一種生物靶向納米基因材料及其制造方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種納米基因材料，其特征在于：包括具有靶向性的納米基因基材；所述納米基因基材由氨基酸聚合物、修飾性聚乙二醇、血管緊張素Ⅱ多肽制備而成；其中，所述氨基酸聚合物和血管緊張素Ⅱ多肽分別與修飾性聚乙二醇兩端的修飾基團發(fā)生化學反應后獲得具有靶向性的納米基因基材。本發(fā)明提供的一種新型的對缺血心肌具有靶向性、對基因具有保護作用、轉染效果佳、毒性低的納米基因材料。
【專利說明】
-種生物卽向納米基因材料及其制造方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及基因載體領域，具體地，設及一種生物祀向納米基因材料及其制造方 法。
【背景技術】
[0002] 近年來，屯、血管疾病已經(jīng)成為世界范圍內發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一。盡管 基因治療已經(jīng)取得了令人滿意的效果，但是安全有效的傳遞載體仍然是瓶頸所在。常用的 屯、肌轉運載體可分為病毒載體和非病毒載體。由于具有較高的轉染效率，病毒載體的應用 仍然具有絕對優(yōu)勢。但是，由于病毒載體引起的機體免疫反應較強，使其臨床應用受到制 約。作為病毒載體的有效補充，近年來非病毒載體的研究日益深入。
[0003] 非病毒載體具備無傳染性，沒有載體容量限制，材料來源廣泛，化學結構可控制， 且易于大量制備，可負載基因，如:反義寡核巧酸，有著病毒載體不可替代的作用。
[0004] 但是，目前的非病毒載體往往存在轉染效率低，目的基因多數(shù)只能實現(xiàn)瞬間表達， 其運送系統(tǒng)的顆粒較大，容易引發(fā)免疫反應和被機體所清除。
[0005] 針對該缺陷，在現(xiàn)有的對非病毒載體的基礎研究中，體外轉染最常用的載體(媒 介)包括陽離子脂質體和陽離子聚合物，如:Lipo2000、聚乙締亞胺PEI25000、PEI18000等， 此類產品均是目前公認的對多種細胞具有較高轉染效率的商品化轉染試劑之一，所W常被 用來作為評價其他siRNA遞送載體有效性的標準。
[0006] 然而，研究表明，長期使用Lipofectamine 2000?系列產品遞送SiRNA會增加細胞 的自隧水平，誘發(fā)體內炎癥。此外脂質體的血漿穩(wěn)定性差，在血液中粒徑、表面電位及脂質 成分都有改變的趨勢。而PEI系列產品的生物毒性明顯。運些都限制了脂質體和PEI在臨床 上的應用。
[0007] 因而，目前急需一種轉染效果佳，穩(wěn)定性佳，且無毒性或毒性較低的載體。
[0008] 此外，目前針對屯、血管疾病的治療產品中，用于負載基因的載體，往往在治療時無 祀向性，因此，不能解決病變部位富集的情況下的祀向治療的問題。

【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明旨在克服上述缺陷，提供一種新型的對基因具有保護作用、轉染效果佳、毒 性極低、通過在載體上還連接有具有缺血屯、肌祀向性的多膚ATI來實現(xiàn)祀向治療效果的納 米基因材料。
[0010] 本發(fā)明提供的納米基因材料，其特征在于:包括具有祀向性的納米基因載體;上述 納米基因載體由氨基酸聚合物、修飾性聚乙二醇、血管緊張素 Π 的功能序列多膚制備而成；
[0011] 其中，上述氨基酸聚合物和血管緊張素 Π 的功能序列多膚分別與修飾性聚乙二醇 兩端的修飾基團發(fā)生化學反應后獲得具有祀向性的納米基因載體。
[0012] 進一步地，本發(fā)明的納米基因材料，還具有運樣的特點：上述氨基酸聚合物為由賴 氨酸、絲氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、鄉(xiāng)氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨 酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、半脫氨酸、酪氨酸、天冬酷胺、谷氨酷胺中的 一種或多種氨基酸形成的聚合物或共聚物中的一種或多種。
[0013] 優(yōu)選自由賴氨酸制備的聚合物，或包含有質量百分比含量為45-80%的賴氨酸的 共聚物。
[0014] 進一步地，本發(fā)明的納米基因材料，還具有運樣的特點：上述修飾性聚乙二醇的結 構如下所示：
[0015]
[0016] 其中，m為80-500的整數(shù)；
[0017] 化為酷胺基、締控基、環(huán)締控基、帶有雙鍵的雜環(huán)基；
[0018] 上述酷胺基的結構式如下所示：
[0019]
旨P、修飾性聚乙二醇的結構如下所示：
[0020]
[0021] R3為締控基、環(huán)締控基、帶有雙鍵的雜環(huán)基；
[0022] 上述締控基的結構式如下所示：
[0023]
[0024] 目P、修飾性聚乙二醇的結構如下所示：
[0025]
[0026] nl和n2為0到20的整數(shù)；當鏈長越長時，該材料的表面活性越好。
[0027] 上述環(huán)締控基的結構式如下所示：
[00川 R2為醋基；
[0032] 上述醋基的結構式如下所示：
[0033]
[0034] R4為烷基、芳基、雜環(huán)基；
[0035] 上述雜環(huán)基的結構式如下所示：
[0036]
[0037] Rx1-2Q選自氨、烷基、烷氧基、氨基或C-Rx1-2Q為幾基；
[0038] Rx1-20優(yōu)選氨、甲基、乙基、甲氧基、氨基及C-Rx1-20為幾基；
