本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及靶向打靶載體及靶向整合外源基因至MYH9 Intron2位點構(gòu)建小鼠胚胎干細胞株的方法和應用。

背景技術(shù)：

轉(zhuǎn)基因、基因敲除/敲入技術(shù)已成為現(xiàn)代生命科學基礎(chǔ)研究和應用開發(fā)領(lǐng)域所倚重的關(guān)鍵技術(shù)，其中，將人工分離和修飾過的基因?qū)肷矬w基因組中，通過導入基因的表達引起生物體性狀的可遺傳改變，這一技術(shù)稱之為轉(zhuǎn)基因技術(shù)(Transgenic technology)；通過同源重組將外源基因定點整合至靶細胞基因組上某一確定的位點，以達到定點修飾改造染色體上某一基因的目的，這種基于基因打靶(Gene Targeting)的技術(shù)稱之為基因敲除/敲入(Gene knock-out/knock-in)技術(shù)。轉(zhuǎn)基因和基因敲除/敲入技術(shù)最主要的區(qū)別在于前者是隨機插入而具有盲目性和偶然性，而后者是定點整合而具有確定性和可預測性，從而成為一種更理想的修飾、改造生物遺傳物質(zhì)的方法。盡管基因敲除和敲入技術(shù)都是基于同源重組，但是也存在方法上的些許差異，基因敲除僅把需要被破壞的基因的幾個重要外顯子或者功能區(qū)域用篩選標志基因如Neomycin替換掉，而基因敲入除了篩選標志基因外還需將預先設(shè)計的目的DNA片段一并整合至相應的基因組位點。這些經(jīng)典技術(shù)在推動人類對于基因功能與調(diào)控的認識、疾病發(fā)生機制以及藥物研發(fā)等方面發(fā)揮了重要作用，并且還將結(jié)合最新的基因編輯工具如鋅指核酸酶(ZFN)、轉(zhuǎn)錄因子樣效應物核酸酶(TALEN)和成簇規(guī)律間隔短回文重復及其關(guān)聯(lián)蛋白系統(tǒng)(CRISPR/Cas9)等在理論研究和應用開發(fā)中繼續(xù)發(fā)揮不可或缺的作用。

將外源基因靶向整合至特定的染色體位點在基因療法、細胞工程、遺傳動物模型、基因功能研究及藥物開發(fā)等中具有重要應用價值，而所有這些應用一方面依賴于轉(zhuǎn)入基因功能的可靠性和可預測性，另一方面要求轉(zhuǎn)入基因不影響內(nèi)源基因和或其他調(diào)控因子的功能。因此，一個適合外源基因良性插入并表達的基因組位點非常重要，而這種適合插入外源基因的所謂安全/友好位點(safe harbor)需要具備如此一些特性：1)該位點處于一個開放的染色體狀態(tài)而消除任何可能的位置效應，保證轉(zhuǎn)入基因能被正常轉(zhuǎn)錄及表達而不會出現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象；2)該位點插入外源目的DNA片段對細胞/機體無已知的副作用，如不破壞內(nèi)源編碼基因和高度保守區(qū)以及激活癌基因或microRNAs(Sadelain M 2011 Nature Reviews Cancer 12,51-58)；3)在該位點靶向插入外源基因時有可以接受的同源重組效率，否則難以獲得所需細胞株，隨著基因編輯工具的出現(xiàn)，這一要求開始降低。目前研究確定可以用作safe harbor的基因組位點為數(shù)很少，如人類基因組中的ROSA26，AAVS1，CCR5以及小鼠基因組中的ROSA26等位點(Sadelain M 2011 Nature Reviews Cancer 12,51-58)，并且仍可能存在潛在的未知問題。因此，探尋和鑒定其它safe harbor位點仍是十分需要的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種靶向打靶載體及靶向整合外源基因至MYH9Intron2位點構(gòu)建小鼠胚胎干細胞株的方法和應用。

為了達到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

所述靶向打靶載體序列如SEQ ID NO.7所示，命名為mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R載體；該載體僅將抗性基因Neomycin靶向整合。

