飾靶向分子的載藥磁性納米晶簇混入培養(yǎng)基中與SK-OV-3腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)，48小時和72小時后測試其殺傷癌細(xì)胞的效果。數(shù)據(jù)表明即時使用樣品和經(jīng)過純化等后處理的樣品殺傷癌細(xì)胞的效果基本一致。