[0039] Y為氮、氧、硫；
[0040] η為0-20的整數(shù)，當鏈長越長時，該材料的表面活性越好。
[0041] 進一步地，本發(fā)明的納米基因材料，還具有運樣的特點：上述氨基酸聚合物的聚合 度為50-500;優(yōu)選為80-160;
[0042] 上述氨基酸聚合物的的分子量為10000-100000;優(yōu)選為15000W上；
[0043] 上述修飾性聚乙二醇的分子量為1000-10000;優(yōu)選為1500 W上。
[0044] 此外，本發(fā)明還提供了上述納米基因材料的制備方法，其特征在于：
[0045] 步驟一、配置反應物：
[0046] 將氨基酸聚合物溶解于溶劑中配置成溶液Α;
[0047] 將修飾性聚乙二醇溶解于溶劑中配置成溶液Β;
[0048] 將血管緊張素 Π 的功能序列多膚溶解于溶劑中配置成溶液C;
[0049] 步驟二、將溶液Β滴加入溶液A中，于10-50°C的溫度下，反應1-5小時；
[0050] 步驟Ξ、在保護氣保護的條件下，加入溶液C，于10-50°c的溫度下，反應8-24小時；
[0051] 步驟四、將獲得的溶液透析24-96小時后，冷凍干燥。
[0052] 如權利要求5上述的一種納米基因材料的制備方法，其特征在于：
[0053] 上述溶劑選自抑為7-8的憐酸緩沖鹽溶液、二甲基甲酯胺、二甲基亞諷、四氨巧喃、 醇、酸、醋中的一種或幾種；
[0054] 上述聚賴氨酸、修飾性的聚乙二醇與血管緊張素 Π 的功能序列多膚的摩爾比為1: 2-100:1-100；
[0055] 優(yōu)選地，上述聚賴氨酸、修飾性的聚乙二醇與血管緊張素 Π 的功能序列多膚的摩 爾比為 1:2-10:2-8。
[0056] 進一步地，本發(fā)明提供的上述納米基因材料的制備方法，還具有運樣的特點：即、 在步驟Ξ和四之間，還設有中和步驟；
[0057] 上述中和步驟為:于步驟Ξ的溶液中加入半脫胺等中和用試劑，于10-50°C的溫度 下，反應1-5小時；
[005引上述半脫胺的制備方法為:將半脫胺鹽酸鹽溶解于二次水中，加入有機堿震蕩混 合5-20分鐘，冷卻后，采用有機溶劑萃取后，蒸除溶劑后獲得半脫胺；
[0化9] 上述修飾性聚乙二醇與半脫胺鹽酸鹽的摩爾比為1:50-150;優(yōu)選為1: :80-100;
[0060] 上述有機堿與半脫胺鹽酸鹽的摩爾比為1:0.1-10;優(yōu)選為1:1-1.5。
[0061] 進一步地，本發(fā)明的納米基因材料，還具有運樣的特點：即、上述具有祀向性的納 米基因載體在靜電作用下負載基因；
[0062] 上述基因可W選自反義寡核巧酸、反義表達質粒、表達質粒等基因；
[0063] 上述負載的過程為:將具有祀向性的納米基因載體加入基因中，吹打均勻后于30- 40°C的條件下解育0.5-2小時；
[0064] 上述具有祀向性的納米基因載體與基因的質量比為1:0.01-15;
[0065] 上述具有祀向性的納米基因載體與基因的質量比優(yōu)選為1:1-10。
[0066] 進一步地，本發(fā)明的納米基因材料，還具有運樣的特點：即、上述聚氨基酸為聚合 度為95-135的樹枝狀聚賴氨酸；
[0067] 上述修飾性聚乙二醇的分子量為1500-2500,其兩端的修飾基團分別為NHS和MAL。
[0068] 進一步地，本發(fā)明的納米基因材料，還具有運樣的特點：
[0069] 上述基因為用于屯、肌缺血治療的基因；
[0070] 上述基因為miRNA-1的反義寡核巧酸。
[0071] 進一步地，本發(fā)明的納米基因材料，還具有運樣的特點：上述具有祀向性的納米基 因載體在靜電作用下負載miRNA-1的反義寡核巧酸；
[0072] 上述負載的過程為:將具有祀向性的納米基因載體加入miRNA-1的反義寡核巧中， 吹打均勻后于30-40°C的條件下解育0.5-2小時。
[0073] 該具有祀向性的納米基因載體與基因的質量比為0.01-15:1;優(yōu)選為0.1-10:1;最 優(yōu)選為0.5-8:1。
[0074] 進一步地，本發(fā)明的納米基因材料，還具有運樣的特點：上述納米基因材料為具有 缺血屯、肌祀向性的納米基因載體。
[0075] 該納米基因材料還可W為未連接有血管緊張素 Π 的功能序列多膚的納米基因載 體，即、DGL-PEG/AMO-1，其制備方法和原料比例，同于DGL-PEG-ATl/AMO-1。
[007引本發(fā)明的作用和效果:
[0077] 在本發(fā)明中，提供了一種新型的納米基因載體，該載體具有缺血屯、肌祀向性的作 用，且毒副作用小。
[0078] 如圖1所示，在本發(fā)明中，氨基酸聚合物和血管緊張素 Π 的功能序列多膚分別與修 飾性聚乙二醇兩端的修飾基團發(fā)生化學反應后獲得具有祀向性的納米基因載體，其后，通 過將該納米基因載體與反義寡核巧酸、反義表達質粒、表達質粒等負載獲得具有祀向功能 的納米基因載體。
[0079] 具體地，氨基酸作為生物體內構成蛋白質分子的基本單位，與生物的生命活動有 著密切的關系。它在基體內具有特殊的生理功能，是生物體內不可缺少的營養(yǎng)成分之一。而 在在本發(fā)明中選用的聚氨基酸，基于氨基酸的基本特性，當應用于載體后，仍能具有良好的 生物相容性等效果，帶有電荷的聚氨基酸在本發(fā)明中為優(yōu)選方案，由于自身帶有的電荷效 果，可與其他帶有反向電荷的物質發(fā)生分子間的靜電作用力，從而實現(xiàn)類似于自組裝的效 果。