上述靶向打靶載體的制備方法包括如下步驟：

(1)構(gòu)建空載體mpNTKV-LoxP，所述空載體mpNTKV-LoxP序列如SEQ ID NO.17所示；

(2)以bMQ-369E5BAC DNA為模板，利用序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.4所示的反向引物進行PCR，擴增出序列如SEQ ID NO.1所示的左側(cè)同源臂；以bMQ-369E5BAC DNA為模板，利用序列如SEQ ID NO.5所示的正向引和序列如SEQ ID NO.6所示的反向引物進行PCR，擴增出序列如SEQ ID NO.2所示的右側(cè)同源臂；

(3)將左側(cè)同源臂和右側(cè)同源臂插入空載體mpNTKV-LoxP中，即得靶向打靶載體mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R載體。

上述靶向打靶載體可用于靶向整合外源基因至MYH9Intron2位點構(gòu)建小鼠胚胎干細胞株，即，將上述的靶向打靶載體將外源基因靶向整合至MYH9Intron2位點。

本發(fā)明還提供了整合外源基因的打靶載體，所述整合外源基因的打靶載體是將構(gòu)建的外源基因表達盒插入mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R載體中左側(cè)同源臂和抗性基因Neomycin之間而構(gòu)建成的。

優(yōu)選地，所述整合外源基因的打靶載體序列如SEQ ID NO.8所示，命名為mpNTKV-LoxP MAI2L-EF1α-GFP-pA-MAI2R(Knock-in EF1α-GFP-pA)載體；或者，所述整合外源基因的打靶載體序列如SEQ ID NO.9所示，命名為mpNTKV-LoxP MAI2L-pA-GFP-EF1α-MAI2R(Knock-in pA-GFP-EF1α)載體；或者，所述整合外源基因的打靶載體序列如SEQ ID NO.10所示，命名為mpNTKV-LoxP MAI2L-αMHC-Puro-IRES-GFP-pA-MAI2R(Knock-inαMHC-Puro-IRES-GFP-pA)載體。

本發(fā)明利用MYH9基因第二號內(nèi)含子上游4.5kb和下游2.0kb DNA序列構(gòu)建靶向打靶載體左、右側(cè)同源臂，經(jīng)電轉(zhuǎn)導入細胞、正負標記藥物篩選、long-range PCR篩選與鑒定，所獲得的胚胎干細胞單克隆陽性率≥70％。在上述基礎(chǔ)上，將EF1α啟動子控制的GFP表達盒正向或反向，或者αMHC啟動子控制的Puro-T2A-GFP表達盒置于上述左、右同源臂之間，可以實現(xiàn)高效靶向整合。結(jié)果表明EF1α控制的GFP表達正常且與插入方向無關(guān)；同樣αMHC控制的Puro和GFP表達準確。3)內(nèi)源MYH9基因表達水平不受外源基因插入的影響。由此表明MYH9基因內(nèi)含子2區(qū)域具有類似于小鼠Rosa26位點特性，是小鼠基因組內(nèi)另一個可供外源基因高效、安全、靶向整合以及正確表達的位點。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明建立了一種高效、安全靶向整合外源DNA序列至小鼠胚胎干細胞基因組MYH9位點的方法并提供了應用實例。

本發(fā)明針對目前小鼠基因組中可供外源基因靶向整合的染色體位點很少的現(xiàn)狀而提供了一個可供基因定點插入的小鼠基因組位點。

本發(fā)明首先構(gòu)建靶向小鼠MYH9內(nèi)含子2位點的打靶載體，確定在胚胎干細胞中能否實現(xiàn)高效同源重組從而容易獲得所需細胞株。

本發(fā)明提供了靶向小鼠MYH9Intron2位點的打靶載體左、右同源臂DNA序列信息及構(gòu)建方法。

本發(fā)明提供了篩選與鑒定陽性細胞株/克隆的方法。

本發(fā)明提供了構(gòu)建外源基因靶向整合至小鼠MYH9Intron2位點的打靶載體的方法，并證實敲入的外源基因表達正常。

本發(fā)明確認了內(nèi)源MYH9表達不受外源基因整合的影響，從而可以成為小鼠基因組中一個新的safe harbor。

如背景技術(shù)中所提到的，目前小鼠基因組中可供靶向整合的位點很少，本發(fā)明提供了一個新的能實現(xiàn)靶向整合的位點序列，利用該位點可構(gòu)建靶向插入外源基因的打靶載體，并且能夠保證外源基因在小鼠胚胎干細胞中穩(wěn)定表達而內(nèi)源基因表達不受影響，從而為構(gòu)建轉(zhuǎn)基因細胞系以及小鼠搭建了一個好的平臺。

附圖說明

圖1：靶向MYH9基因Intron2位點打靶載體的構(gòu)建，及同源重組后進行PCR篩選與鑒定的引物示意圖；

圖2：PCR篩選與鑒定靶向MYH9Intron2位點的小鼠胚胎干細胞單克隆，正確靶向的單克隆細胞出現(xiàn)約2.2kb條帶；

圖3：外源基因靶向插入MYH9Intron2位點打靶載體的構(gòu)建；

圖4：靶向整合至MYH9內(nèi)含子2位點的外源GFP表達僅受EF1α啟動子控制而不受插入方向的影響(objective 20X)；

圖5：靶向插入MYH9內(nèi)含子2位點的外源GFP和Puromycin表達僅受αMHC啟動子控制，從而相應的胚胎干細胞在藥物嘌呤毒素處理下定向分化成心肌細胞，GFP熒光強度隨著分化時間延長而增強(objective 20X)；

圖6：Western blot檢測表明MYH9基因表達不受外源基因插入的影響，該蛋白與正常細胞中的水平一致。

具體實施方式

實施例1：構(gòu)建靶向小鼠MYH9基因內(nèi)含子2位點的打靶載體

我們早先的研究表明，在小鼠MYH9基因第一個ATG所處的外顯子2進行基因替代，其同源重組效率高達90％以上，但是這也同時破壞內(nèi)源MYH9基因，不利于除基因替代外的其它外源基因的插入。我們考慮是否可以將外源基因靶向整合至MYH9基因內(nèi)含子2位點，這樣不僅可以利用該位點具有的高效同源重組效率，而且可以保持內(nèi)源基因的完整性。為此，從genome.ucsc.edu網(wǎng)站檢索并下載獲得小鼠MYH9基因組序列，結(jié)合小鼠MYH9mRNA(Genbank No:NM_022410)序列，確定各外顯子和內(nèi)含子位置及序列，特別是第二號內(nèi)含子。根據(jù)MYH9第二號內(nèi)含子上、下游各6kb基因組序列，利用Primer3軟件設(shè)計4kb左右長臂和2kb左右短臂PCR引物，選取最佳序列。參照David J.Adams 2005文獻報道，獲得包含整個MYH9基因的BAC Clone No:bMQ-369E5，并從Chieldren’hospotal Oakland Research Institute購買獲得，BAC DNA利用QIAGEN Plasmid Midi Kit(Qiagen)制備備用。以bMQ-369E5BAC DNA為模板利用正向引物MAI2R-F(Pme I)5’-AGCTTTGTTTAAACGAAGATCAAGCTCCCACCTGC(SEQ ID NO.5)和反向引物MAI2R-R(BamH I)5’-CGGGATCCGGAGGCTGAAGCCCTGCCCAG(SEQ ID NO.6)及Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitrogen)作PCR擴增約2.0kb右側(cè)同源臂(94℃2min,94℃30s,60℃30s,68℃2min,30cycles,68℃10min)，下劃線序列為酶切位點。PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR clean-up kit純化后利用Pme I和BamH I(Fermantas)進行雙酶切，而空載體mpNTKV-LoxP(該載體為本實驗室構(gòu)建并正在申報專利)利用Pme I和Bgl II(Fermantas)進行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，分別切出目的條帶并回收，然后利用T4DNA ligase(Fermantas)將載體與目的片段連接，接著轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，挑取單個菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)酶切初步鑒定后送商業(yè)公司測序。測序結(jié)果顯示右側(cè)同源臂插入成功并命名為mpNTKV-LoxP MAI2R，右側(cè)同源臂序列如SEQ ID NO.2所示。接著，以bMQ-369E5BAC DNA為模板利用正向引物MAI2L-F(Sal I)5’-ACGCGTCGACGAAGTGAAGCTCCTGGCTTTG(SEQ ID NO.3)和反向引物MAI2L-R(Sac II)5’-TCCCCGCGGCTGCATGCAGGGAACAGAGGG(SEQ ID NO.4)及Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity作PCR擴增約4.5kb左側(cè)同源臂(94℃2min,94℃30s,60℃30s,68℃4.5min,30cycles,68℃10min)，下劃線序列為酶切位點。PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR clean-up kit純化后與質(zhì)粒mpNTKV-LoxP MAI2R一道利用Sal I和Sac II進行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，分別切出目的條帶并回收，然后將載體與目的片段連接，接著轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α,挑取單個菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)酶切初步鑒定后送商業(yè)公司測序。測序結(jié)果顯示左側(cè)同源臂插入成功并命名為mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R(knock-in Neo)，左側(cè)同源臂序列如SEQ ID NO.1和圖1所示。此外，用于確定靶向是否成功的PCR引物位置如圖1所示，其序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12。