[0080] 另外，在本發(fā)明中，聚氨基酸選用的最優(yōu)選案例中的DGL(樹枝狀聚賴氨酸），是一 種陽離子聚合物，是由賴氨酸(人體必需氨基酸)聚合而成的，其具有良好生物相容性的同 時、其生物可降解性和壓縮DNA的能力極佳，其表面有大量的氨基，可被修飾，且?guī)в姓姡?當其被其他基團修飾后，由于自身帶有的正電荷，可與其他帶有負電荷的物質發(fā)生分子間 的靜電作用力，從而實現(xiàn)負載因子或反義寡核巧酸的效果。
[0081] 此外，本發(fā)明中選用聚乙二醇作為反應組分之一，由于其本身為一種優(yōu)良的表面 活性劑，當其與聚氨基酸上的基團發(fā)生取代等反應后，能實現(xiàn)在聚氨基酸的表面形成一層 水化層的效果，從而能減小聚氨基酸的毒性，降低其在體內被巨隧細胞系統(tǒng)吞隧的可能性。
[0082] 另外，在本發(fā)明中，選用的PEG為兩端均設有修飾基團的PEG,從而使其通過該基團 上的活性基與聚氨基酸等物質發(fā)生反應，實現(xiàn)各組分之間的聯(lián)合的同時，提高產品的表面 張力和兼容性。
[0083] 另外，在本發(fā)明的最優(yōu)選方案中，將其兩端分別連接NHS和MAL基團，該NHS基團可 與聚氨基酸表面的氨基發(fā)生取代等反應，將D化和PEG連接起來;而MAL基團可與多膚AT1 (血 管緊張素 Π 的功能序列多膚)上的琉基-HS發(fā)生加成反應，從而將多膚ATI與PEG連接起來， 進而構建起D(iL和AT1的連接關系。
[0084] 此外，在本發(fā)明中使用的AT1，其為：當屯、肌梗死(屯、肌細胞缺血缺氧)時，細胞表面 的血管緊張素 Π 受體-I(ATIR)升高。所W在體外化學合成AT1R的配體中的一段功能序列 (稱AT1)連接在納米材料表面，可祀向結合缺血屯、肌的AT1R，從而對缺血屯、肌具有一定的祀 向作用。
[0085] 在本發(fā)明中，體外合成的AT1多膚，其氨基酸序列如下所示：
[00 化]Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe;
[0087] AT1R的配體的功能序列如下所示：
[0088] Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe；
[0089] 其中間的Gly-Gly-Gly-Gly為間隔序列，切S是中含有琉基-HS，是化學連接的功能 基團。
[0090] 此外，在本發(fā)明中，使用AM〇-l(miRNA-l的反義寡核巧酸)作為負電荷的供電體，與 上述合成基材通過靜電實現(xiàn)組裝的結果。
[0091] miRNA-1在屯、肌梗死或者細胞缺血缺氧時升高，可促進屯、肌細胞的調亡，是屯、肌細 胞的損害因子。而AM0-1是指miRNA-1的反義寡核巧酸，是化學合成的與miRNA互補的單鏈 RNA。其在細胞質中可與成熟的miRNA-1發(fā)生互補配對，使得miRNA-1的損害作用減弱，上述 各化合物的序列如下所示：
[0092] miRNA-1序列：5 ' -UGGAAUGUAAAGAAGUGUGUAU-3 '
[0093] AM0-1 序列：5 ' -AUACACACUUCUUUACAUUCCA-3 '
[0094] 在優(yōu)選方案中，AM0-1帶負電，可W與帶正電DGL-PEG或DGL-PEG-AT1通過靜電作用 形成納米顆粒。
【附圖說明】
[00M]附圖1、納米材料形成和材料結構的示意圖；
[0096] 附圖2、納米材料核磁圖譜；
[0097] 附圖3、納米材料負載AM0-1后的粒徑和電位圖；
[0098] 附圖4、納米材料負載AM0-1后的透射電鏡圖；
[0099] 附圖5、納米材料負載AM0-1凝膠電泳圖
[0100] 附圖6(a)、納米材料對H9C2細胞毒性4小時對比圖；
[0101] 附圖6(b)、納米材料對H9C2細胞毒性8小時對比圖；
[0102] 附圖7(al)、激光共聚焦觀察4小時對比圖；
[0103] 附圖7(曰2)、流式細胞檢測4小時對比圖；
[0104] 附圖7化1)、激光共聚焦觀察8小時對比圖；
[0105] 附圖7化2)、流式細胞檢測8小時對比圖；
[0106] 附圖8、活死染色實驗結果對比圖；
[0107] 附圖9、原代屯、肌細胞免疫巧光染色對比圖；
[0108] 附圖10、原代屯、肌細胞水平治療實驗結果，各處理組miRNA-1量的對比圖；
[0109] 其中，對照組：正常細胞(normal組）給予DEPC水、缺氧細胞（control組）給予DEPC 水、缺氧細胞(NC組）給予DGkWG-ATl/AMO-1-NC;實驗組:缺氧細胞(PEI組）給予陽I/AM0- 1、缺氧細胞（D化-PEG組）給予DGレPEG/AM0-1、缺氧細胞（D化-PEG-AT1組）給予DGレPEG- AT1/AM0-1。
【具體實施方式】
[0110] 1、原料和設備的準備
[01川 1)原料：
[0112]樹枝狀聚賴氨酸(Den化igraft pol}fA-lysines，DGL);
[011；3] 端馬來酷亞胺端N-徑基班巧酷亞胺聚乙二醇（α-Malemidyl - ω -N- hydroxysuccinimidyl polyethylene glycol，NHS-PEG2〇o〇-MAL);
[0114] ATI(祀向多膚序列：
[0115] Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)；
[0116] 半脫胺鹽酸鹽;二氯甲燒，Ξ乙胺。
[0117] 2)設備：
[011引定容瓶（1000血，2000血），燒杯(5001^，21，51^，2個燒瓶(251^)，磁子，磁力攬拌器 (可顯示溫度和轉速），1個瓶塞，1個橡皮蓋，2個針頭(長短），2條橡皮管，MWC0:8000-14000 透析袋。