實施例2：靶向整合外源基因的打靶載體的構(gòu)建

為使外源基因能夠靶向整合至MYH9基因內(nèi)含子2位點，必須將外源基因表達盒插入上述靶向載體中mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R，其過程包括如下：

EF1α-GFP-rGlobin polyA表達盒的構(gòu)建：以pEF-GFP質(zhì)粒質(zhì)粒(Addgene)為模板利用正向引物EF1a-F(Pac I)5’-CCTTAATTAACGTGAGGCTCCGGTGCCCGTC(SEQ ID NO.13)和反向引物rGlobin pA-R(Pac I)5’-CCTTAATTAA CTGCAGGTCGAGGGATCTTCAT及Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity作PCR擴增約2.5kb包括human EF1α啟動子、GFP表達序列以及rabbit Globin polyA終止序列的DNA片段(94℃2min,94℃30s,60℃30s,68℃2.5min,30cycles,68℃10min)，下劃線序列為酶切位點。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離、切出目的條帶并利用DNAGel extraction kit(Qiagen)回收DNA片段，接著將該片段連接至T-easy載體(Promega)中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，挑取單個菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)酶切初步鑒定后送商業(yè)公司測序，測序證實無誤后進行下一步。

EF1α-GFP-rGlobin polyA表達盒插入靶向載體mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R：利用Pac I(Fermantas)將hEF1α-GFP-rGlobin polyA片段從T-easy載體切出；同時利用Pac I對mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R質(zhì)粒(以上構(gòu)建)進行酶切，酶切后利用Shrimp Alkaline Phosphatase(Fermantas)對線性化載體進行去磷酸化處理。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，分別切出目的和載體條帶并回收，然后將載體與目的片段連接，接著轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，挑取單個菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)酶切初步鑒定后送商業(yè)公司測序以確定插入方向。根據(jù)測序結(jié)果確定，與MYH9基因轉(zhuǎn)錄方向一致的為正向插入稱為mpNTKV-LoxP MAI2L-EF1α-GFP-pA-MAI2R(Knock-in EF1α-GFP-pA)，反之則為反向插入稱為mpNTKV-LoxP MAI2L-pA-GFP-EF1α-MAI2R(Knock-in pA-GFP-EF1α)，這些載體及序列如圖3所示和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示。這些外源基因定點整合產(chǎn)生的相應突變等位基因分別稱為A^{KI EF1α-GFP-pA}，A^{KI pA-GFP-EF1α}。

αMHC-Puro-IRES-GFP-hgh polyA表達盒的構(gòu)建：以pMSCV Puro-IRES-GFP質(zhì)粒(Addgene)為模板利用正向引物PIG-F(SalI)5’-ACGCGTCGACATGACCGAGTACAAGCCCACGGTG(SEQ ID NO.15)和反向引物PIG-R(SalI)5’-ACGCGTCGACTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC(SEQ ID NO.16)及Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity作PCR擴增約2.0kb包括Puro-IRES-GFP表達序列的DNA片段(94℃2min,94℃30s,60℃30s,68℃2min,30cycles,68℃10min)，下劃線序列為酶切位點。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離、切出目的條帶并利用DNA Gel extraction kit回收DNA片段，接著將該片段連接至T-easy載體中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，挑取單個菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)酶切初步鑒定后送商業(yè)公司測序，測序證實無誤后進行下一步。利用Sal I(Fermantas)將Puro-IRES-GFP片段從T-easy載體切出；同時利用Sal I對pJG/αMHC質(zhì)粒(Addgene)進行酶切，酶切后利用Shrimp Alkaline Phosphatase(Fermantas)對線性化載體進行去磷酸化處理。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，分別切出目的和載體條帶并回收，然后將載體與目的片段連接，接著轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，挑取單個菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)酶切初步鑒定后送商業(yè)公司測序以確定插入方向。根據(jù)測序結(jié)果確定，與αMHC啟動子方向一致的為正向插入稱為αMHC-Puro-IRES-GFP-hgh polyA質(zhì)粒。

αMHC-Puro-IRES-GFP-hgh polyA表達盒插入靶向載體mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R：利用Not I(Fermantas)將αMHC-Puro-IRES-GFP-hgh polyA片段從上述αMHC-Puro-IRES-GFP-hgh polyA質(zhì)粒中切出，然后利用T4DNA polymease將粘性末端補平；同時利用Swa I對mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R載體(以上構(gòu)建)進行酶切，酶切后利用Shrimp Alkaline Phosphatase(Fermantas)對線性化載體進行去磷酸化處理。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，分別切出目的和載體條帶并回收，然后將載體與目的片段連接，接著轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，挑取單個菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)酶切初步鑒定后送商業(yè)公司測序以確定插入方向。根據(jù)測序結(jié)果確定，與MYH9基因轉(zhuǎn)錄方向一致的為正向插入稱為mpNTKV-LoxP MAI2L-αMHC-Puro-IRES-GFP-pA-MAI2R(Knock-inαMHC-Puro-IRES-GFP-pA)載體，如圖3所示，其序列如SEQ ID NO.10所示。該外源基因定點整合產(chǎn)生的相應突變等位基因稱為A^{KI αMHC-Puro-IRES-GFP-pA}。

至此，本發(fā)明中擬進行應用的三個靶向整合外源基因的打靶載體構(gòu)建完畢，如圖3所示。

接下來，利用Not I將上述構(gòu)建的一個靶向打靶載體和三個靶向整合外源基因的打靶載體(100μg)進行線性化處理，然后應用UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol(25:24:1,v/v)(Invitrogen)抽提DNA線性化酶切體系兩次，高速離心10min后將上清轉(zhuǎn)移至另一新的1.5ml EP管，加入2.5倍上清體積的100％乙醇，充分混融后高速離心10min獲得白色DNA沉淀，然后用70％乙醇洗滌DNA沉淀一次，在超凈臺中去除上清并風干DNA沉淀約10min，待乙醇溶液完全風干后，加入適量TE溶液溶解DNA約2小時以上，測定線性化DNA濃度并調(diào)節(jié)DNA濃度約為1μg/μl，同時利用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，DNA溶液4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

到此為止，導入細胞的靶向整合外源基因的打靶載體DNA制備完成。

實施例3：靶向整合外源基因的打靶載體導入小鼠胚胎干(ES)細胞

本發(fā)明中所使用的滋養(yǎng)層細胞是經(jīng)γ-射線處理的具有Neomycin抗性的(Neomycin-resistant)小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)；小鼠胚胎干細胞系是V6.5具有C57BL/6和129S6vEv雜合遺傳背景，均來自美國國立心肺血液研究所轉(zhuǎn)基因中心。所使用的MEF和ES細胞培養(yǎng)液DMEM及所需添加物LIF、NEAA、L-glutamine、HEPES、β-mercaptoethanol、PEN/STREP、Puromycin等，均購自Millipore公司。