[0119] 2、試劑準備(根據(jù)實際使用的需要還可配置其他濃度和抑的緩沖溶液）
[0120] 1)配置100011110.21的？85原液(抑=7.4)
[0121] 準備：250mL量筒，500mL燒杯，lOOOmL的定容瓶，二次水，胞2冊〇4-12此0，N址2P〇4- 2出0
[0122] 具體步驟：
[0123] a)分別稱量化抽P04-12出058.01868邑，胞此口04-2出05.92838邑，混合放入500血的燒 杯中，加入500mL的二次水，充分攬拌溶解。
[0124] b)將燒杯中的溶液倒入lOOOmL的定容瓶中，加入二次水定容至lOOOmL。（可將二次 水先加入燒杯中沖洗燒杯壁，再加入到定容瓶中，因為燒瓶壁可能有部分溶質的殘留）
[0125] C)用精密抑試紙測抑，確認抑值在7.4左右(7.2-7.4)
[0126] 2)配置500mL的lOmM的PBS緩沖液
[0127] a)取2.5mL原液，定容至化OmL(稀釋20倍)一做反應用 [012引 b)取lOOmL原液，定容到2000ml-透析用
[0129] (注:后面透析和反應用的PBS濃度都是lOmM)
[0130] 實施例一、DGL-PEG的合成
[01：31] a)稱量 22mg(l 皿 〇1)的 DGL(MW:25000)溶于 5mLPBS 緩沖液（lOmM;
[0132] 抑=7.4)(濃度0.2皿ol/mL)(稱量后將固體DGL置于lOmL邱管中）；
[0133] 在本實施例中，還可使用其他分子量的DGL，如:MW= 10000、18000、20000、27000、 30000、50000、80000或100000。
[0134] b)稱量 100mg(50 皿 〇1)的畑S-PEG2000-MAL(MW:2000)溶于 5mL 的 DMS0 中；
[0135] 在本實施例中，還可使用其他分子量的NHS-PEG2000-MAL，如：MW=1000、1800、 2100、2700、3000、4500、6500、8000或10000。
[0136] 在本實施例中，針對反應條件的科研過程中，還根據(jù)需取代基團的不同，對于DGL 與NHS-PEG2000-MAL的反應比進行調整，如:D化與NHS-PEG2000-MAL的摩爾比為1: 2、1:5、1: 10、1:15、1:25、1:30、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:80、1:100 不等。
[0137] 在本實施例中，針對反應條件的科研過程中，還根據(jù)反應的需要，對反應液的濃度 進行調整，如:濃度為 1 皿〇l/ml、10 皿 ol/ml、50ymol/ml、100ymol/ml、120ymol/ml、150ymol/ ml、210ymol/ml、650ymol/ml、lOOOymol/ml、1200ymol/ml、1500ymol/ml 不等。一般來說，當 取代反應發(fā)生的反應位較多（多于20的取代)的情況下，采用lOOymol/mlW上的濃度進行反 應，當取代反應發(fā)生的反應位較少（少于20的取代）的情況下，采用100皿ol/mlW下的濃度 進行反應；
[013引 C)將b)緩慢滴加入a)中（500-1000轉/分的混合條件下），55°C反應化；
[0139]在本實施例中，針對反應條件的科研過程中，還根據(jù)需取代數(shù)量的不同，其反應溫 度可W調整為10°(：、15°(：、20°(：、25°(：、30°(：、40°(：、45°(：不等，其反應時間為0.5小時、1小時、 1.5小時、2小時、2.5小時不等。一般來說，當取代反應發(fā)生的反應位較多（多于20的取代)的 情況下，反應時間大于2小時，當取代反應發(fā)生的反應位較少（少于20的取代）的情況下，反 應時間小于2小時，進行反應；
[0140] d)稱量90.88mg(800皿〇1)半脫胺鹽酸鹽(MW:113.61)于20mL的ep管中，加入15mL 二次水，分兩次進行超聲溶解；
[0141] 在本實施例中，針對反應條件的科研過程中，根據(jù)需取代基團、取代數(shù)量的不同， 對于NHS-陽G-MAL半脫胺鹽酸鹽的反應比可進行調整，NHS-PEG-MAL:半脫胺鹽酸鹽的摩爾 比為 1:50、1:60、1:70、1:80、1:85、1:95、1:110、1:120、1:130、1:140、1:150不等。一般來說， 當取代反應發(fā)生的反應位較多（多于20的取代）的情況下，摩爾比采用少于1:85的比例，當 取代反應發(fā)生的反應位較少(少于20的取代)的情況下，摩爾比采用多于1:85的比例；
[0142] e)待完全溶解后，加入Ξ乙胺(MW:101.19;密度：0.726g/mL)65.如L，充分震蕩 5min(用手搖晃即可，巧管會有些發(fā)熱）。
[0143] 在本實施例中，針對反應條件的科研過程中，半脫胺鹽酸鹽:Ξ乙胺的摩爾比可W 調整為 1:0.5、1:0.8、1:1、1:1.5、1:1.9、1:2、1:5、1:10。
[0144] f)待反應完全后，加入lOmL二氯甲燒，多次萃取，將獲得的萃取液減壓蒸除后獲得 固體;將得到的固體溶于5mLPBS(1 OmM，pH=7.4)中，加入C的產物中，于55°C反應化。
[0145] 在本實施例中，針對反應條件的科研過程中，還根據(jù)需取代數(shù)量的不同，其反應溫 度可W調整為10°(：、15°(：、20°(：、25°(：、30°(：、40°(：、45°(：不等，其反應時間為0.5小時、1小時、 1.5小時、2小時、2.5、3小時、4小時、4.5小時、5小時不等。一般來說，當取代反應發(fā)生的反應 位較多（多于20的取代）的情況下，反應時間大于2小時，當取代反應發(fā)生的反應位較少（少 于20的取代）的情況下，反應時間小于2小時，進行反應；
[0146] g)將d)中最終的溶液加入MWC0 = 8000-14000化的透析袋中在一次水中透析4她。
[0147] 在本實施例中，針對反應條件的科研過程中，還根據(jù)反應的需要，透析的時間可W 為12小時、36小時、56小時、72小時、96小時不等；
[014引 h)凍干。
[0149] 實施例二、DGL-PEG-AT1 的合成
[0150] 反應方程式如下所示：
[0151]
[0152] a)稱量 22mg(l 皿 ol)的 DGL(MW:25000)溶于 5mLPBS 緩沖液 α0mM;pH = 7.4)(濃度 0.2皿ο 1 /mL)(稱量后將固體DGL置于1 OmL巧管中）；
[0153] 在本實施例中，還可使用其他分子量的DGL，如:MW=10000、18000、20000、27000、 30000、50000、80000或100000。
[0154] b)稱量 100mg(50 皿 〇1)的畑S-PEG2000-MAL(MW:2000)溶于 5mL 的 DMS0 中；
[01巧]在本實施例中，還可使用其他分子量的NHS-PEG2000-MAL，如：歷=1000、1800、 2100、2700、3000、4500、6500、8000或10000。
[0156] 在本實施例中，針對反應條件的科研過程中，還根據(jù)需取代基團的不同，對于DGL 與NHS-PEG2000-MAL的反應比進行調整，如:D化與NHS-PEG2000-MAL的摩爾比為1: 2、1:5、1: 10、1:15、1:25、1:30、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:80、1:100 不等。
[0157] 在本實施例中，針對反應條件的科研過程中，還根據(jù)反應的需要，對反應液的濃度 進行調整，如:濃度為 1 皿〇l/ml、10 皿 ol/ml、50ymol/ml、100ymol/ml、120ymol/ml、150ymol/ ml、210ymol/ml、650ymol/ml、lOOOymol/ml、1200ymol/ml、1500ymol/ml 不等。一般來說，當 取代反應發(fā)生的反應位較多（多于20的取代)的情況下，采用lOOymol/mlW上的濃度進行反 應，當取代反應發(fā)生的反應位較少（少于20的取代）的情況下，采用100皿ol/mlW下的濃度 進行反應；
[015引 C)將b)緩慢滴加入a)中（500-1000轉/分的混合條件下），55°C反應化；
[0159]在本實施例中，，針對反應條件的科研過程中，還根據(jù)需取代數(shù)量的不同，其反應 溫度可W調整為10 °C、15 °C、20 °C、25 °C、30 °C、40 °C、45 °C不等，其反應時間為0.5小時、1小 時、1.5小時、2小時、2.5小時不等。一般來說，當取代反應發(fā)生的反應位較多（多于20的取 代）的情況下，反應時間大于2小時，當取代反應發(fā)生的反應位較少（少于20的取代）的情況 下，反應時間小于2小時，進行反應；
[0160] (1)稱量35.88111邑(254111〇1)41'1(麗：1377.55，純度96%)溶于50化10150中；
[0161] 在本實施例中，針對反應條件的科研過程中，還根據(jù)需取代基團的不同，對于DGL 與ATI的反應比進行調整，如:D化與ATI的摩爾比為1:1、1:5、1:10、1:15、1:25、1:30、1:40、 1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:80、1:100 不等。
[0162] 在本實施例中，針對反應條件的科研過程中，還根據(jù)反應的需要，對反應液的濃度 進行調整，如:濃度為 1 皿〇l/ml、10 皿 ol/ml、50ymol/ml、100ymol/ml、120ymol/ml、150ymol/ ml、210ymol/ml、650ymol/ml、lOOOymol/ml、1200ymol/ml、1500ymol/ml 不等。一般來說，當 取代反應發(fā)生的反應位較多（多于20的取代)的情況下，采用lOOymol/mlW上的濃度進行反 應，當取代反應發(fā)生的反應位較少（少于20的取代）的情況下，采用100皿ol/mlW下的濃度 進行反應；
[0163] e)將d)加入C)中，氮氣(或氮氣、氣氣等)保護，室溫反應20h。
[0164] 在本實施例中，針對反應條件的科研過程中，還根據(jù)反應的需要對其反應時間進 行調整，其反應時間還可W為8小時、10小時、15小時、20小時、24小時不等。一般來說，當取 代反應發(fā)生的反應位較多（多于20的取代）的情況下，反應時間大于15小時，當取代反應發(fā) 生的反應位較少(少于20的取代）的情況下，反應時間小于15小時，進行反應；
[01化]f)稱量90.88mg(800皿〇1)半脫胺鹽酸鹽(MW:113.61)于20mL的ep管中，加入15mL 二次水，分兩次進行超聲溶解；
[0166] 在本實施例中，針對反應條件的科研過程中，根據(jù)需取代基團、取代數(shù)量的不同， 對于NHS-陽G-MAL半脫胺鹽酸鹽的反應比可進行調整，NHS-PEG-MAL:半脫胺鹽酸鹽的摩爾 比為 1:50、1:60、1:70、1:80、1:85、1:95、1:110、1:120、1:130、1:140、1:150不等。一般來說， 當取代反應發(fā)生的反應位較多（多于20的取代）的情況下，摩爾比采用少于1:85的比例，當 取代反應發(fā)生的反應位較少(少于20的取代)的情況下，摩爾比采用多于1:85的比例；