用于培養(yǎng)胚胎干細胞的培養(yǎng)皿制備，按如下程序和比例進行：10cm細胞培養(yǎng)皿用3ml 0.1％Gelatin于37℃包被2小時或者4℃包被過夜備用，然后37℃水浴快速解凍MEF細胞、1000rpm離心5min后去上清、重懸，加入2X10⁶ Neomycin-resistant MEFs培養(yǎng)過夜，其它大小培養(yǎng)皿按比例放大和縮小使用量。

ES細胞培養(yǎng)與傳代過程是：37℃水浴快速解凍ES細胞、1000rpm離心5min后去上清，重懸后將適量ES細胞接種至上述制備好的培養(yǎng)皿中。ES細胞長至70％豐度以1：3比例傳代。

準備用于電轉(zhuǎn)的ES細胞過程是：37℃0.25％胰酶消化細胞4min，反復吹打至單個細胞，并計數(shù)，1000rpm離心收集，PBS洗滌一次，按0.5X10⁷個細胞/ml濃度重懸于電轉(zhuǎn)緩沖液中(Millipore)。

ES細胞電轉(zhuǎn)過程是：將0.6ml上述細胞加入含50μg線性化打靶載體DNA的1.5ml EP管中混勻，并轉(zhuǎn)移至Eppendorf電轉(zhuǎn)儀配套電轉(zhuǎn)杯中，室溫靜置5min。用Eppendorf multiporator電轉(zhuǎn)儀320V 500μF電轉(zhuǎn)，取出電轉(zhuǎn)杯室溫放置5min。轉(zhuǎn)移至含30ml培養(yǎng)液的50ml離心管中混勻，再均勻分配至事先準備好含滋養(yǎng)層細胞的3個10cm培養(yǎng)皿中，37℃5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

ES細胞藥物處理過程是：電轉(zhuǎn)后的ES細胞在24小時后，換成含800μg/ml G418和200μM ganciclovir培養(yǎng)液，此后每天更換含藥物的培養(yǎng)液

ES細胞單克隆挑選、培養(yǎng)與凍存過程是：連續(xù)藥物處理7天后，在尼康SMZ1500顯微鏡下用特制吸管挑取胚胎干細胞單克隆并轉(zhuǎn)移至事先準備好的含滋養(yǎng)層細胞及培養(yǎng)液的48孔培養(yǎng)板中，每種打靶載體各挑取30個左右單克隆，于37℃5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24小時后，用胰酶消化挑取的單克隆細胞并吹打6次，再轉(zhuǎn)移至新的事先準備好的含滋養(yǎng)層細胞及培養(yǎng)液的48孔培養(yǎng)板中，于37℃5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4天，每天換液。待單克隆細胞長至80％豐度，細胞經(jīng)胰酶消化、吹打、培養(yǎng)基中和后，將1/3細胞懸液轉(zhuǎn)移至事先準備好的含滋養(yǎng)層細胞及培養(yǎng)液的24孔培養(yǎng)板中，并于37℃5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞豐度達90％，用于制備基因組DNA；向剩余在48孔培養(yǎng)板的細胞懸液中加入等體積的2X胚胎干細胞凍存液(Millipore)，用Parafilm封好培養(yǎng)板四周再包裹兩層以上吸水紙，儲存在-80℃冰箱備后續(xù)利用。