[0167] g)待完全溶解后，加入Ξ乙胺(MW:101.19;密度：0.726g/mL)65.如L，充分震蕩 5min(用手搖晃即可，巧管會有些發(fā)熱）。
[0168] 在本實施例中，針對反應條件的科研過程中，半脫胺鹽酸鹽:Ξ乙胺的摩爾比可W 調整為 1:0.5、1:0.8、1:1、1:1.5、1:1.9、1:2、1:5、1:10。
[0169] h)待反應完全后，加入lOmL二氯甲燒，多次萃取，將獲得的萃取液減壓蒸除后獲得 固體;將得到的固體溶于5mLPBS(1 OmM，pH=7.4)中，加入e的產物中，于55°C反應化。
[0170] 在本實施例中，，針對反應條件的科研過程中，還根據(jù)需取代數(shù)量的不同，其反應 溫度可W調整為10 °C、15 °C、20 °C、25 °C、30 °C、40 °C、45 °C不等，其反應時間為0.5小時、1小 時、1.5小時、2小時、2.5、3小時、4小時、4.5小時、5小時不等。一般來說，當取代反應發(fā)生的 反應位較多（多于20的取代)的情況下，反應時間大于2小時，當取代反應發(fā)生的反應位較少 (少于20的取代）的情況下，反應時間小于2小時，進行反應；
[0171] i)將f)中最終的溶液加入MWC0 = 8000-14000化的透析袋中在PBS中透析4她，再在 一次水中透析48小時。
[0172] 在本實施例中，針對反應條件的科研過程中，還根據(jù)反應的需要，兩次透析的時間 可W為12小時、36小時、56小時、72小時、96小時、120小時不等；
[0173] f)凍干
[0174] 注:一次水中透析后，會產生少許沉淀，離屯、后取上清，凍干，沉淀棄掉。
[0175] 實施例Ξ、負載反義寡核巧酸
[0176] 在本實施例中，選用AM0-1，納米材料(NHS-陽G或NHS-PEG-MAL)和AM0-1按照質量 比（20:1)負載。將納米材料和AM0-1溶于DEPC水，在20化L的ep管中先加入AM0-1，再加入材 料，吹打混勻，滿旋80s后置于47°C溫箱中解育1小時。（原理:靜電作用;D化帶正電，AM0-1帶 負電）
[0177] (注l:miRNA-l在屯、肌細胞缺氧時升高，對促進屯、肌細胞的調亡，是屯、肌細胞的損 害因子。AM0-1是指miRNA-1的反義寡核巧酸，是化學合成的與miRNA互補的單鏈RNA。其在細 胞質中可與成熟的miRNA-1發(fā)生互補配對，使得miRNA-1的損害作用減弱。）
[0178] (注2:miRNA-1 序列：5 ' -UGGAAUGUAAAGAAGUGUGUAU-3 '
[01 巧]AM0-1 序列：5 ' -AUACACACUUCUUUACAUUCCA-3 '）
[0180] 在本實施例中，針對反應條件的科研過程中，根據(jù)需求的不同，對于納米材料： AM0-1的反應比可進行調整，AM0-1:納米材料的質量比為1:1、1:5、1:8、1:10、1:15、1:25、1: 30、1:40、1:50、1:60、1:65、1:70、1:80、1:90、1:100 不等。
[0181] 實施例四、理化分析和表征
[0182] 本表征的產品為采用實施例一的方法和實施例二的方法獲得的載體。
[0183] 其中，DGL-PEG為選用聚賴氨酸、修飾性的聚乙二醇的摩爾比為1:5的產物；
[0184] D化-PEG-AT1為選用聚賴氨酸、修飾性的聚乙二醇與血管緊張素 Π 的功能序列多 膚的摩爾比為1:5:2.5的產物；
[0185] (l)iHNMR 檢測圖譜
[0186] 如圖2所示，a( δ = 1-1.8ppm)為賴氨酸上的3個C出上的Η，是D化的特征峰。b (δ = 3.6卵m)為陽G的重復序列0-C出-CH2-0，d為（δ = 6.8ppm)為MAL上的Η，e (δ = 2.6ppm)為Ν服上 的Η，均為MAkWG-N服的特征峰。C為AT 1苯環(huán)上的Η，是AT 1的特征峰。D化-PEG中a，b峰存在， 說明陽G和D化連接，e峰消失，說明NHS發(fā)生反應;d峰消失，說明半脫胺鹽酸鹽與MAL發(fā)生反 應。D化-PEG-AT1中出現(xiàn)了 C峰，說明AT 1成功連接在DGレPEG-MAL上。由此推斷，D化，NHS- PEG-MAL，ATI成功連接在一起。
[0187] (2)粒徑和電位
[018引將合成的DGkPEG-AT 1在DEPC水中負載AM0-1后（納米材料/AM0-1的質量比為8: 1)，如圖3所示，用粒度儀檢測其粒徑約150nm，電位約+3mv。
[0189] (3)電鏡
[0190] 如圖4所示，電鏡結果顯示：D化-PEG-AT1/AM0-1(質量比為8:1)非水合粒徑為 50nm〇
[0191] (4)材料負載能力的測定
[0192] D化-PEG-AT1/AM0-1分別W質量比為0,0.5，1，2,4,6,8負載在一起。3%瓊脂糖凝 膠電泳跑膠，用SYBRn染色。（原理:裸的AM0-1帶負電，在凝膠電泳中可跑出，可被SYBRn染 色；當DGkPEG-AT 1包裹AM0-1時，AM0-1表面負電減少，在電泳中跑出的減少，若是完全被包 裹，AM0-1不能跑出加樣孔中。）
[0193] 如圖5所示:裸的AM0-1跑出了加樣孔（白色條帶），當DGkWG-AT 1 /AM0-1質量比為 2 :1時，出現(xiàn)了拖帶現(xiàn)象，說明AMO-1被材料包裹，但是還沒有完全包裹，當DGレPEG-AT1/ AM0-1質量比為8:1時，未看到AM0-1跑出加樣孔，加樣孔中也未見白色條帶，說明AM0-1被完 全包裹。當凝膠電泳跑15min時，可見裸AM0-1組的條帶基本消失(可能AM0-1已經(jīng)降解），但 2:1的孔仍可看到拖帶的白色條帶，說明材料對AM0-1有一定保護作用，可一定程度減少 AM0-1的降解。
[0194] (5)細胞毒性實驗
[01 巧]將枝化PEI(bPEI)，061^，06^?66,06^?66-41'1分別配置成6個濃度：1111旨/1111^， 500ug/mL，200ug/mL，lOOug/mL，50ug/mL，20ug/mL，將其作用于朋C2細胞，地或者化后，用 MTT法檢測其對細胞增值的影響(細胞毒性）。
[0196] 如圖6(a)和6(b)所示:隨著材料濃度和作用時間的增加，細胞活性逐漸降低。bPEI 的毒性明顯大于DGL，D化-PEG-MAL，D化-PEG-AT1。材料濃度小于1 OOug/血時，D化-PEG-MAL， D化-PEG-AT1作用的細胞活性均大于80% (毒性較?。?，材料濃度大于lOOug/mL時，對細胞毒 性明顯增加?？蛇x擇lOOug/mL作為后續(xù)治療量。
[0197] (6)細胞吞隧實驗
[0198] 驗證朋C2細胞對陽I(3.9ug/2mL)，D化-PEG(24ug/2mL)，D化-PEG-ATl(24ug/2mL) 負載AM0-1-FAM(3ug/2mL)的吞隧效果。
[0199] 如圖7(曰1)、7化1)、7(曰2)和7(曰2)所示:41，81中藍色為細胞核(04口1染色），綠色為 AM0-1-FAM，位于細胞質或者細胞核位置。激光共聚焦顯示，作用化時，PEI，D化-PEG，D化- PEG-AT1負載AM0-1-FAM組的冊C2細胞中，綠色巧光均比地時明顯增強。
[0200] 化時DGkPEG和DGkPEG-ATl組的綠色巧光較陽I組強。流式細胞檢測結果顯示結 果與之相符。
[0201] 說明，H9C2細胞對DGkPEG，DGkPEG-AT 1負載的AM0-1吞隧效果較陽I強，即D化- 陽G，DGkWG-ATl組較陽I組進入細胞的AM0-1多。
[0202] (7)活死染色實驗
[0203] 如圖8所示：紅色為死細胞化thidiumhomodimer-l染色），綠色為活細胞(Calcein AM染色）。（由于圖8中顯示，細胞化時H9C2細胞對DGkWG，D化-PEG-AT1負載的AM0-1吞隧效 果較PEI強，再根據(jù)圖7的細胞毒性實驗結果顯示PEI毒性大，推測，細胞對PEI負載的AM0-1 吞隧作用弱可能是由于PEI毒性大，為了進一步驗證運一假設，用和材料圖8中同樣的條件 下，做活死染色。）結果顯示，PEI組與06心陽6,06心陽6-41'1相比，細胞稀疏，并且紅色巧光 較綠色巧光多，據(jù)此推斷可能細胞對PEI負載的AM0-1吞隧作用弱的原因是PEI對細胞毒性 大。
[0204] (8)屯、肌原代細胞免疫巧光染色
[0205] 當屯、肌梗死（屯、肌細胞缺血缺氧）時，細胞表面的血管緊張素 Π 受體(AT1R)升高。 所W在體外化學合成AT1R的配體中的一段功能序列連接在納米材料表面，可祀向結合缺血 屯、肌的AT1R，從而對缺血屯、肌具有一定的祀向作用。
[0206] 為驗證SD大鼠原代屯、肌細胞缺血缺氧時AT1R是否升高，將原代屯、肌細胞做缺氧處 理后，進行免疫巧光染色。
[0207] 如圖9所示:紅色代表AT1R，位于細胞膜表面，藍色代表細胞核。缺氧細胞表面的紅 色巧光明顯增加，由此可進一步證實缺氧的SD大鼠原代屯、肌細胞的AT1R升高。
[0208] (9)原代屯、肌細胞水平治療實驗
[0209] 用 PEI(3.9ug/2mL)，D化-PEG(24ug/2mL)，D化-PEG-ATl(24ug/2mL)負載 AM0-1 (3ug/2mL)與缺氧的SD大鼠原代屯、肌細胞（1 % 〇2，24h，低糖DMEM)共培養(yǎng)4h后，在正常條件 下（21%〇2,低糖DMEM)培養(yǎng)2地，提取總RNA,用Real-time PCR檢測其miRNA-1的變化。
[0210] 如圖10所示:*代表口<0.05，11 = 3，如圖，缺氧細胞((3〇11化〇1)組未治療時，11111?^八-1 較正常細胞（〇〇'111曰1)組明顯升高；0化-?66,0化-?66-41'1組的11111?歴-1較缺氧細胞 (contro 1)組明顯下降(達到了治療作用），且DGL-PEG-AT1組較DGL-PEG組miRNA-1降低更明 顯（可能由于ATI對缺氧細胞的祀向性作用，使得DGkPEG-ATl負載AM0-1后，被屯、肌細胞攝 取的更多，治療作用更明顯）。然而，PEI組不僅沒有下調miRNA-1，使細胞中miRNA-1較缺氧 細胞(contro 1)組增加(可能由于其細胞毒性作用引起）。
[0別。上述實施例的變形例；
[0212] 在上述實施例中，W聚合度為123的聚賴氨酸DGL、聚乙二醇兩端修飾基為NHS和 ML為原料進行了基因載體的制備。
[0213] 在實際研發(fā)的過程中，還對上述兩種原料分別進行了替換的實驗，基于其合成的 方法與實施例二至Ξ中的方法雷同，此處不再做具體論述，具體實驗組合如下表所示：
[0214] 負載能力指納米基材與AM0-1的質量比；
[0別引毒性評分為0-10分，從陽1為10分，DGkWG-ATl為1分；
[0216] 細胞吞隧評分為0-10分，W陽I為1分，DGkWG-ATl為10分；
[0217] 治療效果評分為0-10分，W陽I為1分，DGkWG-ATl為10分；
[021 引
[0219]從上述實施例可W看出，該祀向納米基因載體可為屯、肌缺血或者屯、肌梗死患者的 基因治療提供一定的實驗基礎。該載體可負載AM0-1，也可負載用于屯、肌缺血治療的其它基 因。
【主權項】