實施例4:外源基因靶向整合至MYH9內(nèi)含子2位點的陽性ES細胞單克隆的篩選與鑒定

基因組DNA制備：移去培養(yǎng)在上述24孔板中的經(jīng)藥物篩選的ES單克隆細胞的培養(yǎng)液，PBS洗滌一次，加入600μl含RNaseA的Nuclei lysis solution(Promega)，反復吹打并轉(zhuǎn)移至一干凈EP管中，加入200μl Protein precipitation solution，有力地振蕩30s后，冰上放置5min，接著高速離心10min，然后轉(zhuǎn)移上清至一新EP管；加入等體積的Isopropanol并充分混勻，接著室溫高速離心10min，然后去除上清；用1ml 70％乙醇洗滌DNA沉淀一次，再高速離心5min，然后用真空泵吸去上清，室溫風干10-15min，最后加入100μl DNA Rehydration solution，于37℃溶解DNA 2小時或者4℃溶解過夜并保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR篩選與鑒定：我們以前的研究表明，利用Southern Blot和PCR方法篩選與鑒定獲得一致的結(jié)果，因此本發(fā)明中主要利用PCR方法對同源重組事件進行分析和確定。以提取的小鼠ES細胞基因組DNA為模板利用P1 5’-ATGAGGAAATTGCATCGCATTGTC(SEQ ID NO.11)和P2 5’-GGAACCTCGATGCGCATACATAG(SEQ ID NO.12)及Platinum Taq High Fidelity DNA Polymerase進行PCR反應，其中P1位于Neomycin 3’末端，P2位于右側(cè)同源臂下游。PCR反應條件是94℃3min,94℃30s,60℃30s,68℃140s,30cycles,68℃10min。PCR擴增產(chǎn)物用1.0％瓊脂糖凝膠電泳分析，若為野生型等位基因A⁺則無條帶，若為突變型等位基因A^{KI Neo}、A^{KI EF}1^α-GFP-pA、A^{KI pA-GFP-EF1α}、A^{KI αMHC-Puro-IRES-GFP-pA}皆可產(chǎn)生約2.2kb條帶。

PCR反應特異性確認：為確認該2.2kb DNA條帶的特異性，隨機從每一種打靶載體產(chǎn)生的陽性細胞單克隆中挑取一個，進行二次證實，并將該2.2kb DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切出，經(jīng)DNA extraction kit回收后，連接至T-easy載體中，經(jīng)轉(zhuǎn)化、細菌單克隆隨機挑取和培養(yǎng)、質(zhì)粒DNA制備、酶切初步鑒定等過程，最后送商業(yè)公司測序。測序結(jié)果表明，完全符合預期序列，從而證實該2.2kb條帶是由于MYH9基因內(nèi)含子2位點發(fā)生特異性突變所產(chǎn)生的。各靶向整合外源基因的打靶載體在小鼠ES細胞中發(fā)生同源重組的效率如表1所示。

表1：基因打靶同源重組效率

實施例5：定點敲入基因的表達分析

如上述所示，在本發(fā)明中每種靶向整合外源基因的打靶載體皆獲得多個陽性細胞單克隆，為此隨機從上述48孔培養(yǎng)板中挑取一個單克隆細胞進行定點敲入基因的表達分析，并與對照的野生型ES細胞進行比較。本發(fā)明中使用無組織特異性啟動子EF1α和組織特異性啟動子αMHC調(diào)控插入基因的表達，接下來將分別進行分析。

無組織特異性啟動子EF1α調(diào)控下的基因表達分析：在37℃解凍凍存于48孔培養(yǎng)板中的ES細胞，隨機挑取一個A⁺/A^{KI EF1α}-^GFP-^pA,A⁺/A^{KI pA-GFP-EF1α}和A⁺/A⁺(對照)基因型ES單克隆細胞，轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管中，1000rpm離心5min，去除上清，重懸細胞，然后接種至事先準備好的含滋養(yǎng)層細胞及培養(yǎng)基的6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，ES細胞培養(yǎng)、傳代和凍存按例行方法進行。接種約1000個ES細胞至一35x10mm Tissue Culture Dish(Thermo Fisher)中，正常條件下培養(yǎng)3天后，在熒光顯微鏡下觀察并攝取活細胞圖像，結(jié)果顯示EF1α啟動子調(diào)控下的GFP蛋白發(fā)出強烈熒光信號，而野生型ES細胞則無熒光，并且正向、反向插入表達盒的兩種細胞之間熒光信號強度無明顯差異，由此充分說明定點插入MYH9基因內(nèi)含子2位點的外源基因表達正常且與插入反向無關(guān)，如圖4所示。

組織特異性啟動子αMHC調(diào)控下的基因表達分析：在37℃解凍凍存于48孔培養(yǎng)板中的ES細胞，隨機挑取一個A⁺/A^{KI αMHC-Puro-IRES-GFP-pA}和A⁺/A⁺(對照)基因型ES單克隆細胞，于一個10cm tissue culture dish中擴增培養(yǎng)，待長至70％以上豐度，利用胰酶消化細胞，吹打成單個細胞，1000rpm離心5min去除上清，再使用不含胚胎干細胞分化抑制劑LIF但含20％FCS的DMEM培養(yǎng)基重懸并配制成2X10⁵cells/ml細胞懸液。將30μL/滴的單細胞懸液點至直徑10cm的培養(yǎng)皿蓋內(nèi)面上，獲得多個彼此分開的小滴；在培養(yǎng)皿中加入15mL無菌D-Hank’s緩沖液，然后小心蓋上培養(yǎng)皿蓋，放置在37℃5％CO2培養(yǎng)箱中倒懸培養(yǎng)2天。用無菌吸管收集單個懸滴形成的擬胚體，轉(zhuǎn)入含100ng/ml重組人類Activin A蛋白(R&D Systems)的分化培養(yǎng)基的6孔細胞培養(yǎng)板中于37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時，然后換成含10ng/ml重組人類BMP4蛋白(R&D Systems)的分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)96小時。在分化培養(yǎng)液中共計培養(yǎng)5天后，換成含10μg/ml Puromycin的正常培養(yǎng)基處理擬胚體狀細胞7天。換液過程中，將細胞用吸管轉(zhuǎn)入15ml無菌管中并使用200rpm低速離心5min方法去除上清。從分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)開始至藥物處理整個過程中，用熒光顯微鏡攝取擬胚體實時圖像，并觀察心肌細胞(群)的自主節(jié)律性收縮。結(jié)果表明自分化兩天后，A+/AKI αMHC-Puro-IRES-GFP-pA擬胚體可見微弱GFP熒光信號，而A+/A+擬胚體無熒光；藥物處理7天后，A+/AKI αMHC-Puro-IRES-GFP-pA擬胚體可見強烈熒光，并伴隨自主節(jié)律性收縮，而A+/A+擬胚體不僅無熒光，還因藥物處理逐步凋亡，如圖5所示。

實施例6：定點插入的外源基因?qū)?nèi)源MYH9基因表達的影響分析

采用蛋白質(zhì)印記實驗分析定點插入的外源基因?qū)?nèi)源MYH9基因的表達進行分析。如實施例5在6孔板中培養(yǎng)A+/AKI EF1α-GFP-pA,A+/A KI pA-GFP-EF1α和A+/A+(對照)基因型ES單克隆細胞直到長至80％以上豐度，移去培養(yǎng)基，PBS洗滌細胞一次，然后直接加入0.3ml 2X SDS Sample Buffer(Thermo Fisher)裂解細胞。從上述細胞中提取的蛋白經(jīng)10％SDS-PAGE Gel電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，1小時5％milk封閉；根據(jù)分子量大小將膜分成兩半，一部分與Anti-NMHC IIA antibody和另一部分與Anti-βactin antibody(Abcam)4℃孵育過夜，洗膜，與Anti-mouse HRP(Abcam)室溫孵育2小時，再洗膜，最后經(jīng)辣根過氧化物酶HRP-ECL發(fā)光法(Pierce)獲得結(jié)果，掃描膠片，利用Image J進行圖片灰度分析。以NMHC IIA/β-actin比值衡量和比較NMHC IIA在不同細胞中的表達量變化。結(jié)果顯示，與A+/A+(對照)細胞比較，A+/AKI EF1α-GFP-pA和A+/A KI pA-GFP-EF1α細胞中NMHC IIA的表達量幾乎一致，表明定點插入MYH9基因內(nèi)含子2位點的外源基因?qū)?nèi)源MYH9基因不產(chǎn)生任何影響，從而確定MYH9基因內(nèi)含子2位點完全可以作為一個新的外源基因插入的safe harbor。