1. 一種納米基因材料，其特征在于:包括具有革G向性的納米基因載體； 所述納米基因載體由氨基酸聚合物、修飾性聚乙二醇、血管緊張素 Π 的功能序列多肽 制備而成； 其中，所述氨基酸聚合物和血管緊張素 Π 的功能序列多肽分別與修飾性聚乙二醇兩端 的修飾基團發(fā)生化學反應后獲得具有靶向性的納米基因載體。2. 如權利要求1所述的一種納米基因材料，其特征在于： 所述氨基酸聚合物為由賴氨酸、絲氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、纈 氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪 氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺中的一種或多種氨基酸形成的聚合物或共聚物中的一種或多種； 所述氨基酸聚合物優(yōu)選為賴氨酸和絲氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙氨 酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、半胱氨 酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺中的一種或多種氨基酸形成的共聚物;其中，賴氨酸占共聚 物的質量百分比含量大于50% ; 所述氨基酸聚合物優(yōu)選為陽離子氨基酸聚合物。3. 如權利要求1所述的一種納米基因材料，其特征在于： 所述修飾性聚乙二醇的結構如下所示：其中，m為80-500的整數(shù)； Ri為酰胺基、烯烴基、環(huán)烯烴基、帶有雙鍵的雜環(huán)基； 所述酰胺基的結構式如下所示：R3為烯烴基、環(huán)烯烴基、帶有雙鍵的雜環(huán)基； 所述烯烴基的結構式如下所示：nl和n2為0到20的整數(shù)； 所述環(huán)烯烴基的結構式如下所示： 所述帶有雙鍵的雜環(huán)基的結構式如下所示：R2為酯基；所述酯基的結構式如下所示：R4為烷基、芳基、雜環(huán)基； 所述雜環(huán)基的結構式如下所示：Rxl-2Q選自氫、烷基、烷氧基、氨基或C-Rxl-2Q為羰基； Y為氮、氧、硫； η為0-10的整數(shù)。4. 如權利要求1所述的一種納米基因材料，其特征在于： 所述氨基酸聚合物的聚合度為50-500; 所述氨基酸聚合物的的分子量為10000-100000; 所述修飾性聚乙二醇的分子量為1000-10000。5. -種納米基因材料的制備方法，其特征在于： 步驟一、配置反應物： 將氨基酸聚合物溶解于溶劑中配置成溶液Α; 將修飾性聚乙二醇溶解于溶劑中配置成溶液Β; 將血管緊張素 Π 的功能序列多肽溶解于溶劑中配置成溶液C; 步驟二、將溶液Β滴加入溶液Α中，于10-50 °C的溫度下，反應1-5小時； 步驟三、在保護氣保護的條件下，加入溶液C，于10-50°C的溫度下，反應8-24小時； 步驟四、將獲得的溶液透析24-96小時后，冷凍干燥。6. 如權利要求5所述的一種納米基因材料的制備方法，其特征在于： 所述溶劑選自磷酸緩沖鹽溶液、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、四氫呋喃、醇、醚、酯中的 一種或幾種； 所述聚賴氨酸、修飾性的聚乙二醇與血管緊張素 Π 的功能序列多肽的摩爾比為1: 2-100:1-100； 優(yōu)選地，所述聚賴氨酸、修飾性的聚乙二醇與血管緊張素 π的功能序列多肽的摩爾比 為1:2-10:2-8。7. 如權利要求5所述的一種納米基因材料的制備方法，其特征在于： 在步驟三和四之間，還設有中和步驟； 所述中和步驟為:于步驟三的溶液中加入半胱胺，于10_50°C的溫度下，反應1-5小時； 所述半胱胺的制備方法為:將半胱胺鹽酸鹽溶解于二次水中，加入有機堿震蕩混合5-20分鐘，冷卻后，采用有機溶劑萃取后，蒸除溶劑后獲得半胱胺； 所述修飾性聚乙二醇與半胱胺鹽酸鹽的摩爾比為1:50-150; 所述有機堿與半胱胺鹽酸鹽的摩爾比為1 :〇. 1-10。8. 如權利要求1-8任一所述的一種納米基因材料，其特征在于： 所述具有靶向性的納米基因載體在靜電作用下負載基因； 所述負載的過程為:將具有靶向性的納米基因載體加入基因中，吹打均勻后于30-40Γ 的條件下孵育0.5-2小時； 所述具有靶向性的納米基因載體與基因的質量比為0.01-15:1; 所述具有靶向性的納米基因載體與基因的質量比優(yōu)選為〇. 1-10:1。 所述具有靶向性的納米基因載體與基因的質量比最優(yōu)選為0.5-8:1。9. 如權利要求1-8任一所述的一種納米基因材料，其特征在于： 所述聚氨基酸為聚合度為95-135的樹枝狀聚賴氨酸； 所述修飾性聚乙二醇的分子量為1500-2500，其兩端的修飾基團分別為NHS和MAL; 所述基因為用于心肌缺血治療的基因； 所述基因優(yōu)選為反義寡核苷酸； 所述基因優(yōu)選為miRNA-1的反義寡核苷酸。10. 如權利要求1-9任一所述的一種納米基因材料，其特征在于： 所述納米基因材料為具有缺血心肌革E1向性的納米基因載體； 所述納米基因材料還可以為未連接有血管緊張素 Π 的功能序列多肽的納米基因載體。
【文檔編號】A61K48/00GK105920618SQ201610420617
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月13日
【發(fā)明人】何斌, 石學銀, 薛曉梅, 董海青, 李永勇
【申請人】上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院